Name: 全细胞电压钳记录的电生理方法果蝇光感受器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习全细胞电压钳记录技术，用于研究黑腹果蝇感光细胞的光转导机制与TRP通道特性。该方法可实现膜电压精确控制与高信噪比测量，为视觉信号传导研究提供可靠手段。

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本研究的实验部分得到了以下机构的资助：美国-以色列双边科学基金会（授予 B.M. 和 I.L.）、以色列科学基金会（ISF）、德意志-以色列项目合作组织（DIP）（授予 B.M.），以及生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC 资助编号：BB/M007006/1 和 BB/D007585/1）（授予 R.C.H.）。

<ol><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/245/1314/203">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calphotin%3A+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+and+Ca2%2B+buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15694324">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li>
<li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Lond%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li>
<li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li>
<li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li>
<li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li>
<li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/252/1335/223">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li>
<li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li>
<li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10747191">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li>
<li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li>
<li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://elsc.huji.ac.il/minke/publications/excess-g%16betae%13-over-g%16qalphae%13-%10-vivo%11-prevents-dark-spontaneous-activity-%10droso">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li>
<li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein%2C+phospholipase+C%2C+and+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li>
<li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels%2C+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17234592">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li>
<li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18786361">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li>
<li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23066080">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00709805">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9003779">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li>
<li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li>
<li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+transform+glucose+to+alanine%2C+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
<li>Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li>
<li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+block+by+Ca2%2B+underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对黑腹果蝇（D. melanogaster）感光细胞应用全细胞记录技术，使得研究人员能够发现并阐明多种新型信号蛋白的功能，例如TRP通道27,28,29以及INAD30,31,32支架蛋白。自该技术首次引入以来，它推动解决了有关光反应的离子机制及其电压依赖性的长期基础科学问题。这得益于该技术能够精确控制细胞膜电压以及细胞外和细胞内的离子组成19,28。
在 D. melanogaster 中应用膜片钳技术的主要障碍之一是分离出的小眼（ommatidia）制备物极为脆弱。详细研究表明，光转导机制的完整性严重依赖于ATP的持续供应，尤其是在光照条件下，此时ATP消耗量巨大。然而，为了使膜片钳电极能够接触到感光细胞膜，必须机械剥离色素细胞（即&#160;胶质细胞），而这一步骤会消除ATP生成所需代谢物的主要来源33。通过记录电极向细胞内施加外源性ATP仅能部分满足大量ATP的需求。ATP的短暂缺乏会导致TRP通道的自发激活，并使光转导机制与光激活通道解偶联，从而引起细胞内Ca2+浓度显著升高，并完全消除对光的正常反应34,35。这一系列事件并非由解剖操作对感光细胞造成的机械损伤所致，而是由于细胞内ATP耗竭所引起。为防止此类情况发生并维持正常的光反应，应避免将感光细胞暴露于强光下，因为强光会大量消耗ATP。此外，记录电极液中必须包含NAD，推测其作用是促进线粒体内的ATP生成18,36。在记录自发性量子 bumps 和单光子反应时，上述问题影响较小，因为仅使用弱光刺激。实际操作中，稳定的全细胞记录通常可维持约20–25分钟，尽管在此期间反应动力学会逐渐变慢。一批分离的小眼制备物在体外最多可保持活性达2小时。
分离小眼制备方法的另一个缺点是微绒毛无法接近，这导致记录电极难以接触到TRP和TRPL通道，从而无法进行单通道记录。Bacigalupo及其同事利用他们开发的一种方法，成功地直接记录到来自感杆（rhabdomere）的单通道活动37。然而，这种通道活动与在组织培养细胞中异源表达的TRPL通道活动38以及通过噪声分析从分离小眼中获得的TRP通道活动34均不相同。推测使用该方法时，解剖过程对感光细胞造成了严重损伤。

对果蝇的广泛遗传学研究 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）黑腹果蝇（D. melanogaster），始于100多年前，已确立了 D. melanogaster 果蝇作为解析复杂生物过程的遗传机制的一种极为有用的实验模型。以下所述方法结合了已积累的强大遗传工具之力 D. melanogaster 分子遗传学与高信噪比的全细胞膜片钳记录技术相结合。这种组合方法可用于研究 D. melanogaster 将光转导作为肌醇脂质信号传导以及TRP通道调控与激活的模型，研究其在天然环境及单分子最高分辨率下的机制。
全细胞记录法的应用 D. melanogaster 光感受器的研究极大地推动了无脊椎动物光转导机制的探索。该方法由 Hardie 建立。1 以及由 Ranganathan 及其同事独立完成2 约26年前设计，旨在利用广泛存在的遗传操作工具 D. melanogaster 并利用它们揭示光转导和肌醇脂质信号传导的机制。最初，该技术存在光照敏感性迅速下降以及解剖过程中小眼单位（ommatidia）得率较低的问题，限制了深入的定量研究。随后，在膜片钳电极内添加ATP和NAD后，显著提高了样本用于长时间定量记录的适用性。自此，得以在分子水平上对信号转导机制进行系统而深入的表征。
目前， D. melanogaster 光转导是少数几个可以研究磷脂酰肌醇信号通路和TRP通道的系统之一 离体 在单分子分辨率下。这使得 D. melanogaster 光转导及其研究该机制所开发的方法是一种高度敏感的模型系统。本方案描述了如何解剖该 D. melanogaster 视网膜，并从周围的色素（胶质）细胞中机械分离出单个小眼。这有助于在感光细胞体上形成吉伽封接和全细胞膜片钳记录。幸运的是，大多数信号蛋白局限于小眼体，不会发生扩散。此外，存在一种不移动的 Ca2+ 位于信号区室与细胞体之间的一种名为calphotin的缓冲区3,4，以及Na的高表达水平+/Ca2+ 微绒毛中的交换蛋白（CalX）5蛋白在小网膜中的限制性定位、钙调蛋白缓冲系统以及CalX的高表达共同作用，使得相对较长的（即&#160;长达约20分钟的全细胞记录，同时不丢失光转导过程的关键组分，并保持对光的高敏感性。以下方案描述了如何获取分离的单个小眼并进行全细胞记录，该记录方法似乎可保留光转导级联反应的天然特性。对分离的蟑螂（Periplaneta americana)6 和蟋蟀（Gryllus bimaculatus)7 小眼的处理方法与所描述的方法类似 D. melanogaster此外，对锉蛤（file clam）离体感光细胞进行的膜片钳实验表明，Lima scabra）和扇贝（Pecten irradians) 的操作方式与之前进行的略有不同 D. melanogaster，允许全细胞8 和单通道测量9. 本文综述了在该领域取得的主要成果 D. melanogaster 使用该技术的注意事项进行了描述。讨论部分包含了对该技术一些潜在问题和局限性的说明。

<table><tbody><tr><td>10 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带细长针头的1 mL注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &amp;micro;m PVDF 滤膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>毛细管（用于小眼分离）</td><td></td><td></td><td>玻璃，1.2 x 0.68 mm（每根约7.5 cm）</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>1.57 × 1.14 毫米（35 厘米）</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2 个小型烧杯</td><td></td><td></td><td>50 mL 或更少</td></tr><tr><td>2片石蜡膜</td><td>Parafilm M</td><td></td><td>约 5 x 5 厘米</td></tr><tr><td>浴槽室</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td>22 x 22 mm No. 0</td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma</td><td>石蜡 &amp;ndash; 聚异丁烯混合物</td><td>将盖玻片粘附至灌流腔底部</td></tr><tr><td>地面</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-1288</td><td>杂交组装银-氯化银纳米线阵列</td></tr><tr><td>无头显微解剖针</td><td></td><td></td><td>昆虫学，12 mm</td></tr><tr><td>显微解剖针持</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>夹具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 把精细镊子 + 1 把粗糙镊子</td><td></td><td>Dumont #5，生物学&amp;nbsp;</td><td>0.05 × 0.02 mm，长 110 mm，Inox</td></tr><tr><td>体视变倍显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>冷光源滤光片（彩色）</td><td>Schott</td><td>RG620</td><td></td></tr><tr><td>精密擦拭器</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>电极夹 holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-T10P</td><td>Q系列支架，适用于Axon放大器，直筒式设计</td></tr><tr><td>银线</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25 mm 直径，需进行氯化处理</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP 85</td><td>休斯利-沃尔式显微操作器</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>自制</td><td></td><td>电磁噪声屏蔽与黑色前帘</td></tr><tr><td>防振台</td><td>纽波特</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>GW</td><td>GOS-622G</td><td></td></tr><tr><td>灌注系统</td><td>华纳仪器</td><td>VC-8P</td><td>夹管阀控制系统</td></tr><tr><td>灌注阀控制器</td><td>科学仪器</td><td>BPS-8</td><td></td></tr><tr><td>吸力系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>分子装置</td><td>Axopatch-1D</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>分子装置</td><td>CV - 4</td><td>增益：x 1/100</td></tr><tr><td>模数转换器</td><td>分子装置</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>分子装置</td><td>10</td><td>软件</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>分子装置</td><td>10</td><td>软件</td></tr><tr><td>光源（氙弧灯）</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda LS</td><td></td></tr><tr><td>光检测器</td><td>自制</td><td></td><td>光电晶体管</td></tr><tr><td>滤光轮和快门控制器</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda 10-2 配备 Uniblitz 快门</td><td></td></tr><tr><td>滤光片（中性密度滤光片）</td><td>染色</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td></td></tr><tr><td>滤光片（彩色）</td><td>Schott</td><td>OG590，边缘滤光片</td><td></td></tr><tr><td>氙闪光灯系统</td><td>Dr. Rapp OptoElecftronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>光导</td><td></td><td></td><td>石英&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>AMPI</td><td>掌握 8</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71，倒置显微镜</td><td></td></tr><tr><td>显微镜用红色照明滤光片</td><td></td><td></td><td>RG630 / RG645 &amp;oslash;45 mm</td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>X60/0.9 UplanFL N 空气物镜或 X60/1.25 UplanFI 油镜</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon DU885K</td><td></td></tr><tr><td>NIS Element&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>雄激素受体</td><td>软件</td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; 指示剂</td><td>Invitrogen</td><td>钙绿5N</td><td></td></tr><tr><td>激发 &amp;和发射滤光片及二向色镜</td><td>染色</td><td>19002 - AT - GFP/FITC 长通滤光片组</td><td></td></tr><tr><td>垂直式移液器拉制仪</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td>模型 PP83</td><td>根据个人偏好选择使用垂直或水平拉制仪。</td></tr><tr><td>水平拉管仪</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>Model P-1000 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td></td></tr><tr><td>丝状结构</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>3 mm 槽或方盒</td></tr><tr><td>毛细血管</td><td>哈佛仪器</td><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>1 × 0.58 mm</td></tr></tbody></table>

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

全细胞电压钳记录 黑腹果蝇 光感受器已经彻底改变了无脊椎动物视觉转导领域，使得利用 D. melanogaster 分子遗传学用于在单分子水平上研究肌醇脂质信号传导和瞬时受体电位（TRP）通道。少数实验室已掌握这一强大技术，可在高度受控条件下分析光引起的生理反应。该技术可精确控制细胞内和细胞外溶液环境、膜电压，以及快速向细胞内和细胞外环境施加药理学化合物，例如多种离子或pH指示剂。由于具有极高的信噪比，该方法能够检测暗态下的自发性及光诱导的单通道电流。即&#160;自发量子脉冲和宏观光诱导电流（LIC）来自单个 D. melanogaster 感光细胞。本方案详细阐述了执行该技术所需的全部关键步骤，包括电生理记录和光学记录。用于获取完整且具有活性的果蝇视网膜的解剖步骤 离体 描述了将分离的单个小眼置于浴槽室中的方法。同时详细说明了进行全细胞记录和荧光成像测量所需的设备。最后，解释了在长时间实验中使用这种精细制备样本时可能遇到的困难。

在特定条件下，该方法实现了对自发产生和光诱导量子突跃（quantum bumps）的基本单通道电流的精确记录，这些电流叠加后形成对光的宏观反应。该方法还允许比较野生型与关键信号分子存在缺陷的突变型果蝇（图3 和 图5）14,15,16,17,18。此外，在双离子条件下测量反转电位的能力揭示了TRP和TRP样（TRPL）通道的基本生物物理特性18,19。该方法还实现了对TRP通道孔区氨基酸替换所引起的Ca2+通透性改变效应的测量20。
全细胞膜片钳记录获得的光反应在至少4个数量级的光强范围内与光强度呈线性关系。这一特性无法通过视网膜电图（ERG）和细胞内记录方法解析。因此，通过一系列强度递增的短暂闪光刺激所得到的反应，以及绘制的光强-反应函数曲线，揭示了闪光反应随光强增加而呈现严格的线性关系。这种严格的线性关系可维持至数百皮安（pA）水平，但在此之后，究竟是线性关系本身发生偏离，还是电压钳制能力丧失，尚存争议。图6）。这些结果表明，光的宏观反应是光的单个反应的线性叠加（即 量子 bumps
已有电压记录研究明确证实，弱光刺激会引发离散的电压波动（即 量子 bumps）在大多数无脊椎动物物种中。 D. melanogaster 量子 bumps 源于在 bump 峰值时约 15 个 TRP 通道和约 2 个 TRPL 通道的协同开放18每个隆起由单个光子的吸收产生，而对较强光线的宏观反应则是这些基本反应的总和14,21. 即使在刺激条件相同的情况下，这些感受野的潜伏期、时间进程和振幅也存在显著差异。感受野的产生是一个符合泊松统计的随机过程，其中每个有效吸收的光子仅引发一个感受野。单光子-单感受野的关系要求级联反应中的每一步不仅包含高效的“开启”机制，还必须具备同样高效的“关闭”机制。这种机制的功能优势在于能够产生一种极为敏感的光子计数器，并具有快速的瞬时响应特性，非常适合视觉系统对敏感性和时间分辨率的要求。当活性光敏色素（即 变视紫红质，M）或其靶标 Gqα无法失活，导致在光照关闭后仍持续产生感光小体图3)15,22,23,24 .
凸起代表微绒毛中TRP/TRPL通道的协同活动。因此，任何关于通道激活的假说都应同时解释通道的协同激活机制。最近，Hardie及其同事已证明光会引发感光细胞的快速收缩，提示光敏感通道（TRP/TRPL）可能是机械门控的25。这种机械激活，加上磷脂酶C介导的PIP水解所释放的质子，2 水解，促进TRP/TRPL通道的开启，并解释光感受器小事件（bump）产生的协同性26目前， D. melanogaster 光感受器是少数几个可以研究磷脂酰肌醇信号通路和TRP通道的系统之一 体内因此使得 D. melanogaster 光转导及用于研究该机制的方法是一种极具价值的模型系统。
<img alt="光感受器反应图；电生理学，多种突变；比较突触活性。" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：inaCP209 和 inaDP215 突变体揭示了宏观光反应及单量子 bumps 反应终止的缓慢特性。 (A使用填充有荧光染料Lucifer Yellow CH（激发波长：430 nm；发射波长：540 nm）的膜片钳电极对分离的小眼制备进行全细胞记录时的图像。请注意，荧光染料已扩散并标记了一个单一的感光细胞胞体，且感光细胞胞体虽已与其细长的轴突分离，但仍保持活性。该制备适用于同时进行全细胞记录与成像实验。B-D上图：在持续弱光（空心条）下，野生型（WT）的全细胞电压钳制量子 bumps 反应 inaCP209，以及 inaDP215 突变果蝇中观察到光感受器反应的缓慢终止。 inaCP209 和 inaDP215 与野生型果蝇相比的突变体。下方插图为单个光感受器反应（bumps）的放大形状。底部图示：全细胞记录的宏观反应在500毫秒光脉冲（1.5 x 105 每秒光子数（photons per s）的野生型和突变型果蝇。 （E-G） 上图：全细胞电压钳记录的野生型量子 bumps 对短暂（1 毫秒）、微弱光刺激（引发单光子反应）的响应 arr23，以及 ninaCP235 突变果蝇。注意观察到的一系列隆起。 arr23 和 ninaCP235 突变果蝇在吸收单个光子后的反应。下图：全细胞电压钳制下对500 ms光脉冲（1.5 × 104 光子/秒）在相应突变体中的变化。注意在宏观反应中观察到的终止过程较慢的现象。 arr23 和 ninaCP235 突变果蝇相对于野生型。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同光照时间下野生型与Cpn1%的荧光寿命显微成像；发射光分析。" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：信号诱导的 Ca2+ 内流后细胞内 Ca2+ 动态变化受Calphotin影响。 对野生型和 Cpn1% 果蝇感光细胞在光照刺激过程中 Ca2+ 指示剂荧光信号的时间序列图像。原始荧光强度图像采用伪彩色编码表示（比例尺 = 10 µm；箭头指示移液管）。图示经 Weiss et al.4 许可转载。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型与trp突变型果蝇的电流轨迹电生理图；电压阶跃方案。" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：野生型、trp突变体和trpl突变体的电生理特性。 (A) 连续弱光（开放条形表示光照期）下WT和trpl突变体中量子突触电流的全细胞电压钳记录302和 trpP343 无突变体果蝇。振幅显著降低的 trpP343 观察到突起。插图：野生型和单个量子突起的放大图 trpP343 显示了无效突变体果蝇。B) 对野生型及相应突变体施加3秒光脉冲后的全细胞电压钳记录。瞬态稳态反应的 trpP343 突变体被观察到。插图：野生型（WT）和突变体的放大光反应 trpP343突变体如图所示。 (C) 上述果蝇品系在20 ms光脉冲刺激下诱发的叠加光诱导电流家族，于反转电位（E）附近以3 mV电压步长记录的电流响应翻转). (D) 绘制平均 E 的直方图翻转 野生型及各种突变体。误差条表示标准误（S.E.M.）。反转电位（Erev野生型（WT）的正值E之间rev 的 trpl302，该细胞仅表达TRP，以及E翻转 的 trpP343 null突变体，仅表达TRPL。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示光电流（皮安）与光子计数呈线性叠加的光子响应图。" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：闪光响应与光强增加呈严格线性关系。 
一系列对强度递增的短暂闪光刺激所产生的电流反应，以及光反应峰值幅度随短暂闪光强度增加的变化关系图。该关系表明，闪光响应与光强增加之间存在严格的线性关系。这种严格的线性关系至少可维持至数百皮安（pA）范围内，光强跨度超过四个数量级；在此之后，究竟是线性关系被破坏，还是电压钳制控制失效，尚存争议。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.15（用 NaOH 调节）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脯氨酸</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙氨酸</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>在 -20 °C 下保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">注：该溶液名义上为无 Ca2+ 溶液，但未添加 Ca2+ 缓冲剂，因此含有约 5 - 10 µM 的痕量 Ca2+。细胞外液（ES）= 在 ES-0Ca2+ 中加入 1.5 mM CaCl2 制成，可通过将 0.5 M 或 1 M 储存液的 CaCl2 加入 ES-0Ca2+ 获得。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Ca+2无细胞外液（ES） 化学描述及制备 Ca 所需的具体用量+2无ES
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>1.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">分装为每管150 µL，置于1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>吹打溶液（TS）</td>
			<td>取1管150 mL的储存液，加入1,350 mL ES或ES-0Ca2+溶液进行稀释，所用溶液应与解剖过程中使用的溶液一致。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：胎牛血清（FBS）+蔗糖——储备液。 配制胎牛血清（FBS）+蔗糖储备液所需的化学试剂及其具体用量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.15（用 KOH 调节）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖酸钾 (Kglu)</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三磷酸腺苷镁盐 (MgATP)</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三磷酸鸟苷钠盐 (Na2GTP)</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物 (NAD)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>于 -20 °C 保存。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：细胞内溶液（IS1）。 化学成分及配制IS1所需的特定用量，该溶液主要用于强度反应和量子 bumps 测量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.15（用CsOH调节）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度（mM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP镁盐（MgATP）</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP钠盐（Na2GTP）</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（NAD）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>四乙基氯化铵（TAE）</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>于-20 °C保存。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：细胞内溶液（IS2）。 化学成分及配制主要用于光诱导电流反转电位测量的细胞内溶液IS2所需的特定用量。

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP 通道。

采用全细胞膜片钳技术对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞进行电压钳制记录，已彻底改变了无脊椎动物视觉信号转导领域的研究，……

本实验的总体目标是获得单个光感受器细胞的全细胞电压钳记录，以测量由单光子吸收以及强光重复刺激所引发的光诱导电流。该方法有助于研究感觉转导领域中的关键问题，例如视觉转导过程中的物理与离子机制，以及TRP通道的特性。采用该技术的优势包括对膜电位的完全控制、极高的信噪比，以及能够引入特定指示剂以进行光学测量。通常，初次接触该方法的研究人员会因样本制备的微小尺寸以及需要在代谢敏感的时间窗口内快速完成解剖而感到困难。进行此实验时，应以每管约20只的密度培养果蝇。实验时，应准备若干管即将封口、且已在持续黑暗条件下培养至少24小时的蛹。在收集成虫前两小时，移除所有已羽化的成虫。始终在红光照射下的组织中操作经暗适应的果蝇。在等待新近羽化的果蝇时，准备记录室。将盖玻片用熔化的石蜡或高真空硅脂固定在灌流 chamber 的底部，以完成灌流槽的制备。然后将灌流槽安装到倒置显微镜的载物台上。将灌流系统管路、吸引系统管路以及用于电生理记录装置的接地导线放入灌流槽中。开始解剖前，在一个60毫米的培养皿背面准备一些溶液。分别滴加四滴无钙ES溶液和一滴TS溶液。现在，使用粗镊子夹住一只刚羽化的果蝇的翅膀或身体。然后用细镊子将头部摘下，并迅速将头部转移到第一滴无钙ES溶液中。在体视显微镜下，用另一对细镊子沿矢状面将头部纵向解剖为两半。确保双眼保持完整。现在将头部的一半转移至第二个无钙 ES 液滴中，另一半转移至第三个无钙 ES 液滴中。随后开始解剖其中一只眼睛。使用精细镊子尽可能去除眼球周围的所有组织，以确保不损伤视网膜。然后用精细镊子牢固夹住角膜边缘，将视网膜挖出。最终应得到一个完整的空角膜和一个完整分离的视网膜。移液管保存在乙醇中，因此使用新的吹打移液管时，务必先用清水冲洗。接着，用冲洗过的移液管从第四滴中吸取少量无钙ES溶液。然后，通过轻柔的口吸，将分离的视网膜吸入移液管中。需格外小心避免产生气泡。然后将视网膜放入TS液滴中。接着对另一只眼睛重复视网膜分离操作，使两只眼睛的视网膜均置于TS液滴中。随后轻轻吸除培养皿中的无钙ES溶液，并在培养皿表面再添加六滴TS溶液。将两个视网膜转移至新的TS液滴中。然后更换为尖端开口直径较小的吹打移液管。冲洗后，用一滴TS充满该移液管。用此移液管快速反复吹打两个视网膜，以使部分小眼从色素细胞中分离。此过程中TS将变得浑浊。接下来，将两个视网膜的残留物转移至另一滴TS液滴中。然后，用含有分离出的小眼的浑浊TS液滴吸取溶液，并将溶液吹入灌流槽中。使用直径逐渐减小的吹打移液管重复此操作，直至视网膜完全溶解。现在，等待一分钟。在此暂停期间，分离的单眼将附着在腔室底部。一分钟后，使用灌流系统开始灌注含有1.5毫摩尔/升钙的ES溶液。当灌注溶液时，确保接地线和吸液管均浸入液面以下。让溶液流动60至90秒后再进行后续操作。开始时，使用40倍物镜仔细观察浴液中的小眼（ommatidia）。请注意，构成小眼的细长感光细胞胞体已与其轴突分离，但仍保持活性。现在为实验选择一个合适的小眼结构，应满足以下标准。外膜必须光滑且完整。长轴应几乎与电极从远端接近的方向成直角。且小眼周围不应有任何多余的组织。选定后，将小眼置于视野中央。现在用适合该实验的细胞内溶液填充移液管，并将移液管连接至电极夹持器。然后向移液管的管腔内吹气以产生正压，并通过关闭管阀锁定压力。接着将移液管插入浴槽室，引导其靠近小眼（ommatidium）的远端区域，直至在膜上观察到微小凹陷，此凹陷由封接移液管产生的正压所致。现在在记录软件中打开膜测试模块，以100赫兹的频率施加持续的2毫伏方波电压脉冲。接下来，使用膜片钳放大器的控制装置，将结电位调零，使方波脉冲的基线电流归零。然后打开阀门释放移液管内的压力，并轻轻抽吸以形成负压。此时移液管应与细胞膜紧密贴附。发生此情况后，关闭阀门以锁定压力。现在检查电极电阻，其值应升高至 100 到 150 兆欧之间。然后通过再次打开阀门释放移液管中的负压。此时阻抗应迅速上升至一到两吉欧姆之间，表明移液管与细胞之间已形成C型封接。接下来，使用膜片钳放大器对移液管的电容电流进行偏移补偿。为形成全细胞记录模式，通过口吸法破裂细胞膜。在电极中施加快速、短暂且有力的负压脉冲。一旦获得全细胞记录模式，电容将突然增大。然后使用膜片钳放大器，将钳制电位设定至所需电压，并对串联电阻中的电容性电流进行补偿。现在关闭法拉第笼的黑色布质遮光帘，开始实验。当使用含有荧光染料荧光黄（Lucifer yellow）的膜片电极获得全细胞记录构型后，可观察到仅复眼小眼结构中的一个感光细胞被染料标记。该感光细胞在小眼内也将与周围细胞实现电学隔离。对野生型果蝇以及InaC或InaD基因突变果蝇的小眼进行全细胞电压钳记录，均在持续弱光刺激下观察到量子 bumps。与野生型果蝇相比，两种突变体均表现出bumps终止过程减慢的现象。在每秒150,000个光子、持续500毫秒的光脉冲刺激下，归一化的反应清晰地展示了生理特性的改变。利用该制备方法，甚至能够测量全细胞电压钳制下对持续1毫秒的微弱光刺激所产生的量子 bumps 反应。此类单光子反应在野生型、视蛋白激酶抑制蛋白突变体以及ninaC突变体果蝇中进行了比较。两种突变体均产生一系列光感受器电位波动。在每秒15,000个光子强度的光照下，给予持续500毫秒的光脉冲所记录到的标准化反应。因此，在arrestin-2和ninaC突变体中均观察到宏观反应的缓慢终止。观看本视频后，您应能充分理解如何对果蝇感光细胞进行全细胞记录。一旦掌握该技术，操作得当的情况下可在一小时内完成。该技术为研究人员深入理解TRP通道和肌醇脂质信号通路，以及哺乳动物中内在光敏性视网膜神经节细胞在非成像性光依赖活动中的作用奠定了基础。

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科研

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神经科学

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本视频演示了从成年果蝇中分离完整大脑的实验步骤，为使用标准全细胞记录技术对单个神经元进行电生理记录做准备。内容包括记录过程中观察到的GFP标记细胞和神经元的图像。...

成年果蝇脑组织的全细胞记录

本视频展示了在水生虎纹蝾螈视网膜切片中进行全细胞电压钳记录的过程。我们演示了切片的制备方法，以及在视网膜接受视觉刺激期间如何进行膜片钳记录。...

视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。...

果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

原位 膜片钳记录用于对完整神经环路中神经元的电生理特性进行表征。在完整的 果蝇...

制备 果蝇 中枢神经元 原位 膜片钳技术

本视频概述了在固定状态的黑腹果蝇（Drosophila）眼部进行光感受器活动电生理记录的实验方案，可实现对光刺激下电压变化的精确测量。...

电压响应的电生理记录 黑腹果蝇 视网膜光感受器对光刺激的反应

该视频演示了通过建立全细胞记录模式，对Drosophila小眼（ommatidium）中的感光神经元进行电活动记录。重点展示了光脉冲激活瞬时受体电位通道，从而产生可测量的量子 bumps（quantum...

Drosophila 光感受器的全细胞电压钳记录

我们描述了从水生虎纹蝾螈（Ambystoma...

在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。...

记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

本文介绍了一种利用河豚毒素和河豚毒素抗性钠通道NaChBac来检测神经元之间单突触连接的方法。...

检测单突触连接 果蝇 利用河豚毒素抗性钠通道

我们提出了一种电生理学方法，用于表征双稳态光敏色素：（i）利用光敏色素分子在吸收光子后发生的电荷位移及其在感光细胞中的大量存在，以及（ii）利用视紫红质与高视紫红质这两种光敏色素状态之间的吸收光谱差异。这些方法可用于筛选影响双稳态光敏色素系统的突变。...

用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

学习全细胞电压钳记录技术，用于研究黑腹果蝇感光细胞的光转导机制与TRP通道特性。该方法可实现膜电压精确控制与高信噪比测量，为视觉信号传导研究提供可靠手段。

全细胞电压钳记录的电生理学方法果蝇光感受器

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全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

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