全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

本实验的总体目标是获得单个光感受器细胞的全细胞电压钳记录，以测量由单光子吸收以及强光重复刺激所引发的光诱导电流。该方法有助于研究感觉转导领域中的关键问题，例如视觉转导过程中的物理与离子机制，以及TRP通道的特性。采用该技术的优势包括对膜电位的完全控制、极高的信噪比，以及能够引入特定指示剂以进行光学测量。

通常，初次接触该方法的研究人员会因样本制备的微小尺寸以及需要在代谢敏感的时间窗口内快速完成解剖而感到困难。进行此实验时，应以每管约20只的密度培养果蝇。实验时，应准备若干管即将封口、且已在持续黑暗条件下培养至少24小时的蛹。

在收集成虫前两小时，移除所有已羽化的成虫。始终在红光照射下的组织中操作经暗适应的果蝇。在等待新近羽化的果蝇时，准备记录室。

将盖玻片用熔化的石蜡或高真空硅脂固定在灌流 chamber 的底部，以完成灌流槽的制备。然后将灌流槽安装到倒置显微镜的载物台上。将灌流系统管路、吸引系统管路以及用于电生理记录装置的接地导线放入灌流槽中。

开始解剖前，在一个60毫米的培养皿背面准备一些溶液。分别滴加四滴无钙ES溶液和一滴TS溶液。现在，使用粗镊子夹住一只刚羽化的果蝇的翅膀或身体。然后用细镊子将头部摘下，并迅速将头部转移到第一滴无钙ES溶液中。在体视显微镜下，用另一对细镊子沿矢状面将头部纵向解剖为两半。

确保双眼保持完整。现在将头部的一半转移至第二个无钙 ES 液滴中，另一半转移至第三个无钙 ES 液滴中。随后开始解剖其中一只眼睛。

使用精细镊子尽可能去除眼球周围的所有组织，以确保不损伤视网膜。然后用精细镊子牢固夹住角膜边缘，将视网膜挖出。最终应得到一个完整的空角膜和一个完整分离的视网膜。

移液管保存在乙醇中，因此使用新的吹打移液管时，务必先用清水冲洗。接着，用冲洗过的移液管从第四滴中吸取少量无钙ES溶液。然后，通过轻柔的口吸，将分离的视网膜吸入移液管中。

需格外小心避免产生气泡。然后将视网膜放入TS液滴中。接着对另一只眼睛重复视网膜分离操作，使两只眼睛的视网膜均置于TS液滴中。随后轻轻吸除培养皿中的无钙ES溶液，并在培养皿表面再添加六滴TS溶液。

将两个视网膜转移至新的TS液滴中。然后更换为尖端开口直径较小的吹打移液管。冲洗后，用一滴TS充满该移液管。用此移液管快速反复吹打两个视网膜，以使部分小眼从色素细胞中分离。此过程中TS将变得浑浊。

接下来，将两个视网膜的残留物转移至另一滴TS液滴中。然后，用含有分离出的小眼的浑浊TS液滴吸取溶液，并将溶液吹入灌流槽中。使用直径逐渐减小的吹打移液管重复此操作，直至视网膜完全溶解。

现在，等待一分钟。在此暂停期间，分离的单眼将附着在腔室底部。一分钟后，使用灌流系统开始灌注含有1.5毫摩尔/升钙的ES溶液。

当灌注溶液时，确保接地线和吸液管均浸入液面以下。让溶液流动60至90秒后再进行后续操作。开始时，使用40倍物镜仔细观察浴液中的小眼（ommatidia）。

请注意，构成小眼的细长感光细胞胞体已与其轴突分离，但仍保持活性。现在为实验选择一个合适的小眼结构，应满足以下标准。

外膜必须光滑且完整。长轴应几乎与电极从远端接近的方向成直角。且小眼周围不应有任何多余的组织。

选定后，将小眼置于视野中央。现在用适合该实验的细胞内溶液填充移液管，并将移液管连接至电极夹持器。

然后向移液管的管腔内吹气以产生正压，并通过关闭管阀锁定压力。接着将移液管插入浴槽室，引导其靠近小眼（ommatidium）的远端区域，直至在膜上观察到微小凹陷，此凹陷由封接移液管产生的正压所致。现在在记录软件中打开膜测试模块，以100赫兹的频率施加持续的2毫伏方波电压脉冲。

接下来，使用膜片钳放大器的控制装置，将结电位调零，使方波脉冲的基线电流归零。然后打开阀门释放移液管内的压力，并轻轻抽吸以形成负压。此时移液管应与细胞膜紧密贴附。

发生此情况后，关闭阀门以锁定压力。现在检查电极电阻，其值应升高至 100 到 150 兆欧之间。

然后通过再次打开阀门释放移液管中的负压。此时阻抗应迅速上升至一到两吉欧姆之间，表明移液管与细胞之间已形成C型封接。接下来，使用膜片钳放大器对移液管的电容电流进行偏移补偿。

为形成全细胞记录模式，通过口吸法破裂细胞膜。在电极中施加快速、短暂且有力的负压脉冲。一旦获得全细胞记录模式，电容将突然增大。

然后使用膜片钳放大器，将钳制电位设定至所需电压，并对串联电阻中的电容性电流进行补偿。现在关闭法拉第笼的黑色布质遮光帘，开始实验。当使用含有荧光染料荧光黄（Lucifer yellow）的膜片电极获得全细胞记录构型后，可观察到仅复眼小眼结构中的一个感光细胞被染料标记。

该感光细胞在小眼内也将与周围细胞实现电学隔离。对野生型果蝇以及InaC或InaD基因突变果蝇的小眼进行全细胞电压钳记录，均在持续弱光刺激下观察到量子 bumps。与野生型果蝇相比，两种突变体均表现出bumps终止过程减慢的现象。

在每秒150,000个光子、持续500毫秒的光脉冲刺激下，归一化的反应清晰地展示了生理特性的改变。利用该制备方法，甚至能够测量全细胞电压钳制下对持续1毫秒的微弱光刺激所产生的量子 bumps 反应。此类单光子反应在野生型、视蛋白激酶抑制蛋白突变体以及ninaC突变体果蝇中进行了比较。

两种突变体均产生一系列光感受器电位波动。在每秒15,000个光子强度的光照下，给予持续500毫秒的光脉冲所记录到的标准化反应。因此，在arrestin-2和ninaC突变体中均观察到宏观反应的缓慢终止。

观看本视频后，您应能充分理解如何对果蝇感光细胞进行全细胞记录。一旦掌握该技术，操作得当的情况下可在一小时内完成。该技术为研究人员深入理解TRP通道和肌醇脂质信号通路，以及哺乳动物中内在光敏性视网膜神经节细胞在非成像性光依赖活动中的作用奠定了基础。