自由活动小鼠中使用棱镜探针和微型荧光显微镜进行多层皮层 Ca²⁺ 成像

本实验的总体目标是利用钙离子指示剂，在自由活动的小鼠中同时观察大脑皮层多个层次神经元的活动，并通过微型化头戴式荧光显微镜来理解神经环路的功能。该方法有助于回答系统神经科学领域中的关键问题，例如信息如何在皮层的多个层次之间传递。该技术的主要优势在于，能够长期稳定地在自由活动的动物体内，对跨多个皮层层次的大量基因编码神经元群体进行可视化观察。

为了在自由活动的动物中可视化来自多个皮层的基因编码神经元，需要执行以下操作步骤。本方案重点介绍棱镜探针植入、基板安装以及在自由活动小鼠中进行的活体成像。开始操作前，待病毒注射后一至两周，将动物置于立体定位仪中，并准备进行棱镜探针植入手术：将探针在70%乙醇中消毒，并用镜头纸擦拭清洁。随后，使用配备0.5毫米钻头的微型钻头开一个圆形颅骨窗。

确保颅骨开窗的直径略大于棱镜直径。然后定位颅骨开窗位置，使得棱镜插入皮层后，其平面边缘朝向病毒注射位点，并位于该位点150至200微米半径范围内。随后，用精细镊子去除硬脑膜。

一旦暴露脑组织，务必使用无菌生理盐水保持组织湿润。这也有助于维持组织上的压力。在插入棱镜探针时，为减轻脑组织内的压力，可将一把直刃解剖刀固定在立体定位仪的电极固定臂上，以创建插入通道。

以一定角度安装，使刀片平面垂直于颅骨的曲率，并与病毒注射列处于平行平面。将刀片小心地置于颅骨开窗的内侧内缘上方，距离病毒注射位点约200微米外侧，刀刃朝向后方。当刀尖接触软脑膜时，将Z轴归零。

然后，逐渐将其降低至棱镜探头将要插入的深度。接着，将刀片向后移动一毫米，为棱镜的前缘开辟通路。使用立体定位臂微操作器以每秒10微米的步长缓慢回撤刀片，并在切口处放置一块浸有无菌生理盐水的明胶海绵。

随后，将透镜架以与上一步中切片刀相同的角度连接到立体定位操纵臂上。调整棱镜位置，使棱镜的平面一侧位于切口上方，并与病毒注射列平行。当棱镜达到正确角度后，以每次10微米的步进，逐步将其下降至距脑表面最终Z轴深度1.1毫米的位置（针对此探针）。

使用25号针头，以极薄的一层弹性体粘合剂覆盖颅骨开窗处暴露在外的任何组织。为防止透镜在颅骨开窗内移动，在弹性体粘合剂固化后，使用25号针头将少量氰基丙烯酸酯粘合剂涂抹于棱镜透镜的玻璃表面，将其粘附至弹性体粘合剂层上方相邻的颅骨上。待氰基丙烯酸酯粘合剂固化后，拧下透镜固定装置，并小心移除显微镜。

然后，缓慢回撤立体定位操纵臂，使棱镜探头稳固地植入。在植入物周围涂抹一层牙科丙烯酸树脂或氰基丙烯酸酯粘合剂，覆盖暴露的颅骨表面，但不要接触周围回缩的肌肉组织。通过颅骨帽覆盖较大面积的颅骨，有助于后续基板的固定。

随后，混合硅胶粘合剂注射器中的催化剂和基础剂，在棱镜探针套管内滴加一滴弹性体，覆盖探针镜头顶部，以防止损坏和灰尘沉积。在植入棱镜探针后一周至10天，通过已植入的棱镜探针检查组织中病毒的表达情况。为此，移除覆盖在植入式棱镜探针镜头表面的硅胶粘合剂帽。

检查探针镜头表面，使用镜头纸和70%乙醇轻轻擦拭以清除任何碎屑，确保成像表面清洁。接下来，将基板安装到显微镜上，并拧紧基板固定螺钉以固定其位置。然后，将显微镜牢固安装至立体定位微操作臂的显微镜夹持器中。

将夹持器连接到可安装在立体定位显微操作臂上的杆上。随后，使用立体定位显微操作臂将显微镜置于棱镜探头透镜上方。通过从动物载物台的侧面和后方观察棱镜透镜，目视检查其方向。

必须对齐显微镜物镜和棱镜探头的光轴。随后，启动采集软件，选择项目，并通过软件打开显微镜的LED光源。通过移动立体定位仪的操纵臂，在采集软件中聚焦于植入式棱镜探头镜头的顶层相位，以评估显微镜对准的质量。

当正确对齐时，棱镜探针镜头的边缘应显得清晰锐利。使用立体定位操纵臂调节显微镜位于植入式棱镜探针上方的物理距离，以获得组织内部所需的焦平面。随后，使用牙科丙烯酸树脂或氰基丙烯酸酯将基板永久固定于丙烯酸帽上，以桥接间隙。

在将基板粘接到动物头部时，切勿将粘合剂涂在显微镜本体或固定螺钉的任何部位。现在松开夹持器，将显微镜从夹持器中释放，并将夹持器从显微镜周围撤回。如果使用了氰基丙烯酸酯或其他透明粘合剂，需在其表面覆盖黑色指甲油或一层黑色牙科水泥，以防止环境光泄漏进入头帽，避免对后续实验中获取的图像造成污染。

然后，使用基板盖保护植入的棱镜探头。在此步骤中，将显微镜连接至与计算机相连的数据采集盒，并启动采集软件。接着，通过逆时针旋转基板固定螺钉并取下基板盖，以移除基板盖。

将显微镜置于动物体表的基板上。借助基板上的磁铁，显微镜应能卡入到位。然后，旋紧基板的固定螺钉，直至感到轻微阻力为止。

随后，选择用于采集数据的采集参数，包括数据采集的帧率。在选择参数时，检查图像直方图，以确保获得良好的信噪比。然后，开始采集数据。

当记录完成后，松开底板固定螺钉，并轻轻向上拉动显微镜，将其从底板上取下。随后，重新装上底板盖，并轻轻拧紧底板固定螺钉。以下演示了动物佩戴显微镜后，在行为实验区域内自由与物体互动的情景。

使用该系统进行清醒行为成像期间，记录了小鼠处于三种不同环境时体感皮层神经元的活动情况：第一天为开放场地，第二天至第四天为物体熟悉阶段，第五天为新物体接触阶段。在利用钙成像数据分析软件提取细胞后，将对应于细胞位置的空间滤波器叠加到显微镜记录数据的平均荧光强度投影图上。

白色虚线分隔第二层、第三层和第五层细胞。来自各层五个细胞的相应钙信号轨迹显示了细胞在两种不同行为情境下的活动模式：物体熟悉和新物体暴露。当小鼠接触新物体时，第二层和第三层细胞的活跃程度高于第五层细胞。

以下是动物处于开放场地、物体熟悉和新物体探索阶段时，来自表层实体参与者的细胞活动的其余图谱。一旦掌握，每种技术若操作得当，可在一小时内完成。该技术建立后，将为系统神经科学研究人员探索不同脑区中特定细胞类型提供途径，同时结合在疾病神经生理学的清醒动物及其他模型中使用不同的行为范式。

通过本实验方案，应能够充分掌握如何标记体感皮层的多个层次、植入棱镜探针以及安装头戴式微型显微镜。