Name: 重组昆虫细胞中的mCD1d的蛋白质的生产方法。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习利用杆状病毒在High Five昆虫细胞中生产重组小鼠CD1d蛋白的方法，并通过镍亲和层析与离子交换纯化技术制备mCD1d四聚体，用于NKT细胞识别的免疫学研究。

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一、解冻细胞
取一管冻存的 TN5 细胞，在 37°C 水浴中解冻。向 25 cm2 组织培养瓶中加入 5 ml 昆虫 Express 培养基（Invitrogen，货号-10486）。注意：Express 培养基不含谷氨酰胺，需向每升培养基中添加 10 ml 100X 谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液或单独的谷氨酰胺。将 TN5 细胞加入培养瓶中，在 27°C 培养箱中孵育 30 分钟。随后，轻轻吸除含 DMSO 的培养基，注意不要扰动贴壁于瓶底的细胞。加入 5 ml 新鲜培养基。
二、细胞的培养与扩增
每天观察细胞生长情况。当培养瓶中细胞融合度接近70%时，通过轻敲培养瓶两侧使细胞脱落悬浮，加入21 ml昆虫表达培养基和5 ml细胞培养物，将细胞转移至175 cm2培养瓶中。每个T175培养瓶的终体积应约为25–30 ml培养基。&nbsp;根据需要，将融合生长的培养瓶（细胞浓度约为100万个/ml）以1/4或1/5比例传代。切勿让细胞过度生长。记录细胞传代次数。传代次数不得超过30代，以免导致细胞老化并引发细胞裂解。当细胞达到目标体积且浓度为100万个/ml时，进行细胞感染操作。
我通常培养至2到2.5升，这通常相当于七十个175 cm2的培养瓶，每瓶约25至30 ml，或五个1升的锥形瓶，每瓶约400至500 ml
注意：您可以在 T-175 密封插头培养瓶或 Corning 锥形瓶中培养细胞。在锥形瓶中培养细胞速度更快，操作更简便。
三、通过终点稀释法测定病毒滴度
<ol>
<li>在96孔平底培养板中，每孔加入200 µl Express Five SFM培养基，接种3000-5000个细胞。将细胞置于27°C环境中静置，至少30分钟使其贴壁。</li>
<li>对杆状病毒原液进行系列稀释。在96孔U型底培养板的一排孔中，用多通道移液器以每孔250 µl的Express Five SFM培养基进行10倍梯度稀释。</li>
<li>使用多通道移液器，将不同稀释度的病毒液各取固定体积（通常为20 µl），加入已接种细胞的孔中。</li>
<li>在27°C培养7天。为防止边缘孔液体蒸发，需用封口膜将培养板边缘密封。</li>
<li>培养7天后，观察培养板，确定引起50%感染率的病毒稀释度（即在此病毒浓度下，约一半孔中的细胞被感染）。随后使用公式计算病毒滴度，结果以pfu/ml（pfu：空斑形成单位）表示。该计算公式可在大多数杆状病毒操作手册中找到。</li>
</ol>
四、感染细胞
准确了解病毒的滴度非常重要。加入所需量的病毒。在制备病毒储备液时，应以不超过1的感染复数（MOI）（每1个High Five细胞感染1个pfu）感染细胞。较高的MOI会导致病毒突变的产生。在蛋白表达时，通常使用的MOI为5-10。
示例：
mCD1d 杆状病毒的滴度 = 1×10⁸ pfu/mL
加入MOI=1（用于扩增病毒）= 每瓶20×10⁶个细胞 / 1×10⁸ pfu / ml = 每瓶200 µl
MOI = 5 至 10（用于蛋白质生产）= 每 20×10⁶ 个细胞/烧瓶加入 1 ml 至 2 ml
感染后第4天，观察感染的细胞。此时细胞应已脱落、漂浮、肿胀，并呈香肠状。
五、回收上清液
取出感染的培养瓶中的培养基，转移至250 ml蓝色瓶盖Falcon旋转瓶中。这些瓶子可高压灭菌后重复使用。将瓶子均匀装满，在Sorvall GSA转子中以200 rpm、4°C离心20分钟。收集上清液，并进行后续纯化步骤。
六、重组 mCD1d 的纯化
<ol>
<li>在150 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中透析并浓缩</li>
<li>通过Ni-NTA琼脂糖层析，用150 mM磷酸钠 + 200 mM咪唑洗脱蛋白mCD1d+b2m</li>
<li>使用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）通过脱盐柱去除咪唑</li>
<li>使用MonoQ柱进行阴离子交换层析，以去除残留杂质</li>
<li>使用YM 30浓缩器（Millipore）浓缩至1 mg/ml </li>
<li>根据生产商说明书（Avidity），利用BirA酶对mCD1d进行生物素化标记 </li>
<li>通过S200柱（凝胶过滤层析）使用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）去除游离生物素。平均每2升上清液可获得2至3 mg的生物素化蛋白</li>
<li>mCD1d-α-GalCer四聚体的制备</li>
</ol>
为了将CD1d分子与α-GalCer结合，将可溶性生物素标记的CD1d-β2m与三倍摩尔过量的α-GalCer在含0.5% Tween-20的PBS（0.9%氯化钠）溶液中于室温孵育过夜。通过将负载α-GalCer的CD1d单体与四倍摩尔过量的PE标记链霉亲和素混合，并在室温孵育4小时，生成四聚体。储存于48°C。

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

本实验步骤介绍了如何启动、培养昆虫细胞，以及如何利用这些细胞感染并测定杆状病毒的滴度。该实验最关键的部分在于细胞的维持以及准确测定杆状病毒的滴度。一旦制备出CD1四聚体，便可作为分析糖脂反应性T细胞的有力工具。杆状病毒系统还被广泛用于表达重组蛋白，包括MHC II类分子四聚体，因此本实验方法具有更广泛的适用性。

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td> 无血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td> 昆虫细胞</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>抗生素</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25 cm² TC 培养瓶</td><td> 塑料培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm² TC 培养瓶</td><td> 带塞密封培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td> 细胞培养用锥形瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 浓缩器</td><td>30,000 分子量截留值（MWCO）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 设备</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA 酶与缓冲液</td><td> 生物素化试剂盒</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖柱</td><td>His标签蛋白纯化柱</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱盐柱</td><td> 用于去除蛋白中的盐分</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ 柱</td><td>阴离子交换色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 柱</td><td> 尺寸排阻色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td> 糖脂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-链霉亲和素</td><td> 用于蛋白偶联</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

一种在昆虫细胞中生产重组mcd1d蛋白的方法

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1蛋白构成了一类第三种抗原提呈分子。它们是细胞表面糖蛋白，以分子量约为50 kDa的糖基化重链形式表达，并与β2-微球蛋白非共价结合。这类分子结合脂类而非肽类。尽管其结构证实CD1蛋白与MHC I类和II类抗原提呈分子具有相似性，但小鼠CD1d（mCD1d）的抗原结合槽相对较窄、较深，且高度疏水，具有两个结合口袋，而经典的由MHC编码的抗原提呈分子则具有多个较浅的结合口袋。根据其氨基酸序列，这种疏水性结合槽为脂类抗原的结合提供了理想的环境。自然杀伤T细胞（NKT细胞）通过其T细胞受体（TCR）识别由CD1d分子结合或呈递的糖脂。对由CD1分子呈递的脂质产生反应的T细胞，已证实参与了对自身免疫性疾病和感染性疾病的防护，以及肿瘤排斥反应。因此，识别、纯化并追踪CD1反应性NKT细胞应答的能力具有重要意义。由α-半乳糖基神经酰胺（a-Galcer）与CD1d构成的四聚体的开发，极大地促进了人们对NKT细胞生物学特性的理解。其他基于不同CD1分子构建的四聚体也已被成功制备，这些新型试剂显著拓展了人们对脂质反应性T细胞功能的认识，在监测脂质疫苗应答、自身免疫性疾病诊断及其他治疗应用中具有潜在价值。

一种制备昆虫细胞并用杆状病毒感染以生产重组mCD1d蛋白及生成mCD1d四聚体的方法。

一种在昆虫细胞中生产重组mCD1d蛋白的方法

CD1蛋白构成了一类第三种抗原呈递分子。它们是细胞表面糖蛋白，表达为约50 kDa的糖基化……

大家好，我是来自拉霍亚过敏与免疫学研究所发育免疫学系Mitch Kronenberg博士实验室的Ashra Corona。今天我将向大家演示如何准备High Five昆虫细胞，并用VIR进行感染，以生成MA CD1D四聚体。我们实验室以及其他实验室均使用CD1D四聚体来识别NKT细胞。VIR 系统被广泛用于表达重组蛋白，包括 MS C 类 II 型 TE 震颤蛋白。因此，您将看到的实验流程具有更广泛的适用性。该流程包括：启动并培养 High Five 昆虫细胞；用携带 CD1D cDNA 的杆状病毒感染细胞；感染四天后，通过离心收集上清液；在 150 毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中裂解细胞并浓缩蛋白；通过镍柱亲和层析及离子交换层析法纯化小鼠 CD1D 蛋白；使用 YM-30 浓缩器将小鼠 CD1D 蛋白浓缩至 1 毫克/毫升；采用 AVID D 方案对小鼠 CD1D 蛋白进行酶促生物素标记；通过 S-200 柱去除游离的生物素试剂。最后是α凝胶CD1D四聚体的制备。尽管整个流程包含上述所有步骤，但今天我们将仅演示如何处理这些细胞，并用病毒进行感染，以产生更多的CD1D四聚体。现在开始。首先，我将向您展示如何培养 TN 五号昆虫细胞。High Five 细胞系源自菜粉蝶昆虫的卵巢细胞。本实验方案选用这些细胞，是因为它们可在无血清培养基中生长，适用于悬浮培养，并且在 25 平方厘米组织培养瓶中加入 5 毫升昆虫表达培养基时可高效表达重组蛋白。需要注意的是，该昆虫表达培养基不含谷氨酰胺。因此，我们需要将10 ml的100倍谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液，或仅将谷氨酰胺加入一升培养基中。现在，我将取出一支冻存的High Five昆虫细胞，立即在37摄氏度水浴中解冻，并将High Five昆虫细胞加入培养瓶中，在27摄氏度培养箱中孵育30分钟。随后，小心吸除含有DMSO的培养基，注意不要扰动贴壁在培养瓶底部的细胞。现在我们需要在传代后向培养瓶中加入 5 ml 新鲜培养基，接着需要在病毒感染前对细胞进行扩增。每天观察细胞，当培养瓶中细胞融合度接近 70% 时。通过轻轻敲击培养瓶两侧使细胞悬浮。将细胞转移至1个75平方厘米的培养瓶中，加入25 ml昆虫表达培养基和5 ml细胞培养分裂培养瓶，按1:4或1:5的比例进行传代，视需要而定。切勿让细胞过度生长，并记录细胞传代的次数。不要超过第30代，因为可能导致细胞老化，进而引起细胞裂解。细胞需要每隔一天传代一次。传代比例为1:5。当细胞浓度达到每毫升100万个细胞并达到所需体积时，即可进行细胞感染。我通常将细胞培养至两升，这通常需要7个75平方厘米的培养瓶，每个培养瓶约加25毫升培养基，或4个一升的ER培养瓶，每个培养瓶约加500毫升培养基。使用ER培养瓶培养细胞速度更快。将100毫升培养物加入400毫升ExpiSFMTM表达培养基中，在27°C、125 rpm振荡条件下培养，直至细胞密度达到每毫升100万个细胞的所需体积。在感染细胞之前，我将向您演示如何滴定Belo病毒，接下来我们将进行该操作。为滴定病毒，每孔接种3000至5000个细胞。在96孔平底板中，加入200 µL昆虫表达SFM培养基。将细胞在27 °C下静置至少30分钟。对Avius原液进行连续稀释。应在96孔板的一列中进行梯度稀释，每孔加入250 µL。稀释使用Express Five SFM培养基进行。使用多通道移液器，将固定体积（通常为 20 µL）的不同稀释度样品加入细胞培养物中，在 27 °C 培养箱中孵育七天，以避免边缘孔发生蒸发。七天后，用封口膜包裹培养板边缘。检查培养板，确定哪种病毒稀释度可产生 50% 感染率。然后使用公式计算滴度，单位为 PFU/mL。该公式在大多数病毒使用手册中均有提供。感染病毒后，用于感染细胞以进行蛋白表达的病毒量应使感染复数（MOI）介于 5 到 10 之间。例如，如果小鼠 CD1D belo 病毒的滴度为每毫升一亿个空斑形成单位，且每瓶中有两千万个细胞，则需要加入 1 ml 至 2 ml 的 belo 病毒以感染细胞。细胞应感染四天。感染后第四天，细胞应出现脱落、漂浮、肿胀，并形成香肠状的团块。现在需要回收上清液。将感染培养瓶中的培养基转移至 250 ml 蓝盖 Falcon 离心瓶中。这些瓶子可高压灭菌并重复使用。将瓶子均匀装满，然后在4°C条件下，使用GSA转子以2000 RPM离心20分钟，使细胞沉淀。收集上清液，并进行后续纯化步骤。我刚刚向您演示了如何启动、培养和感染High Five昆虫细胞，以及如何滴定杆状病毒。利用这些细胞，该实验最关键的步骤在于如何维持细胞状态以及如何确定疱疹病毒（baus）的准确滴度。一旦成功制备CD1D四聚体，便可作为分析糖脂反应性T细胞的有力工具。该处理和滴定巴洛病毒（balo virus）的实验方案也可广泛应用于其他多种重组蛋白的研究。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

重组昆虫细胞中的mCD1d的蛋白质的生产方法。

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