Name: 5-mC点印迹测定定量软骨细胞去分化的DNA甲基化水平体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习使用5-甲基胞嘧啶点印迹技术定量检测软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化水平。该方法简单快速，可评估软骨细胞表型，为自体软骨细胞移植治疗软骨缺损提供重要依据。

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本工作获得以下基金资助：国家自然科学基金（编号 81572198；编号 81260161；编号 81000460）；广东省自然科学基金（编号 2015A030313772）；中国博士后科学基金资助项目（编号 2013M530385）；广东省医学科研基金（编号 A2016314）；深圳市科技计划项目（编号 JCYJ20160301111338144；编号 JSGG20151030140325149；编号 JSGG20140519105550503；编号 GJHZ20130412153906739；编号 JCYJ20140414170821160；编号 JCYJ20140414170821200）。

本研究经深圳市第二人民医院人体伦理委员会批准。
1. 人关节软骨组织采集与软骨细胞培养
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>准备添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。配制1 mg/mL胶原酶II、0.25%胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及细胞筛网（40 µm尼龙）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人关节软骨组织采集
	<ol>
		<li>从创伤后供体患者的膝关节中分离关节软骨。所有参与者均需签署知情同意书。</li>
		<li>使用无菌手术刀将软骨切成1-2 mm3大小的组织块，并在DMEM中加入1 mg/mL胶原酶II，在37 °C条件下消化12-16小时以释放软骨细胞。</li>
		<li>将所得细胞悬液通过细胞筛网（40 µm）过滤，并用PBS洗涤两次。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以20,000-30,000个细胞/cm2的密度接种于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。</li>
		<li>在37 °C培养箱中进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单层软骨细胞扩增
	<ol>
		<li>使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集未完全融合的细胞，并以6,600个细胞/cm2的密度重新接种。每周更换两次培养基。</li>
		<li>将软骨细胞以单层形式培养至多六代，并在第1、2、3、4和5代时进行评估。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基因组DNA（gDNA）提取
<ol>
	<li>收集细胞，并按每1000万个细胞加入500 µL裂解缓冲液（15 mM Tris pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，0.5% SDS，200 µg/mL RNase A）重悬。通过移液和快速颠倒混匀细胞，然后在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>向细胞裂解液中加入蛋白酶K，终浓度为160 µg/mL，剧烈颠倒混匀。在55 °C孵育6小时。</li>
	<li>向样品中加入等体积的Tris pH 7.9饱和酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），涡旋振荡或手动充分摇动约20秒。</li>
	<li>在室温下以13,000 × g离心5分钟。小心移取上层水相，转移至新离心管中。</li>
	<li>用等体积氯仿抽提以去除酚，将上层水相转移至新的离心管中。</li>
	<li>加入0.1倍样品体积的3 M乙酸钠（pH 8.0）和2倍体积的100%乙醇，沉淀DNA。</li>
	<li>将离心管置于-20 °C过夜，以沉淀基因组DNA（gDNA）。</li>
	<li>在4 °C以16,000 × g离心10分钟，使gDNA沉淀。</li>
	<li>用70%乙醇洗涤样品三次，每次在4 °C以13,000 × g离心2分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，空气干燥后将DNA重悬于10 mM Tris pH 8.0、0.1 mM EDTA溶液中。</li>
</ol>
3. DNA甲基化谱分析
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用DNA甲基化试剂盒对总共500 ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化反应。用10 µL洗脱缓冲液洗脱（50 ng/µL）。</li>
	<li>根据制造商的说明书，使用商业试剂盒进行DNA甲基化谱分析。</li>
</ol>
4. 点印迹分析
<ol>
	<li>将分离的DNA（每份样品1 mg）在0.1 M NaOH中于95 °C变性10分钟。用冰上预冷的1 M NH4OAc中和DNA，然后进行两倍稀释。将系列稀释的基因组DNA每孔点样2 µL于N+膜上。</li>
	<li>将膜在80 °C烘烤30分钟。</li>
	<li>将N+膜浸泡于含5% BSA的TBS-T溶液中，室温下孵育1小时，以封闭非特异性抗体结合位点。使用直径10 cm的培养皿作为反应容器。</li>
	<li>用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，随后在4 °C下用小鼠抗5-甲基胞嘧啶（5-mC）单克隆抗体（1:1,000稀释）在TBS-T中孵育过夜。</li>
	<li>用TBS-T洗涤膜3次，每次5分钟，然后在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（1:5,000稀释）在TBS-T中孵育1小时。</li>
	<li>用TBS-T洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
	<li>向膜上加入酶底物，孵育5–10分钟。根据制造商说明书，使用化学发光检测试剂盒显影二抗信号。</li>
</ol>

<ol><li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation%3A+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li>
<li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).</li>
<li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li>
<li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li>
<li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li>
<li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li>
<li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li>
<li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states%2C+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li>
<li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

软骨细胞去分化 体外 严重损害自体软骨细胞移植（ACI）在软骨缺损修复治疗中的疗效11,12为优化自体软骨细胞移植（ACI）的效果，必须避免使用去分化的软骨细胞13研究表明，总体DNA甲基化水平与软骨细胞去分化的程度相关。4,6因此，在临床应用之前，建立一种可靠且快速的方法来检测软骨细胞的总体DNA甲基化状态至关重要。
为了检测去分化的软骨细胞中总体的DNA甲基化水平，我们可以测定连续传代的软骨细胞中的5-mC水平。5-mC对亚硫酸盐处理引起的脱氨作用具有抗性，该特性被用于通过亚硫酸盐测序方法分析DNA胞嘧啶的甲基化模式14。亚硫酸盐基因组测序和甲基化敏感性限制性酶切长期以来被视为检测DNA甲基化的金标准技术<sup class="xre...

自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）是一种相对较新且先进的治疗关节软骨缺损的手术方法1,2ACI 中的一个关键步骤是通过单层培养扩增软骨细胞 体外在扩增过程中，透明软骨细胞容易失去其表型并发生去分化，这对自体软骨细胞移植（ACI）治疗是不利的3,4为了优化自体软骨细胞植入术（ACI）的治疗效果，应在细胞重新植入前确定软骨细胞去分化的程度。建立一种经济且快速的方法来评估软骨细胞的状态至关重要。近年来，DNA甲基化与软骨细胞去分化之间的关联已引起广泛关注4,5,6DNA甲基化是一种将甲基基团添加到DNA上的过程，导致胞嘧啶残基转化为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
为了阐明软骨细胞去分化过程中DNA甲基化的生物学机制，首要步骤是评估软骨细胞的DNA甲基化水平，但迄今为止这一过程仍具挑战性。亚硫酸氢盐基因组测序是目前分析DNA甲基化最广泛使用的技术7,8。该实验中，亚硫酸氢盐转化会导致DNA降解，因此必须提供大量样本。此外，高效液相色谱法（HPLC）也被用于定量全基因组DNA甲基化水平9,10。然而，HPLC分析需要对基因组DNA进行消化处理，并且需要先进且昂贵的实验仪器。因此，这些实验方法不仅成本高昂，而且耗时较长。目前，抗5-mC抗体已实现商业化供应，这使得通过免疫印迹法检测复杂基因组中含5-mC的基因组DNA成为可能。
本研究中，我们从一系列单层培养的软骨细胞中提取了基因组DNA，并采用点杂交法检测不同传代次数的人软骨细胞中5-甲基胞嘧啶（5-mC）的含量。结果发现，高度去分化的软骨细胞中5-mC含量较低度去分化的软骨细胞有所升高。此外，我们还确定了去分化状态与5-mC水平之间的关联。最后，我们报道了5-mC含量的变化与软骨细胞表型相关。因此，5-mC点杂交法是一种可靠、简便且快速检测软骨细胞DNA甲基化水平的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Inc.</td><td>11965&amp;ndash;092</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>D-PBS，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1% 青霉素-链霉素</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Mallinckrodt</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Sigma</td><td>I-3643</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Gibco BRL</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Gibco BRL</td><td>24568-2</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Bio Whittaker</td><td>16-011V</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco BRL</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Biosharp Inc.</td><td>BL514A</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Biotopped Inc.</td><td>C58H114O26</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant Inc.</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>γ射线灭菌</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>MIULAB</td><td>MTH-100</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳细胞培养箱</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>化学发光成像分析系统</td><td>UVITEC Cambridge</td><td>ALLIANCE</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于定量软骨细胞去分化过程中dna甲基化水平的5-甲c点斑杂交检测方法 体外

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

透明软骨细胞在单层扩增过程中常发生去分化，转化为成纤维样软骨细胞 体外软骨细胞的全局DNA甲基化水平被认为可作为软骨细胞表型丢失的合适生物标志物。然而，基于不同实验方法所得结果可能存在不一致。因此，建立一种精确、简便且快速的定量方法以检测软骨细胞去分化过程中的全局DNA甲基化水平具有重要意义。
目前的全基因组甲基化分析技术在很大程度上依赖于亚硫酸氢盐基因组测序。由于亚硫酸氢盐转化过程中会导致DNA降解，这些方法通常需要较大的样本量。其他用于定量全基因组DNA甲基化水平的方法包括高效液相色谱法（HPLC）。然而，HPLC需要对基因组DNA进行完全消化。此外，HPLC仪器高昂的成本限制了其更广泛的应用。
本研究从不同传代次数培养的人软骨细胞中提取基因组DNA（gDNA），并采用甲基化特异性点印迹法检测gDNA的甲基化水平。在此点印迹方法中，含有待检测甲基化DNA的gDNA混合物被直接点样到N+膜上，形成预先绘制的圆形模板内的点状信号。与基于凝胶电泳的其他印迹方法及其他复杂的印迹程序相比，点印迹法可显著节省时间。此外，点印迹法可利用 commercially available 5-mC 抗体检测总体DNA甲基化水平。我们发现，单层继代培养的软骨细胞之间DNA甲基化水平存在差异，因此该差异可能在软骨细胞去分化过程中发挥关键作用。5-mC点印迹法是一种可靠、简单且快速的检测总DNA甲基化水平的方法，可用于评估软骨细胞表型。

软骨细胞在单层培养中传代至第6代（P6）。随着单层培养的连续传代，软骨细胞表现出逐渐的表型变化。P0代软骨细胞呈圆形，而随着传代次数增加至P6，细胞逐渐变得细长且扁平化（图1）。这种形态学变化是软骨细胞去分化过程的典型特征。同时，热图结果显示，CpG位点的总体甲基化水平随着连续传代培养的延长而升高。5-mC点杂交分析进一步表明，软骨细胞扩增过程中伴随有较高的CpG甲基化水平（图2）。这些结果提示，总体甲基化水平的升高与软骨细胞去分化之间存在关联。
<img alt="显示六个阶段（P1至P6）细胞形态的细胞培养显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/55565/55565fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：使用倒置显微镜观察到的人软骨细胞形态。</str...

我们介绍一种基于5-甲基胞嘧啶（5-mC）点印迹法的DNA甲基化定量方法。我们测定了软骨细胞去分化过程中的5-mC水平。这种简单技术可用于快速确定自体软骨细胞移植（ACI）治疗中软骨细胞的表型。

一种用于定量软骨细胞去分化过程中DNA甲基化水平的5-甲C点斑杂交检测方法 体外

透明软骨细胞在体外单层扩增过程中，常伴随去分化为成纤维样软骨细胞的现象。全局...

本实验的总体目标是确定软骨细胞去分化过程中的5-甲基胞嘧啶水平。该方法有助于解答基于细胞的软骨缺损治疗（如自体软骨细胞移植）中的关键问题。该技术的主要优势在于，它是一种可靠、简单且快速的方法，可用于检测总体DNA甲基化水平，以评估软骨细胞表型。该技术的意义在于，软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化是自体软骨细胞移植治疗软骨缺损的主要障碍，因此本技术对推动自体软骨细胞移植具有标准化价值。尽管该方法可用于研究软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化水平，也可应用于其他疾病的研究，例如骨关节炎。我们最初产生该方法的构想，源于阅读了一篇点杂交法参考文献中的实验方案。请演示此方法至关重要，因为点杂交的结果状态难以准确描述。基因组DNA应先变性，然后进行系列稀释，再转移至带正电荷的尼龙膜上固定。本实验操作将由本实验室的研究生 Zhaofeng Jia 演示。本研究中使用的关节软骨组织是从创伤后供体患者的膝关节中分离获得的。使用无菌手术刀将软骨切成 1 至 2 立方毫米大小的组织块。然后向剪碎的软骨中加入终浓度为1 mg/mL的II型胶原酶和DMEM。在37°C条件下孵育12至16小时，以消化软骨细胞。次日，将所得的细胞悬液通过40 µm细胞滤筛进行过滤。离心细胞，弃上清液，加入PBS，再次离心。使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每平方厘米20,000至30,000个细胞的密度接种，加入含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。在37°C培养箱中培养48小时。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集亚融合细胞。以每平方厘米6,600个细胞的密度重新接种。将软骨细胞以单层培养至多六代，并在第一、二、三、四和五代进行评估。开始该操作时，通过胰蛋白酶消化和离心收集细胞。然后用移液管将每1000万个细胞重悬于500微升裂解缓冲液中，并迅速颠倒混匀。在37摄氏度下孵育1小时。按每毫升细胞裂解液加入160微克的蛋白酶K，并剧烈颠倒混匀。在55摄氏度下孵育六小时。向每个样品中加入等体积的Tris pH 7.9饱和酚:氯仿:异戊醇。用手充分振荡样品约20秒。在室温下以13,000 × g离心样品5分钟。移除上层水相，并转移至新的离心管中。为去除苯酚，向每根试管中加入等体积的氯仿。手动振荡混匀，离心沉淀。将上层水相转移至新离心管中。加入0.1倍样本体积的3 M醋酸钠（pH 8）和2倍体积的100%乙醇。将试管于负20摄氏度保存过夜，以沉淀基因组DNA。次日，在4摄氏度条件下以16,000 × g离心10分钟，使基因组DNA形成沉淀。用70%乙醇洗涤样品。在4°C、13,000 × g条件下离心2分钟。小心去除上清液，并将DNA沉淀在空气中干燥。用10毫摩尔Tris（pH 8）含0.1毫摩尔EDTA的溶液重悬DNA。首先将分离的DNA在0.1摩尔氢氧化钠溶液中95°C变性10分钟，以启动该实验流程。将DNA在冰上用一摩尔浓度的乙酸铵中和，然后用双蒸水稀释两倍。点斑杂交实验中最关键的步骤是样品的点样，务必缓慢且小心地进行。尽量将每个点样的阵列控制在直径三到四毫米。使用窄口移液器吸头，小心地将两微升梯度稀释的基因组DNA点样到带正电荷的尼龙膜网格的中心位置。将膜在80摄氏度下烘烤30分钟。接下来，将膜置于含有5% BSA的TBST溶液中，在10厘米的培养皿中室温下轻轻摇动孵育1小时，以封闭非特异性抗体结合位点。1小时后，用TBST洗涤膜三次，每次5分钟。随后将膜与小鼠抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体在TBST中4°C条件下过夜孵育。次日，用 TBST 洗涤膜三次，每次五分钟。然后在室温下用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白 G 抗体与膜在 TBST 中孵育一小时。按照前述方法用 TBST 洗涤膜后，向膜上加入酶底物，孵育五至十分钟。最后，根据制造商说明书，使用化学发光试剂盒显影二抗信号。单层培养至第6代的软骨细胞表现出渐进性的表型改变，随着传代次数增加，细胞逐渐变得细长且扁平。这种形态学变化是软骨细胞去分化过程的典型特征。在不同传代次数后，从软骨细胞中分离基因组DNA，并通过5-甲基胞嘧啶特异性点杂交法检测DNA甲基化水平。随后使用ImageJ分析点杂交信号强度。随着连续传代培养时间的延长，5-甲基胞嘧啶水平逐渐升高，提示总体甲基化水平的升高与软骨细胞去分化之间存在关联。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在24小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是要始终注意最大化基因组DNA的浓度和纯度。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如基因组DNA甲基化谱分析，以回答更多科学问题，例如单层培养中软骨细胞去分化的相关机制。该技术建立后，为自体软骨细胞移植领域的研究人员提供了评估软骨细胞DNA甲基化状态并确定其在软骨缺损治疗中细胞表型的途径。观看本视频后，您应充分了解如何使用5-甲基胞嘧啶点印迹法检测退化的机械杠杆，以评估软骨细胞表型。请注意，接触苯酚可能具有极高危险性，因此在进行该操作时必须始终佩戴手套。

a-5-mc-dot-blot-assay-quantifying-dna-methylation-level-chondrocyte

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

5-mC点印迹测定定量软骨细胞去分化的DNA甲基化水平<em&gt;体外</em

EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI...

高灵敏度检测Balb/C小鼠脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶

本视频介绍了利用点印迹技术检测人软骨细胞中DNA甲基化水平的方法 体外通过...

5-甲基胞嘧啶点印迹法检测DNA甲基化程度

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。...

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。...

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。...

DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

本报告的目的是描述在发育中和有丝分裂后的小鼠视网膜中对表观遗传标志物5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行可靠免疫组织化学检测的实验方案。...

小鼠发育期及有丝分裂后视网膜中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学检测

本文介绍了一种利用免疫荧光染色和DNA点杂交方法检测细胞和脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的实验方案。...

小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的检测

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。...

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。...

通过成熟脂肪细胞在顶壁培养中的去分化生成人类脂肪源性干细胞

介绍了一种使用特异性DNA染料甲基绿对固定生物材料进行荧光染色的方法。甲基绿以稀释的水溶液形式使用，具有很强的抗光漂白性。其远红光发射特性适用于深层样本成像，特别适合对完整胚胎进行成像。...

甲基绿在胚胎荧光标记中的DNA特异性染色应用

学习使用5-甲基胞嘧啶点印迹技术定量检测软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化水平。该方法简单快速，可评估软骨细胞表型，为自体软骨细胞移植治疗软骨缺损提供重要依据。

一种用于定量软骨细胞去分化过程中DNA甲基化水平的5-甲C点斑杂交检测方法体外

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