Name: 在重大疾病的小鼠模型中使用中心静脉导管的流体，药物和营养管理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解在重大疾病小鼠模型中使用中心静脉导管进行液体、药物和营养管理的方法。该技术结合盲肠结扎穿刺术建立脓毒症模型，为重症监护医学研究提供可重复的实验框架。

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GVdB 通过鲁汶大学（KU Leuven）获得由佛兰德政府资助的梅瑟林计划（Methusalem Program）提供的长期结构性科研支持（项目编号：METH08/07），并持有欧洲研究理事会高级资助（ERC Advanced Grant，项目编号：AdvG-2012-321670），该资助来自欧盟第七框架计划“思想”项目。SET 获得了佛兰德研究基金会（FWO）的研究助理奖学金。

该方案已获得鲁汶大学动物研究伦理审查委员会的批准。
1. 静脉通路的准备
<ol>
	<li>通过将60 cm长的微细尼龙管（MRE）中段迅速浸入高温（> 220 °C）芝麻油中，制备静脉导管的尖端。随后轻轻拉伸管子的中段，使两端相互远离，从而形成窄径部分（外径（OD）< 0.5 mm）。</li>
	<li>使用手术刀片将导管切割成两段，每段30 cm（见图1、表1）。</li>
	<li>使用聚乙烯PE50连接头将MRE导管连接至PE10聚乙烯导管，并将该PE10导管连接至旋转接头的下部。将旋转接头的上部连接至另一段PE10导管，并通过PE50连接头导管将其连接至鲁尔接头短针，具体如图1所示。</li>
	<li>在所有连接处涂抹强效快干胶水，并通过吹入空气检测导管是否泄漏。使用前对导管进行气体灭菌。</li>
</ol>
<img alt="导管插入过程示意图，显示导管、导丝、导引器及连接端口。" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 静脉通路的建立 静脉导管通过将 MRE 管拉伸至较小直径并连接制备而成 通过 将聚乙烯管连接至啮齿类动物旋转装置。参见 表1 有关各部分长度的说明，请参阅相关指南。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>图例</td>
			<td>长度</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1) 鲁尔接头钝针 22 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) PE50 – 聚乙烯管 .023" x .038"</td>
			<td>5 cm</td>
			<td>13 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3) PE10 – 聚乙烯管 .011" x .024” </td>
			<td>50 cm</td>
			<td>30 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4) 啮齿类动物旋转接头 20 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5) PE-10 </td>
			<td>15 cm</td>
			<td>9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6) PE-50 (连接器)</td>
			<td>5 cm</td>
			<td>13 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7) MRE025 拉伸尖端微肾导管 .025" x .012"</td>
			<td>30 cm</td>
			<td>27 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td>105 cm</td>
			<td>92 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：静脉通路的构建。 本表为图1提供图例说明。
2. 麻醉与术前处理
<ol>
	<li>使用24周龄的雄性C57BL/6J小鼠（27–32 g）。 
	注意：我们选用24周龄的小鼠（成年晚期），因为该年龄更接近重症监护患者的平均年龄。仅使用雄性小鼠以避免雌激素的周期性影响。如有需要，该技术也可用于较年轻的动物（已在16周龄小鼠中测试）和雌性小鼠。</li>
	<li>使用前对所有手术器械进行灭菌。用生理盐水冲洗自制的静脉导管，以排除任何气泡，并检测导管是否通畅及是否存在潜在泄漏。</li>
	<li>取一根80 cm长、直径为0.8 mm的金属丝，对折后形成环状。将3颗珠子穿入对折的金属丝并移至环端。通过将导管尖端穿过这3颗珠子，将导管固定在金属丝上。 
	注意：金属连接丝对于连接导管的旋转装置（swivel）的自由旋转至关重要，从而使小鼠能够自由活动，而不会阻塞静脉通路。</li>
	<li>通过腹腔注射（IP）给予0.03 mL氯胺酮（100 mg/kg）和0.02 mL赛拉嗪（13 mg/kg）混合物以麻醉小鼠。通过检查反射是否消失来确认麻醉是否充分。用镊子轻轻将小鼠舌头拉出，以防舌后坠导致窒息。 
	注意：若10分钟后小鼠仍试图回缩肢体，可追加0.01 mL氯胺酮作为推注剂量。</li>
	<li>剃除手术区域的毛发，包括腹部、颈部腹侧（下颌、胸骨与锁骨之间的三角区）以及头部基底背部肩胛之间区域。</li>
	<li>将小鼠俯卧于预热的加热垫上，用70%乙醇消毒皮肤，并涂抹少量眼用润滑剂以防止眼睛干燥。在手术部位（腹部、颈前部和背部）浸润0.2 mL罗哌卡因（0.67 mg/kg）。</li>
	<li>小鼠仍保持俯卧位时，用手术刀或剪刀在头背部基底处做一小切口。暴露颈后部肌肉，并用3.0尼龙线穿过肌肉下方，将其结扎固定于连接金属丝的环上。</li>
	<li>将小鼠置于右侧卧位。用手术刀或剪刀在颈部腹侧皮肤做一小的纵向切口。在直视下，将18号针头经皮下从该腹侧切口穿至先前在背部所做切口，然后将导管经针头引导穿过，使其从腹侧穿出。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置。用一根3.0尼龙线穿过小鼠上门齿后方，并用胶带将其固定在加热垫上。将头部固定于面罩中以供给氧气（2 L/min）。通过胶带固定尾巴和双前肢，使小鼠保持伸展状态。 
	注意：若氯胺酮-赛拉嗪麻醉效果不足，可在手术期间同时吸入异氟烷（0.5–1.5%）进行辅助麻醉。</li>
</ol>
3. 植入慢性留置导管
<ol>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下。在颈部腹侧先前做好的切口处，用镊子轻轻分离脂肪组织和腺体，直至可观察到颈静脉。</li>
	<li>用钝性分离法将颈静脉从血管上方及周围的结缔组织和皮下组织中游离出来：将镊子尖端插入静脉与结缔组织之间，沿静脉走向反复开合镊子，以避免损伤静脉。</li>
	<li>用钝头镊子从下方托起颈静脉，将三段3.0丝线从静脉下方穿过；将其中一段置于颈静脉分叉近端（头侧结扎线），另一段靠近胸锁乳突肌（尾侧结扎线）。收紧头侧和尾侧结扎线以拉直静脉，并在插入导管时防止大量出血。用中间的丝线打一个松结，以便后续方便固定导管。</li>
	<li>使用显微剪刀，在头侧与尾侧结扎线之间的静脉壁上沿纵轴剪开一个足够大的切口，以允许导管通过。用镊子夹住导管，将其插入静脉内11 mm。用中间结扎线轻轻打结，初步固定导管，并通过注入无菌生理盐水轻轻冲洗，确认导管位置正确。</li>
	<li>通过牢固结扎中间和尾侧结扎线，将导管固定在静脉周围。将尾侧和中间结扎线的线头打结固定，以确保导管稳固。每次打结后均应冲洗导管，确保结扎未造成静脉阻塞。最后，将尾侧与头侧结扎线打结固定。使用5.0丝线缝合皮肤切口。</li>
</ol>
4. 盲肠结扎与穿刺
<ol>
	<li>使用手术刀或剪刀在腹部下半部的皮肤上做一个1 cm的正中切口；注意不要穿透进入腹膜腔。</li>
	<li>辨认腹壁肌肉的白线，做肌间切口以进入腹膜腔。找到盲肠，使用钝性解剖镊分离盲肠并将其外置。</li>
	<li>用3.0丝线在盲肠长度50%处结扎。确保不要结扎回盲瓣，以维持肠道连续性。</li>
	<li>使用18号针头在结扎处与盲肠尖端之间的中点处对盲肠进行一次贯穿穿刺。拔出针头后，从穿刺孔挤出少量粪便以确保通畅。</li>
	<li>将肠管复位至腹腔内，用5.0丝线缝合腹膜和皮肤。 
	注：通常情况下，一名新学员需要操作10至15只动物，才能在45分钟内熟练完成静脉导管置入和CLP手术。经过训练后，麻醉/手术相关死亡率预计为10%。</li>
</ol>
5. 术后治疗与液体复苏
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位，并用胶带将导管固定在固定金属丝上。将小鼠转移至独立笼具中。使用带有可调节夹子的支架，将旋转接头装置固定在小鼠上方25 cm处，并用胶带将金属固定丝的自由端牢固地固定在旋转接头的旋转点上。</li>
	<li>将装有平衡胶体与晶体混合液（1:4）的注射器连接至静脉管路，开始液体复苏。</li>
	<li>将笼具置于温度可控（27 °C）的动物饲养柜中，保持12小时光照与12小时黑暗的循环周期，并通过精确控制的注射泵开始静脉液体复苏（10 mL/kg/h）。提供笼内丰富化设施，如筑巢材料和木块。</li>
</ol>
6. 重症监护
<ol>
	<li>术后6小时，皮下注射镇痛药物和抗生素（0.3 mL丁丙诺啡（0.15 mg/kg）和0.2 mL亚胺培南（16.67 mg/kg））。注意：根据标准实验动物医学实践，首次镇痛给药应在初次手术切口前进行，后续给药应遵循机构兽医政策指导。皮下注射应准确注入皮下间隙。</li>
	<li>在进行20–24小时液体复苏后，以全肠外营养（6.67 mL/kg/h）替代晶体液/胶体液。 
	注意：所给予的全肠外营养（5.8 kcal/24 h）可满足小鼠每日热量需求的约40%，与重症监护病房患者早期热量摄入水平相似。</li>
	<li>在整个危重病期间，每12小时皮下注射一次镇痛药物和抗生素（0.6 mL丁丙诺啡（0.3 mg/kg）和0.2 mL亚胺培南（16.67 mg/kg））。</li>
	<li>白天至少每3小时检查动物一次。根据经验证的小鼠面部表情疼痛评分量表11评估其痛苦程度，并对疼痛评分较高的动物加强监测。</li>
</ol>
7. 实验结束
注意：应向当地动物研究机构伦理审查委员会咨询该模型的严重程度分级、指导意见以及人道终点的相关政策，并获得其批准。
注意：如果静脉通路功能异常，例如导管堵塞、导管移位或注射泵出现问题，则该动物将被排除在研究之外并实施安乐死。
<ol>
	<li>实验周期结束时，使用 0.03 mL 氯胺酮（100 mg/kg）和 0.02 mL 赛拉嗪（13 mg/kg）混合物对小鼠进行深度麻醉。通过心脏穿刺放血处死小鼠。将目标组织样本迅速冷冻，并于 -80 °C 保存。</li>
</ol>

<ol><li>Angus, D. C., van der Poll, T. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1208623">Severe sepsis and septic shock.</a> N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).</li>
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<li>Langford DJ1, B. A., Chanda, M. L., Clarke, S. E., Drummond, T. E., Echols, S., Glick, S., Ingrao, J., Klassen-Ross, T., Lacroix-Fralish, M. L., Matsumiya, L., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wong, D., van den Maagdenberg, A. M., Ferrari, M. D., Craig, K. D., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+facial+expressions+of+pain+in+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse.</a> Nat Methods. 7, (2010).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+hyperdynamic+murine+model+of+resuscitated+sepsis+using+echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of a hyperdynamic murine model of resuscitated sepsis using echocardiography.</a> Am J Respir Crit Care Med. 164 (5), 891-895 (2001).</li>
<li>Heuer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture+with+total+parenteral+nutrition%3A+a+clinically+relevant+model+of+the+metabolic%2C+hormonal%2C+and+inflammatory+dysfunction+associated+with+critical+illness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness.</a> J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).</li>
<li>Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+and+quality+of+life+of+elderly+patients+after+intensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med+Wkly%22%5BJournal%5D)">Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care.</a> Swiss Med Wkly. 142, (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们通过结合盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症，并使用中心静脉导管给予液体、药物和营养物质，建立了一种更具临床相关性的重症疾病小鼠模型。该实验方案可重复性强，能够用于研究重症疾病的长期阶段，并产生稳定的死亡率，从而模拟人类临床情况1。
盲肠结扎穿刺已被广泛认可为一种急性危重症的动物模型，能够再现脓毒症的主要特征6,7。然而，该急性危重症模型无法用于研究非缓解性多器官功能衰竭、肌肉消耗以及内分泌和代谢改变，而这些正是危重症 prolonged 阶段的典型表现。此外，该模型的临床前研究结果往往难以转化为临床实际应用8,9,10。因此，我们建立了一种模型，通过置入中心静脉导管，使研究者能够实施充分的液体复苏、药物给药和全肠外营养。这些支持性治疗措施对...

危重症是一种疾病状态，在此状态下，一个或多个器官系统的功能受到严重损害，若不进行强化医疗支持，患者将面临死亡。尽管入住重症监护室（ICU）的初始病因各异，可包括创伤、复杂手术、烧伤、疾病急性加重及脓毒症等，但所有危重症患者均存在由低灌注、缺氧和过度炎症等因素引起的细胞损伤，进而导致器官功能衰竭。大多数患者能够度过急性期，但仍有相当一部分患者无法立即康复，需要长期重症监护。这些患者因持续存在的多器官功能衰竭而面临较高的死亡风险。此外，危重症的 prolonged 阶段以显著的肌肉无力以及内分泌和代谢改变为主要特征。&#160; 其发病机制目前尚未完全阐明。
目前在重症监护研究中使用了多种啮齿类动物模型。其中应用最广泛的两种模型是外源性给予脂多糖（LPS）和盲肠结扎穿刺（CLP）。这两种模型均旨在模拟脓毒症的急性期，脓毒症被定义为由宿主对感染的失调反应所引起的危及生命的器官功能障碍，是全球重症监护病房（ICU）收治的主要原因之一1,2。LPS模型存在若干缺点，因为它仅短暂影响细胞因子的释放以及动物的血流动力学状态3。与人类不同，啮齿类动物对内毒素具有较强耐受性，因此需要使用“高剂量”内毒素才能诱导低血压和死亡率，这进一步引发了对该方法有效性的质疑4,5。另一种模型即盲肠结扎穿刺模型（CLP），其操作包括结扎部分盲肠，随后用针头贯穿穿刺。该操作可导致多微生物性腹腔感染并伴随组织损伤，继而引发细菌向血液系统的移位。这将触发全身性炎症反应并发展为脓毒症。CLP模型已被广泛认可为一种能够再现脓毒症主要特征的急性重症动物模型，这些特征包括过度炎症、血管扩张、低血压和心输出量增加6,7。然而，该模型无法用于研究非缓解性多器官功能衰竭、肌肉消耗以及内分泌和代谢改变，而这些正是重症疾病 prolonged 阶段的典型表现。此外，近年来重症疾病小鼠模型的有效性受到质疑，因为小鼠模型的研究结果并不总能转化为人类临床情境8,9,10。一个可能的解释是，重症人类患者所接受的支持性治疗与重症小鼠所接受的治疗存在显著差异。
因此，为了更贴近人类临床情况，并允许对危重病的长期阶段进行研究，我们建立了一种小鼠模型，模拟人类接受的急性重症监护治疗，例如大量静脉输液和抗生素治疗，同时允许实施支持性治疗措施以帮助小鼠度过危重病的长期阶段，例如营养支持。为此，我们改进了盲肠结扎穿刺（CLP）诱导脓毒症的小鼠模型——该模型是脓毒症研究的金标准，并植入中心静脉导管，以便输注液体、营养物质和药物。

<table><tbody><tr><td>布托啡诺</td><td>Ecuphar</td><td></td><td>Vetergesic 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6&amp;nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>胶体</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr><tr><td>晶体溶液</td><td>巴克斯特</td><td></td><td>Plasmalyte A Viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>亚胺培南</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&amp;nbsp;注射用粉末，每瓶含活性成分 mg</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Eurovet</td><td></td><td>异-戊</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Nimatek 100 mg/mL</td></tr><tr><td>LocTite 超级胶水3 塑料专用&amp;nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025&quot; O.D. × 0.012&quot; I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>巴克斯特</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - 聚乙烯 .011&quot; x .024&quot;&amp;nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 导管 .023&quot; x.038&quot;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物旋转连接器 20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>罗哌卡因&amp;iuml;ne</td><td>阿斯利康</td><td></td><td>Naropin 2&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>VMD</td><td></td><td>盐酸赛拉嗪 2%</td></tr></tbody></table>

在重症小鼠模型中利用中心静脉置管进行液体、药物和营养输注

Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

本方案描述了一种用于模拟长期危重症的中心静脉置管小鼠模型。我们结合盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症，并通过中心静脉导管给予液体、药物和营养支持，以模拟人类临床情况。危重症患者需要强化的医疗支持才能存活。尽管大多数患者可在数日内恢复，但约有四分之一的患者需要长期重症监护，并面临因持续性多器官功能衰竭而死亡的高风险。此外，危重症的长期阶段以显著的肌肉无力以及内分泌和代谢改变为特征，其发病机制目前尚未完全阐明。危重症研究中最常用的动物模型是通过盲肠结扎穿刺诱导脓毒症的模型。该模型具有高度可重复性，其急性炎症和血流动力学变化与人类脓毒症相似，适用于研究危重症的急性期。然而，该模型具有高致死率，这与人类临床实际情况不同，且未被设计用于研究危重症的长期阶段。因此，我们对该技术进行了改进，在颈静脉中置入中心静脉导管，从而能够实施临床相关的支持性治疗，以更真实地模拟人类危重症的临床状况。该小鼠模型需要复杂的外科手术操作以及对动物每日进行强化护理，但最终可建立一个适用于研究危重症急性期和长期阶段的合理模型。

采用上述方法使 C57BL/6 小鼠处于危重状态。我们进行了两项实验，以评估盲肠结扎穿刺（CLP）后两个时间点的存活情况：CLP 后第 5 天（n = 15）和第 7 天（n = 22）的存活率。两项实验的生存曲线在第 5 天之前的比较中无显著差异，表明实验设置具有可重复性。未存活动物被发现死亡或因达到人道终点而被实施安乐死。如前所述，对 50% 盲肠进行结扎，并结合抗生素治疗、液体复苏以及通过颈静脉导管进行全肠外营养支持，导致危重状态持续 1 天后的死亡率为 13%，3 天后为 24%，5 天后为 27–31%，7 天后为 36%。健康对照组小鼠通过配对喂养方式限制热量摄入，使其营养摄入量与危重小鼠相同，该组未出现任何死亡。
<img alt="Kaplan-Meier生存曲线，时间与累积生存率，数据分析，线形图" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig2.jpg" data-altupdatedat="17882...

本方案描述了一种用于模拟长期危重症的中心静脉插管小鼠模型。我们结合盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症，并通过中心静脉导管给予液体、药物和营养物质，以模拟人类临床环境。

本方案描述了一种用于长期重症疾病的中心静脉置管小鼠模型。我们结合盲肠结扎穿刺法以诱导……

本研究采用中心分类的小鼠盲肠结扎穿刺（CLP）方法，其总体目标是建立一种可重复的、伴随重症监护措施的持续性重症疾病模型，以模拟人类临床状况。该方法有助于回答重症医学领域中的关键问题，特别是关于急性及持续性重症疾病期间内分泌与代谢改变的发病机制。该技术的主要优势在于，它将标准化程度较高的CLP技术与中心静脉导管相结合，用于液体、药物和营养物质的输注。本实验操作将由本实验室的技术员Thomas Dufour进行演示。准备静脉导管末端时，将一段60厘米长的Micro-Renathane管路中段迅速浸入220摄氏度或更热的芝麻油中。轻轻拉伸管子的两端，使管子中部变细，形成较窄的中心直径，然后使用手术刀片将管子切成两段各30厘米的等长部分。接着，将管子连接至聚乙烯PE 50连接器、旋转接头和鲁尔短针，按演示方式组装成导管，并在所有连接处涂抹强效快干胶水。待胶水固化后，用空气冲洗导管以检查是否漏液。随后，从直径为0.8毫米的金属丝上截取一段80厘米长的线段，并将金属丝对折形成环状。将三颗珠子穿入环状双股金属丝中，引导已灭菌导管的尖端依次穿过这三颗珠子，从而将导管固定在金属丝上。对一只体重27至32克、24周龄的雄性c57黑六小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏无反应来确认其已进入镇静状态。使用镊子轻轻将舌头从口中拉出，以防止其吞咽舌头。接下来，剃除手术区域的毛发，然后将小鼠俯卧位放置在预热的加热垫上。用70%乙醇消毒暴露的皮肤，并涂抹少量眼用润滑剂。在手术部位浸润镇痛药物，于头部背侧基部做一小切口。暴露后颈部肌肉，并在肌肉下方穿入一段3.0尼龙线，将固定导线的环绑缚于肌肉上。接着，将小鼠置于右侧卧位，在颈部腹侧皮肤做一小的纵向切口。通过该腹侧切口，以18号针头在皮下由腹侧向背部切口方向穿行，将导管经针头内穿过后，从腹侧引出针头。将小鼠仰卧放置，用3-0尼龙缝线绕过上门齿后方并固定于加热垫上。随后，将尾巴和前肢固定于伸展位置。调节体视显微镜焦距，用镊子轻轻分离腹侧切口处的脂肪组织和腺体，直至可见颈静脉。将镊子尖端置于静脉与结缔组织之间，沿静脉走向反复张开镊子，钝性分离颈静脉与其周围的结缔组织及皮下组织。当血管被游离后，将钝头镊置于颈静脉下方，并在静脉下方穿过两段3-0丝线：一段置于颈静脉分叉处近端，用于头侧结扎；另一段靠近胸锁乳突肌，用于尾侧结扎。收紧头侧和尾侧的结扎线，以拉直静脉并防止置管时过度出血。用第三根缝线做一个松结，然后用显微剪刀在头侧与尾侧结扎线之间的静脉上做一足够大的切口，以便通过导管。用镊子将导管插入静脉内11毫米，并用中间的松结轻轻固定导管。用无菌生理盐水轻轻冲洗导管，以确认其位置正确。然后，牢固结扎尾侧和中间的结扎线。将尾侧与中间结扎线的末端打结固定，以确保导管稳固。通过每次结扎后冲洗导管，确认静脉未被结扎线阻塞。最后，结扎头侧结扎线。随后，使用5-0丝线缝合切口。进行盲肠结扎穿刺时，在腹部下半部的皮肤上沿中线做一厘米长的切口，注意不要穿透腹膜腔。在确定腹肌的白线后，进行肌间切口以进入腹膜腔。使用钝性解剖镊分离并外置盲肠。在盲肠长度的50%处，用三根0号丝线缝合结扎，注意避免缩窄回盲瓣，以保持肠道连续性。然后，使用18号针头在结扎处与盲肠尖端之间的中点位置，对盲肠进行一次贯穿性穿刺，从穿孔处挤出少量粪便，以确保拔出针头后穿孔通畅。将肠管复位至腹腔内，用5-0丝线缝合腹膜和皮肤。将小鼠保持仰卧位，将导管固定在连接导线上。然后，将小鼠置于单独的笼子中，笼内铺有筑巢材料和木块。使用带有可调节夹子的支架，将旋转装置固定在夹子中，并用胶带将金属连接线的自由端牢固地固定在旋转装置的转动点上。然后，将笼子置于温度控制在27摄氏度、光照和黑暗周期各12小时的动物培养箱中。将含有适当比例平衡胶体和晶体液的注射器连接到静脉管路中，并使用精确的注射泵以0.3毫升/小时的速度开始液体复苏。6小时后，注射镇痛剂和抗生素。一项为期五天和一项为期七天的盲肠结扎穿刺实验的生存曲线分析显示，在第五天之前，两项研究的生存率无显著差异，这凸显了实验设置的可重复性。通过颈静脉导管对盲肠进行50%结扎，并结合抗生素治疗、液体复苏和全肠外营养，可在重症疾病发生一天后实现13%的死亡率。重症疾病持续三天后的死亡率为24%，五天后的死亡率为27%至31%，七天后的死亡率为36%。然而，在健康对照组中，尽管将小鼠的热量摄入限制为与重症小鼠相同的营养摄入水平，但在两次实验中均未观察到任何死亡情况。在操作者掌握技术并完成10至15只动物的练习后，若操作规范，可在45分钟内完成导管置入和CLP手术。进行此操作时，需注意将导管小心地插入静脉。若导管插入过深进入心脏，可能引发心律失常；若插入深度不足，则导管容易被拉出。始终确认导管位于血管管腔内。若导管置入血管壁各层之间，液体将渗漏至周围组织。该模型可能需要进行 extensive 手术操作，并对动物进行每日 intensive care。但它能产生稳定且可重复的模型，可用于研究急性和长期危重病的多种方面。

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