一种用于定量软骨细胞去分化过程中DNA甲基化水平的5-甲C点斑杂交检测方法 体外

本实验的总体目标是确定软骨细胞去分化过程中的5-甲基胞嘧啶水平。该方法有助于解答基于细胞的软骨缺损治疗中的关键问题，例如自体软骨细胞移植。该技术的主要优势在于，它是一种可靠、简单且快速的方法，可用于检测总体DNA甲基化水平，以评估软骨细胞表型。

该技术的意义在于，软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化是自体软骨细胞移植治疗软骨缺损的主要障碍，因此该技术对推动自体软骨细胞移植的发展具有重要意义。尽管该方法可用于研究软骨细胞去分化过程中的DNA甲基化水平，也可应用于其他疾病的研究，例如骨关节炎。我们最初产生该方法的构想，源于阅读了一篇点杂交（dot blot）方法参考文献中的实验方案。

请演示此方法至关重要，因为点印迹的状态难以准确描述。基因组DNA应先变性，然后进行系列稀释，再转移至带正电荷的尼龙膜上固定。

本实验操作将由本实验室的研究生 Zhaofeng Jia 演示。本研究中使用的关节软骨组织是从创伤患者供体的膝关节中分离获得的。使用无菌手术刀将软骨切成 1 至 2 立方毫米大小的组织块。

然后向剪碎的软骨中加入终浓度为1 mg/mL的II型胶原酶和DMEM。于37°C孵育12至16小时，以消化软骨细胞。次日，将所得的细胞悬液通过40 µm细胞滤筛进行过滤。

离心细胞。弃去上清液，加入 PBS，再次离心。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

以每平方厘米20,000至30,000个细胞的密度接种，加入含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。在37°C培养箱中培养48小时。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集亚融合细胞。

以每平方厘米6,600个细胞的密度重新接种。将软骨细胞以单层培养至多六代，并在第一、二、三、四和五代进行评估。开始此操作时，通过胰蛋白酶消化和离心收集细胞。

然后用移液管将每1000万个细胞重悬于500微升裂解缓冲液中，并迅速倒置混匀。在37摄氏度下孵育1小时。按每毫升细胞裂解液加入160微克的蛋白酶K，并剧烈倒置混匀。

在55摄氏度下孵育六小时。向每个样品中加入等体积的Tris pH 7.9饱和酚:氯仿:异戊醇。用手充分振荡样品约20秒。

将样品在室温下以13,000 × g离心5分钟。移除上层水相，并转移至新的离心管中。为去除苯酚，向每根试管中加入等体积的氯仿。

手动振荡混匀，然后离心。将上层水相转移至新离心管中。加入0.1倍样本体积的3摩尔/升乙酸钠（pH 8）和2倍体积的100%乙醇。

将离心管于负20摄氏度下保存过夜，以沉淀基因组DNA。次日，在4摄氏度下以16,000 × g离心10分钟，使基因组DNA形成沉淀。用70%乙醇洗涤样品。

在4摄氏度、13,000 ×g条件下离心两分钟。小心移除上清液，并将DNA沉淀在空气中干燥。用10毫摩尔Tris（pH 8）、0.1毫摩尔EDTA重悬DNA。首先将分离得到的DNA在0.1摩尔氢氧化钠中于95摄氏度变性10分钟，以启动该实验流程。

将DNA在冰上用一摩尔浓度的乙酸铵中和，然后用双蒸水稀释两倍。点印迹检测中最关键的步骤是样品的点样，务必缓慢且小心地进行。

尽量将每个点样的阵列控制在直径三到四毫米。使用窄口移液器吸头，小心地将两微升梯度稀释的基因组DNA点样到带正电荷的尼龙膜网格中心位置。将膜在80摄氏度下烘烤30分钟。

接下来，在10厘米的培养皿中加入含5% BSA的TBST溶液，将膜浸泡其中，在室温下轻轻摇动孵育1小时，以封闭非特异性抗体结合位点。孵育1小时后，用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。随后将膜与小鼠抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体在4°C的TBST中4℃下孵育过夜。

次日，用 TBST 每次五分钟，清洗膜三次。然后在室温下用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白 G 抗体溶于 TBST 中孵育一小时。按照前述方法用 TBST 再次清洗膜后，向膜上加入酶底物，孵育五至十分钟。

最后，根据制造商说明书，使用化学发光试剂盒显影二抗信号。单层培养至第6代的软骨细胞表现出渐进性的表型改变，随着传代次数增加，细胞逐渐变得细长且扁平。这种形态学变化是软骨细胞去分化过程的典型特征。

在不同传代次数后，从软骨细胞中分离基因组DNA，并通过5-甲基胞嘧啶特异性点杂交法检测DNA甲基化水平。随后使用ImageJ分析点杂交信号强度。随着传代培养时间的延长，5-甲基胞嘧啶水平逐步升高，提示总体甲基化水平升高与软骨细胞去分化之间存在关联。若操作熟练，该技术可在24小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终注意最大化基因组DNA的浓度和纯度。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如基因组DNA甲基化谱分析，以回答更多科学问题，例如单层培养中软骨细胞去分化的相关机制。该技术建立后，为自体软骨细胞移植领域的研究人员提供了有力工具，可用于评估软骨细胞的DNA甲基化状态，并确定其在软骨缺损治疗中的细胞表型。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用5-甲基胞嘧啶点印迹法检测退化的机械杠杆，以评估软骨细胞表型。请注意，苯酚具有极高危险性，操作过程中必须始终佩戴手套。