Name: 通过放射性标记的GTP结合测量G蛋白偶联的受体信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习使用放射性标记的[35S]GTPγS结合实验来研究G蛋白偶联受体（GPCR）的药理学特性。该方法通过分离含GPCR的细胞膜，为药物开发和细胞信号传导研究提供可靠的功能性检测手段。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目 DA-000266 及医学科学家培训项目 T32 资助（C.V.、N.W.Z. 和 P.C.S.）支持。作者还感谢 somersault18:24（somersault1824.com）提供的科学图库支持 &amp;#38; 医学插图

1. 培养细胞中重组HA-MOR1的表达
注意：所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩内进行。
<ol>
	<li>使用70%乙醇对细胞培养超净台进行消毒，并在整个细胞培养过程中保持无菌操作。</li>
	<li>准备人胚肾细胞293（HEK293）细胞培养基——完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）：DMEM，pH 7.4，添加2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>在10 mL完全DMEM中，将2.5 × 106个HEK293细胞接种至10 cm组织培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合度达到70–80%（过夜）。 
	注意：为收集足够进行完整GTP结合实验的蛋白量，至少接种3个10 cm培养皿的细胞。</li>
	<li>选用合适的转染试剂，按照制造商说明书将HA-MOR1质粒转染入细胞，并继续培养36–48小时。 
	注意：人MOR-1 cDNA（NCBI参考序列号：NM_000914.4）由Gavril Pasternak惠赠，并已克隆至pCMV-HA载体中。</li>
</ol>
2. 细胞分级分离与膜组分收集
<ol>
	<li>配制以下裂解缓冲液：
	<ol>
		<li>缓冲液1：10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4；1 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）；10% 蔗糖；蛋白酶抑制剂混合物；以及 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。DTT 需在膜分离当天新鲜加入。</li>
		<li>缓冲液2：10 mM HEPES，pH 7.4；1 mM EGTA；1 mM MgCl2；以及 1 mM DTT。DTT 需在膜分离当天新鲜加入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养箱中取出转染后的细胞（步骤1.4），吸除培养基，并用5 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。吸除PBS及多余液体。</li>
	<li>向细胞中加入600 µL 缓冲液1。使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮下，并用移液器将细胞悬液转移至1.6 mL 微量离心管中。</li>
	<li>立即将微量离心管在液氮中速冻。待样品完全冻结后，置于冰上解冻，或转移至-80 °C长期保存。</li>
	<li>对所有培养皿中的细胞重复步骤2.3和2.4。</li>
	<li>待裂解液解冻后，使用单脉冲微型管匀浆器裂解细胞。每次脉冲持续10秒，共进行3–5次，每次脉冲之间将离心管放回冰上冷却30秒。
	<ol>
		<li>取20 µL作为全细胞组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将剩余样品在4 °C下以1,000 × g离心10分钟。收集上清液，转移至新的1.6 mL微量离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>将沉淀物用100 µL 缓冲液1重悬，并用研杵再次匀浆。每次脉冲持续5秒，共进行3–5次，每次脉冲之间将离心管放回冰上冷却30秒。
	<ol>
		<li>再次在4 °C下以1,000 × g离心10分钟。将此次上清液与步骤2.7所得上清液合并。 
		注意：剩余沉淀物含有核蛋白和膜蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将合并后的上清液在4 °C下以11,000 × g离心20分钟。将上清液（即胞质组分）转移至新的1.6 mL微量离心管中。</li>
	<li>将沉淀物用200 µL 缓冲液2重悬。通过吹打3–5次使沉淀物匀浆。在4 °C下以21,100 × g离心20分钟。吸除上清液。将含有粗膜组分的沉淀物用50 µL 缓冲液2重悬。</li>
	<li>立即进行后续GTPγS结合实验（第3节），或在液氮中速冻后于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. [35S]GTPγS 结合实验
注意：操作 [35S]GTPγS 及进行 [35S]GTPγS 结合实验时，须采用标准放射性化学安全规程。始终佩戴防护手套和实验服。检查包装材料是否有泄漏或裂纹。废弃物和过量试剂应根据机构规定进行处置。
<ol>
	<li>通过将50 mM HEPES（pH 7.4）、5 mM MgCl₂、100 mM NaCl 和 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于蒸馏水中，配制不完全结合缓冲液（IBB）。</li>
	<li>稀释储备液 [35将S]GTPγS用10 mM Tris-HCl（pH 7.6）和10 mM DTT配制成50 nM溶液。分装为500 µL每份，于-80 °C保存。实验开始前仅使用 freshly thawed 的分装样品，并在冰上解冻。</li>
	<li>将1 mg GTPγS粉末溶于177.62 µL纯水中，配制成10 mM的非放射性标记GTPγS储备液。分装为每份10 µL，于-20 °C保存。</li>
	<li>通过向IBB中添加以下成分，制备完全结合缓冲液（CBB）：终浓度为1 mM DTT、0.1%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）、10 µM GDP和0.1 nM [35S]GTPγS 
	注意：CBB 现已含有放射性标记的 GTP。操作放射性溶液时应采取适当的安全防护措施。</li>
	<li>将步骤 2.11 中的膜组分在冰上解冻。</li>
	<li>使用分光光度计在595 nm波长下，通过Bradford蛋白测定法定量膜组分的蛋白浓度。
	<ol>
		<li>用缓冲液2配制BSA蛋白标准品的系列稀释液，终浓度分别为0、250、500、750、1,500、2,500和5,000 µg/mL。</li>
		<li>向比色皿中的1 mL Bradford试剂分别加入2 µL每种标准品或膜样品，充分涡旋混匀。</li>
		<li>将分光光度计波长调至595 nm，使用含0 µg/mL蛋白质的比色皿进行空白校正。</li>
		<li>等待5分钟，然后在595 nm波长下读取各标准品和各样品的吸光值。</li>
		<li>绘制标准品的吸光度与浓度的关系曲线。根据比尔-朗伯定律（A = εcl，其中ε为消光系数，l为比色皿光程，c为浓度），计算膜样品的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将膜组分用IBB缓冲液稀释至蛋白质浓度为100 µg/mL。 
	注意：一个10 cm培养皿的HEK293细胞通常可收获1 &amp;#38; 3 mg 蛋白质/mL</li>
	<li>在各个1.6 mL微量离心管中分别准备以下实验条件：配体梯度稀释系列、用于测量基础GTP结合的基础活性条件，以及用于测量非特异性GTP结合的非特异性结合条件。
	<ol>
		<li>对于配体稀释系列，将目标配体用CBB稀释至终体积为100 µL，制备一系列稀释浓度。配体稀释系列的浓度应为所需终浓度的2倍。配体浓度的设置应充分覆盖响应范围。
		<ol>
			<li>为检测DAMGO通过MOR1对GTP结合的影响，用CBB配制DAMGO稀释液，浓度分别为2 mM、200 µM、20 µM、2 µM、200 nM、20 nM、2 nM、200 pM、20 pM和2 pM（终体积：100 µL）。 
			注意：例如，如果目标配体的预期 EC50 10 µM，配制200 nM、2 µM、20 µM、200 µM和2 mM的配体稀释液。这五个条件覆盖了较宽的浓度范围，且均为检测所需浓度的2倍。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用于基础结合，准备一个含有100 µL CBB的离心管。</li>
		<li>为消除非特异性结合，准备一个含有99 µL CBB并添加1 µL 2 mM非放射性标记GTPγS的离心管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每种实验条件下加入100 µL稀释后的膜溶液（步骤3.7）。</li>
	<li>在1.6 mL微量离心管中，将膜与各种实验条件于25 °C孵育30分钟，使用恒温混匀仪或轨道摇床。</li>
</ol>
4. 膜过滤
<ol>
	<li>通过将50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、5 mM MgCl2 和 50 mM NaCl 溶于蒸馏水中，配制洗涤缓冲液。</li>
	<li>将玻璃纤维滤膜在水中预浸泡10分钟。 
	注意：滤膜孔径为1 µm，直径为2.1 cm，厚度为675 µm。</li>
	<li>从恒温混匀仪或轨道摇床（步骤3.10）中取出样品。短暂离心5秒，使各样品聚集于离心管底部。</li>
	<li>打开真空过滤装置的盖子。将预浸泡的滤膜放置在装置的真空口上。重新盖紧装置盖子以形成真空密封。开启真空泵。</li>
	<li>将每种200 µL实验条件下的样品用移液器转移195 µL至滤膜上，以尽量减少样品吸附在管壁和/或移液操作带来的误差。</li>
	<li>用1 mL预冷的洗涤缓冲液洗涤滤膜三次。</li>
</ol>
5. 液体闪烁计数
<ol>
	<li>将 5 mL 闪烁计数小瓶放入计数架中，向每个小瓶中加入 5 mL 闪烁液。</li>
	<li>关闭真空泵（步骤 4.4）。取下真空过滤装置的盖子，用镊子夹起过滤装置真空口处的滤膜，将每张滤膜放入单独的 5 mL 闪烁计数小瓶中。</li>
	<li>准备一个含有 195 µL CBB 的小瓶，用于测定最大信号值。</li>
	<li>将每个小瓶盖紧瓶盖，在 25 °C 下置于旋转摇床上孵育 10 分钟。</li>
	<li>打开闪烁计数器，设置仪器使用标准配套的闪烁计数程序，对每个样品的 35S 同位素发射进行 5 分钟测量。</li>
	<li>按下 &#34;开始&#34;按钮开始计数。</li>
	<li>计数完成后，将已计数的小瓶作为危险废物处理。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>将数据输入统计与分析软件。
	<ol>
		<li>从其他各测量值中减去非特异性结合，以确定特异性结合。 
		注意：非特异性结合程度由与非放射性标记的 GTPγS 孵育的样本确定（步骤 3.8.3）。</li>
		<li>打开统计与分析软件，选择一个 XY 数据集条目。</li>
		<li>输入来自[的特异性结合数据35S]GTPγS结合实验数据录入统计分析软件的数据表中。将激动剂浓度以摩尔浓度形式输入 &#34;X&#34; 柱。输入相关联的 35S 计为 &#34;Y&#34; 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转换数据。
	<ol>
		<li>点击将 X 值转换为其相应的对数值 &#34;分析。&#34; 选择 &#34;转化&#34; 来自内置分析功能。</li>
		<li>在……之内 &#34;转化&#34; 对话框中，选择 &#34;使用以下方法转换 X 值&#34; 并选择该函数 &#34;X = log(X)&#34; 选择创建结果的新图表。</li>
		<li>点击 &#34;好的。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对Y值进行归一化处理。
	<ol>
		<li>结果显示变换后，单击 &#34;分析。&#34; 选择 &#34;标准化&#34; 来自内置分析功能。</li>
		<li>在 &#34;标准化&#34; 对话框中，选择单选按钮以将 0% 定义为 &#34;每组数据中的最小值&#34; 和100%作为 &#34;每组数据中的最大值&#34; 选中该框可将结果以百分比形式显示。选中该框可创建结果的新图表。</li>
		<li>点击 &#34;好的。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对绘制的数据拟合非线性回归曲线。进行非线性回归分析。
	<ol>
		<li>归一化结果显示后，单击 &#34;分析。&#34; 从内置分析中选择 &#34;非线性回归（曲线拟合）&#34;</li>
		<li>若研究激动剂，选择 &#34;激动剂浓度对数与归一化反应关系曲线 - 变量斜率&#34; 从对话框中。</li>
		<li>若研究拮抗剂， &#34;选择 log(拮抗剂) 与归一化反应曲线 - 变量斜率&#34; 从对话框中。</li>
		<li>点击 &#34;好的。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查图表和结果，确保拟合曲线与数据具有合理的吻合性。确认回归曲线与所绘制数据的整体趋势一致，且残差不过大，以免导致剂量-反应曲线趋于平坦。 
	注意：该软件将汇总非线性回归的结果，并提供引发半最大反应的浓度（EC50)，希尔系数（nH）和半数抑制浓度（IC50).</li>
	<li>推导激动剂/拮抗剂参数效价。
	<ol>
		<li>推导激动剂的平衡解离常数（Kb) 来自以下任一实验16,17,18
		<ol>
			<li>评估激动剂在与固定浓度拮抗剂竞争时剂量-反应曲线的偏移。此处，EC50' = EC50 (1 + [拮抗剂]/拮抗剂Kb），其中 EC50“是向右偏移的EC”50.</li>
			<li>评估 [35S]GTPγS结合实验中，使用不同浓度的拮抗剂与固定浓度的激动剂进行竞争。此处，Kb = IC50/ (2 + ([激动剂]/激动剂 EC50)n)1/n - 1，其中 n 为激动剂的 Hill 系数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据数据的变异性，每种配体重复实验（步骤 3.8-5.6）约 3 至 5 次，并使用统计分析软件对结果进行平均处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本实验方案描述了两种独立但互补的方法：一种是将细胞和组织简单地分离为若干宽泛但明确的组分，另一种是通过检测[35S]GTPγS结合来研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路。
高效的细胞组分分离在多种应用中具有重要意义，包括蛋白质的提取与富集、蛋白质亚细胞定位的评估，以及受体药理学的研究。尽管存在其他用于细胞和组织分馏的方法，但本文所介绍的方案相对更经济、快速且操作简便。然而需要注意的是，与一些更成熟的方法不同，该方法无法将质膜相关蛋白与其他膜性区室（如内体或内质网）中的蛋白清晰分离。还必须指出的是，尽管上述方案采用瞬时过表达系统来制备含有目标G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞膜，但该方案同样适用于稳定过表达系统，以及动物或人体组织19。
样品制备对于最大限度提高组分得率和纯度至关重要。确保充分匀浆以及尽量缩短离心步骤之间的转移时间尤为关键。使用研磨杵或匀浆器彻底破坏细胞膜，可显著提高最终细胞组分中的粗膜得率。如果膜得率过低，最简单的两种解决方法是扩大初始细胞培...

G蛋白偶联受体&#160;(GPCRs)&#160;是一类庞大的细胞表面受体家族，介导多种生理过程，包括镇痛、嗅觉和行为调控1。GPCRs通过感知特定的胞外信号，进而激活细胞内信号通路，在细胞外环境与内环境之间发挥关键的桥梁作用。由于GPCRs在生物学中的重要作用，它们已成为基础研究和药物研发的主要靶点2,3。
与其他结合特定配体的受体家族不同，G蛋白偶联受体（GPCRs）能够结合多种不同类型的分子。一种GPCR可能与肽类相互作用，而另一种则可能感知光子、小分子或离子1,4。尽管其配体具有多样性，但GPCRs在整体结构和功能上具有共性。单个GPCR由七个α-螺旋跨膜蛋白组成，具有胞外的氨基末端和胞内的羧基末端5,6。GPCRs与胞内的G蛋白——由α、β和γ亚基组成的异源三聚体蛋白复合物——相偶联，从而介导多种信号通路7。Gα亚基是一种鸟苷酸结合蛋白，当其与二磷酸鸟苷（GDP）结合时处于非活性状态，而与三磷酸鸟苷（GTP）结合时则被激活8,9。当GPCRs与其配体结合后，会发生构象变化，促使Gα从Gβγ上解离，从而使Gα将GDP交换为GTP7。受体自身的羧基末端可被多种丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化10,11，并发生内化以减弱受体信号传导12,13,14。与此同时，被激活的Gα单体和Gβγ二聚体进一步激活不同的信号通路7。每种G蛋白亚基均有多个同工型，且每种同工型靶向特定的下游通路和第二信使系统。主要的Gα同工型包括Gs、Gq、Gi/o和G12-13。通常，单个GPCR会与特定的Gα同工型相偶联，从而将外部刺激与特定的细胞反应联系起来1。
表征G蛋白偶联受体（GPCR）与配体的相互作用对于理解该受体的生物学功能至关重要。由于GDP/GTP交换是配体结合后最早发生的事件之一，监测GTP结合可用来衡量GPCR的激活或抑制状态。检测GPCR信号通路中更下游的事件通常定量性较差、不符合化学计量关系，难以区分完全激动剂与部分激动剂，且可能需要昂贵的试剂。此外，Gα蛋白GTP结合增加几乎是所有GPCR激活后的普遍事件，这意味着GTP结合检测是一种广泛适用于监测大多数GPCR活性的实验方法。测量GTP结合是一种简单快速的方法，可用于检测过表达目标受体的细胞或天然组织中GPCR的信号传导。本实验方案详细描述了一种功能性GTP结合检测方法，采用典型的G蛋白偶联受体——μ-阿片受体（MOR1），以定量测定激动剂和拮抗剂对GPCR信号通路的影响。
本方案首先概述了如何从过表达MOR1的细胞中分离粗制膜。需要注意的是，该方案不仅限于过表达系统，也可应用于多种膜来源，包括天然组织或表达多种受体和G蛋白的制备物15。随后，方案详细描述了如何测定在不同浓度的[D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-脑啡肽（DAMGO）或纳洛酮（分别为MOR1激动剂和拮抗剂）刺激下，放射性标记的GTP类似物与这些膜的结合情况。所使用的GTP类似物为[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS），其不可被水解。这一特性至关重要，因为Gα亚基具有内在的GTP酶活性7，若使用可水解的放射性GTP化合物，其标记的γ-磷酸基团将被降解。随后将膜样品截留在玻璃纤维滤膜上并进行洗涤，再通过液体闪烁计数法对放射性标记的GTP进行定量。通过该实验可获得多个药理学参数，用于表征受体-配体相互作用，包括激动剂的半最大效应浓度（EC50）和Hill系数（nH），以及拮抗剂的半最大抑制浓度（IC50）和平衡解离常数（Kb）16,17,18。

<table><tbody><tr><td>DMEM，高葡萄糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313021</td><td>使用前在 37&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>使用前在 37&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>使用前在 37&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>使用前在 37&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>使用前在 37&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>细胞培养用 10 cm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>1.6 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷（Trizma base）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双（&amp;beta;-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA 片剂，Mini，EASYpack 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-1</td><td></td></tr><tr><td>研磨杵电动装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359971</td><td></td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Bel Art</td><td>F19923-0001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]鸟苷-5&amp;rsquo;-O-(3-硫代)三磷酸（[&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]GTP&amp;gamma;S）&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG030H</td><td></td></tr><tr><td>非放射性标记的鸟苷-5&amp;rsquo;-O-(3-硫代)三磷酸（GTP&amp;gamma;S）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89378</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷二磷酸（GDP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51060</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU640</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计比色皿</td><td>USA Scientific</td><td>9090-0460</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>温控混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>535027903</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维滤膜&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1821-021</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤装置</td><td>Millipore Corporation</td><td>XX2702550</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>65717</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液&amp;nbsp;</td><td>Ecoscint A</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数用小瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>592690</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶瓶盖</td><td>Beckman Coulter</td><td>592928</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>PRISM 6</td><td></td></tr><tr><td>ATP1A1 抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma</td><td>a6F</td><td>以 3% BSA 按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>CB1001</td><td>以 3% BSA 按 1:5000 稀释</td></tr><tr><td>H2B 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2934S</td><td>以 3% BSA 按 1:2500 稀释</td></tr><tr><td>PDI 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>3501S</td><td>以 3% BSA 按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>HA 抗体</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>以 3% BSA 按 1:2000 稀释</td></tr></tbody></table>

通过放射性标记gtp结合测量g蛋白偶联受体信号传导

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类重要的跨膜受体家族，在正常细胞生理过程中发挥关键作用，并作为多种疾病治疗的药理学靶点，包括镇痛、血压调节以及精神类疾病的治疗。当配体结合后，GPCRs通过促进鸟苷三磷酸（GTP）的结合，催化细胞内G蛋白的活化。活化的G蛋白进一步激活下游信号通路，从而引发细胞反应。GPCR信号传导可通过检测一种放射性标记且不可水解的GTP类似物——[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）——在G蛋白中的结合情况来进行监测。与其他检测更下游信号事件的方法不同，[35S]GTPγS结合实验检测的是GPCR信号通路中较为早期的直接事件，且尤为重要的是，能够区分激动剂、拮抗剂和反向激动剂。本实验方案介绍了一种灵敏且特异的方法，利用典型的G蛋白偶联受体——μ-阿片受体（MOR1）的粗制膜制备物来研究GPCR信号传导。尽管存在其他用于细胞和组织分级分离的方法，但许多方法成本高昂、操作繁琐，和/或需要非标准的实验设备。本方法提供了一种简便的流程，可富集具有功能活性的粗制膜。在分离获得MOR1后，进一步测定了其激动剂[D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-脑啡肽（DAMGO）和拮抗剂纳洛酮的多种药理学特性。

细胞分级分离可用于从胞质和核蛋白中分离并富集膜结合蛋白。 图1 是一张 Western 印迹图，展示了在亚细胞分级分离过程中可收集的三种主要组分的内容。具体而言， 图1 表明分级分离可有效分离膜蛋白（即 Na+/K+ ATP酶、蛋白二硫键异构酶（PDI）和HA-MOR1）分别来自组蛋白H2B、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核蛋白和胞质蛋白。此外， 图1 展示了通过分级分离后，各自亚细胞组分中蛋白质的富集情况（第1泳道与第4泳道相比）。代表性Ponceau染色显示各组分中蛋白质上样量均等。需要注意的是，该分级分离方案无法区分不同的细胞膜结构。PDI通常定位于内质网（ER），而Na+/K+ATPase主要存在于质膜。然而，这两种蛋白质均存在于最终的粗膜组分中图1，第4泳道）。此外，本方案能够有效分离核蛋白与胞质及最...

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类重要的跨膜受体家族，在正常细胞生理过程中发挥关键作用，并构成……

本实验的总体目标是分离含有G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞膜，并利用功能性GTP结合实验研究GPCR的药理学特性。该方法有助于解答生物化学领域中关于已知或孤儿G蛋白偶联受体药理学特性的关键问题。该方法的主要优点在于操作简便、快速，并且能够检测G蛋白偶联受体信号通路中最初始的事件。首先，将人胚胎肾细胞以 10 毫升完全 DMEM 培养基接种至 10 厘米组织培养皿中。在 37°C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞，直至细胞融合度达到 70% 至 80%。培养完成后，根据制造商说明书，使用适当的转染试剂将 HAMOR1 转染至细胞中。随后，将细胞按先前所述条件孵育 36 至 48 小时。从培养箱中取出转染后的细胞后，吸除培养基，并用 5 毫升冰冻 PBS 清洗细胞。然后，吸除 PBS 及多余的液体。接下来，向细胞中加入 600 微升缓冲液 1。使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮下，并用移液器将细胞悬液转移至 1.6 毫升微量离心管中。立即在液氮中快速冷冻该微量离心管。样品冷冻后，置于冰上解冻裂解液。待裂解液完全解冻后，使用单次脉冲微型管匀浆器破碎细胞，以每次10秒的速度脉冲3至5次。每次脉冲之间将离心管置于冰上30秒。随后，在4°C条件下以1,000 × g离心10分钟。然后，将上清液转移至冰上预冷的新的1.6毫升微量离心管中。将腭组织重新悬浮于100微升缓冲液1中。重新匀浆样品，并以每次5秒、间隔30秒冰浴的方式脉冲匀浆器3至5次。样品再次离心后，收集上清液并以11,000 × g在4 °C下离心20分钟。将上清液转移至新的1.6毫升微量离心管中。用200微升缓冲液2重悬，然后通过吹打3至5次使腭组织充分匀浆。离心样品并吸除上清液后，用50 µL缓冲液2重悬含有粗膜组分的沉淀物。将S35GTPγS储备液稀释至50 nmol/L，并含10 mmol/L盐酸和10 mmol/L DTT。为结合实验配制250 µL的反应体系，如需保存可迅速冷冻。接下来，通过向不完全结合缓冲液中添加试剂，配制完全结合缓冲液（CBB），使其终浓度包含 1 mmol DTT、0.1% BSA、10 µmol GTP 和 0.1 nmol S35GTPγS。将膜组分在冰上解冻后，用不完全结合缓冲液将其稀释至浓度为 100 µg/mL。为检测肽段 DAMGO 通过 MOR1 对 GTP 结合的影响，用 CBB 配制一系列 DAMGO 梯度稀释液，终体积为 100 µL。为评估基础 GTP 结合水平，取 1.6 mL 微型离心管，加入 100 µL CBB。为评估非特异性结合，准备一个1.6毫升的微量离心管，其中加入99微升CBB缓冲液和1微升2毫摩尔非放射性标记的GTPγS。然后，向每个样品中加入100微升稀释的膜溶液。将样品在25摄氏度、300转/分钟的恒温振荡器中孵育30分钟。将玻璃纤维滤

measuring-g-protein-coupled-receptor-signaling-via-radio-labeled-gtp

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过放射性标记的GTP结合测量G蛋白偶联的受体信号

本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。...

成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

本文描述了一种用于估算激动剂对G蛋白偶联受体活性状态亲和常数（Kb）的方法。该分析可提供Kb的绝对值或相对值，具体取决于受体的组成性激活是否可测量。本方法适用于受体激活后产生的多种下游反应。...

量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

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使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

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一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

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鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

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研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。...

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

学习使用放射性标记的[35S]GTPγS结合实验来研究G蛋白偶联受体（GPCR）的药理学特性。该方法通过分离含GPCR的细胞膜，为药物开发和细胞信号传导研究提供可靠的功能性检测手段。

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

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