Name: 闪存和冻结:一种新的技术来捕获膜动力学与电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 了解闪存冻结技术结合光遗传学与高压冷冻，以毫秒级时间分辨率捕获神经元膜动态变化。该方法可用于可视化突触囊泡融合与内吞过程，为神经科学研究提供高时空精度的电镜成像方案。

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本工作获得了约翰斯·霍普金斯大学（SW）的资金支持。感谢约翰斯·霍普金斯医学院显微镜设施的技术支持。感谢Erik Jorgensen和Christian Rosenmund及其实验室成员对该技术的开发。感谢M. Wayne Davis对初始装置的设计。感谢Paul Wurzinger、Cveta Tomova和Delgermaa Luvsanjav提供的技术协助。同时感谢Natalie R. Hamilton和Grant F. Kusick对稿件的审阅与宝贵意见。

所有实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）有关动物使用的规章制度进行。本实验方案已获得约翰斯·霍普金斯医学院动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 小鼠海马神经元的分离与培养
<ol>
	<li>从出生后第0至第2天（P0 - 2）的小鼠脑中解离皮层18。从皮层中分离星形胶质细胞。 
	注意：小鼠脑在断头后分离。星形胶质细胞作为海马神经元的饲养层。</li>
	<li>用800 µL的0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C处理皮层15分钟，以解离星形胶质细胞。</li>
	<li>将星形胶质细胞在T-75培养瓶中用13 mL含10%胎牛血清（FBS）和0.2%青霉素-链霉素的DMEM培养基于37 °C和5% CO2条件下培养一周。</li>
	<li>在12孔板的每个孔中放置一个经酸洗并灭菌的18 mm玻璃盖玻片。</li>
	<li>将两个6 mm碳涂层蓝宝石圆盘短暂地用70%乙醇洗涤，并将其放置在每个玻璃盖玻片上。</li>
	<li>通过将3 mL的17 nM乙酸与1 mL大鼠尾胶原和1 mL聚-D-赖氨酸（PDL，1 mg/mL）混合制备PDL溶液。将200 µL PDL溶液加入蓝宝石圆盘和玻璃盖玻片上，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>去除PDL溶液并风干。使用前，将按步骤1.4 - 1.6制备的培养板在紫外线下照射30分钟进行灭菌。</li>
	<li>将步骤1.3中获得的星形胶质细胞以5×104 个细胞/孔的密度接种于按步骤1.4 - 1.6制备的培养板中，每孔加入2 mL DMEM培养基。在37 °C和5% CO2条件下培养一周。</li>
	<li>在接种神经元前至少数小时内，向每孔加入20 µL氟代脱氧尿苷（终浓度：80 µM）。 
	注意：氟代脱氧尿苷可抑制星形胶质细胞分裂。</li>
	<li>更换培养基为1.5 mL神经元基础培养基（见材料表），其中含1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（见材料表）、2%神经元细胞无血清添加剂（见材料表）和0.2%青霉素-链霉素。</li>
	<li>通过将20单位木瓜蛋白酶加入5 mL酶溶液（含1.65 mM半胱氨酸、1 mM CaCl2和0.5 mM EDTA的DMEM）中制备木瓜蛋白酶溶液。通入CO2气体酸化溶液20分钟。用0.22 µm滤器过滤除菌。</li>
	<li>从P0 - 2小鼠中取出脑组织18，立即转移至冰上预冷的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中。在体视显微镜下解剖海马体，保持组织浸没在HBSS中。</li>
	<li>将两个海马体放入1 mL步骤1.11中制备的木瓜蛋白酶溶液中。在37 °C、750 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育1小时。</li>
	<li>用含2.5 mg/mL胰蛋白酶抑制剂和0.5 mg/mL白蛋白的1 mL灭活溶液替换木瓜蛋白酶溶液。在37 °C孵育5分钟。吸除灭活溶液。</li>
	<li>向分离的海马体中加入200 µL神经元基础培养基（见材料表）。使用200 µL移液枪头反复吹打以解离细胞。静置至未解离的组织沉底。小心吸取上层含细胞的液体。</li>
	<li>重复步骤1.15三次。将所有解离的细胞收集至一个新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞数量。以6.5×104 个细胞/孔的密度将神经元接种于步骤1.1 - 1.10制备的星形胶质细胞层上。</li>
	<li>在体外培养第3天（DIV 3）用表达通道视紫红质的慢病毒感染神经元&#160;in vitro) 18。</li>
	<li>在体外培养第14天（DIV 14）进行闪光-冷冻实验，具体操作见下文步骤2.1 - 2.5。</li>
</ol>
2. 闪光与冷冻
<ol>
	<li>固定剂的配制
	<ol>
		<li>在化学通风橱中，向一个锥形管中加入以下物质以配制固定液：2.5 mL 戊二醛（10% 储存液，溶于丙酮）、0.25 g 四氧化锇、0.25 mL 水和 22.25 mL 无水丙酮。 
		注意：每种组分在丙酮中的终浓度应为1%。添加戊二醛以在冷冻置换过程中保护蛋白质结构。警告：四氧化锇急性毒性较高，其蒸气暴露可能损伤眼角膜，仅可在经认证的化学通风橱中操作。</li>
		<li>将固定液分装至已编号的2 mL冻存管中，每管1 mL。使用前，将固定液置于液氮中冷冻保存。 
		注意：四氧化锇与戊二醛会发生交叉反应并产生沉淀；因此，两者混合后应立即分装，盖紧管盖，并将冻存管浸入液氮中以冷冻固定液。请使用铅笔对冻存管进行编号，因为丙酮可洗去记号笔的标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生理盐水的制备
	<ol>
		<li>通过混合 HEPES（10 mM，pH 7.5）、NaCl（140 mM）、KCl（2.4 mM）和葡萄糖（10 mM）配制生理盐溶液。 
		注意：这些数值为终浓度。单层培养物不使用冷冻保护剂。然而，对于厚度超过 5 µm 的样本，需要使用适当的冷冻保护剂。通常建议使用 20% BSA。酵母糊和 E. coli OP50 也可用作果蝇幼虫的冷冻保护剂 秀丽隐杆线虫.</li>
		<li>加入 CaCl2 在 4 mM 和 MgCl₂2 终浓度为 1 mM。 
		注意：CaCl₂ 的浓度2 和 MgCl2 根据实验的不同而有所变化。为了确保捕获胞吐中间态，本实验采用 4 mM 钙离子以提高囊泡的释放概率18.</li>
		<li>使用渗透压仪检测渗透压，确保其为300 ± 5 mOsm。</li>
		<li>加入AMPA受体拮抗剂（NBQX）至终浓度3 µM，以及GABA受体拮抗剂（bicuculline）至终浓度30 µM。 
		注意：添加神经递质受体拮抗剂以避免神经元刺激后出现反复的网络活动18.</li>
		<li>将生理盐水预热至 37 °C 以备使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>专用高压冷冻机和自动化冷冻置换仪的制备
	<ol>
		<li>在高压冷冻之前，通过向罐中加入液氮，将自动冷冻置换装置冷却至 -90 °C。</li>
		<li>将丙酮倒入小杯中，置于样品室中冷却至 -90 °C。</li>
		<li>填充高压冷冻仪的液氮杜瓦罐和储存杜瓦罐（参见 材料表用液氮。</li>
		<li>使用触摸屏显示器设置光刺激程序。
		<ol>
			<li>通过单击为程序命名 &#34;编辑&#34; 旁边 &#34;项目名称&#34; 在光刺激窗口上。另一个窗口将弹出。</li>
			<li>通过输入设置一个程序 &#34;15,000 ms&#34; 在 &#34;暗相&#34; &#34;100 ms&#34; 在 &#34;时期，&#34; &#34;10 ms&#34; 在 &#34;脉冲，&#34; 和 &#34;1&#34; 在 &#34;周期数&#34; 单次10毫秒刺激后，90毫秒时冷冻细胞（图1C). 
			注意： &#34;暗相&#34; 使细胞在加样过程中从光照暴露中恢复。 &#34;周期&#34; 定义刺激频率。例如，若刺激频率应为 20 Hz，则此列应设置为 50 ms。 &#34;脉冲&#34; 定义了光刺激的持续时间。最后， &#34;周期数&#34; 定义了施加刺激的总次数。有关设置高频刺激，请参见 图1E.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于一个 &#34;无刺激&#34; 对照，类型 &#34;15 s&#34; 在 &#34;暗相&#34; &#34;0 毫秒&#34; 在 &#34;周期，&#34; &#34;1 ms&#34; 在 &#34;脉冲，&#34; 和 &#34;0&#34; 在 &#34;周期数&#34; 在光刺激设置窗口中，如步骤 2.3.4 所述。 
		注意：默认情况下， &#34;脉冲&#34; 必须至少为 1 ms。</li>
		<li>在主界面上，确保已勾选光刺激选项框。</li>
		<li>通过点击设置存储协议 &#34;样本储存&#34; 在主屏幕上。点击 &#34;编辑。&#34; 在接下来的窗口中，使用 &#34;+&#34; 或 &#34;-,&#34; 选择 &#34;2&#34; 每个通道存放2个圆盘（共3个通道）。检查 &#34;液氮储存已启用。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品装载与高压冷冻中的冷冻步骤 
	注意：所有样品组装和上样步骤均在体视显微镜下进行，放大倍数范围为 7.5–60 倍。步骤 2.4.1 至 2.4.4 使用镊子操作样本。实验必须在生理温度下进行。
	<ol>
		<li>将一片蓝宝石圆盘（细胞面朝上）放入黑色中间板的孔中（图1B).</li>
		<li>在蓝宝石圆盘上放置一个100 µm的间隔环（图1B).</li>
		<li>将一片空白的蓝宝石圆盘置于间隔环上方（图1B将圆盘的一侧浸入步骤2.2中预热的生理盐水中后，确保两片蓝宝石圆盘之间无气泡残留。</li>
		<li>放置另一个100 µm间隔环和一个400 µm间隔环（图1B). 使用滤纸去除多余的液体。</li>
		<li>将步骤 2.4.3 中的组件置于两个透明半圆柱体之间（图1A)。关闭顶部红色盖子以启动冷冻过程。 
		注意：一旦关闭盖子，预设程序将自动运行。样品在冷冻室中保持相同的取向，光脉冲从样品组件顶部施加。冷冻过程完成后，红色盖子会自动弹起。</li>
		<li>将样本存放在储存杜瓦瓶中。 
		注意：冷冻后，样品会自动落入装有液氮的储存杜瓦瓶中，并在此保存直至进一步处理。该储存杜瓦瓶分为三个腔室，每个腔室最多可容纳3个样品。通常情况下，两个样品在相同的刺激条件下进行冷冻，高压冷冻仪可被编程设置为将这两个样品存入同一腔室。</li>
		<li>对每个样本重复步骤 2.4.1 - 2.4.6。</li>
		<li>所有腔室充满后，进入步骤 2.5。 
		注意：该设备设置为每次在储存杜瓦瓶中最多可保存6个样本。因此，每采集6个样本后th 样本，必须执行步骤 2.5。卸载后，重复步骤 2.4.1 - 2.4.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集与转移至自动冷冻置换装置
	<ol>
		<li>打开位于高压冷冻仪台下的储存杜瓦瓶的盖子。取出储存杜瓦瓶并放置在实验台面上。</li>
		<li>用手将样本室从杜瓦瓶中取出，并转移至装有液氮的专用样品托盘中。松开旋钮以释放样本杯。</li>
		<li>使用镊子从样本杯中取出透明半圆柱体，操作前需用液氮（约-196 °C）预冷镊子尖端。小心将中间的黑色平板转移至盛有液氮的小杯中。 
		注意：镊子尖端必须预先冷却至液氮温度。样品必须始终置于液氮中，以防止冰晶形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 自动化冷冻置换仪中的冷冻置换
<ol>
	<li>使用预冷的镊子（尖端温度约为 -196 °C），迅速将步骤 2.5.3 中的中层板转移至预冷的丙酮（-90 °C）中。</li>
	<li>通过轻轻摇晃或轻敲，将蓝宝石圆盘从中层板上分离。 
	注意：有时可能难以将蓝宝石圆盘与中层板分离。此时，可将中层板在预冷的丙酮（-90 °C）中放置数分钟。用镊子轻轻敲击也有助于使蓝宝石圆盘与中层板分离。</li>
	<li>将装有固定剂的冷冻小瓶（步骤 2.1）放入置换装置的样品室中。将蓝宝石圆盘转移至该冷冻小瓶内，并盖上瓶盖。</li>
	<li>设置冷冻置换程序如下：(i) -90 °C 下维持 5–30 小时，(ii) 在 14 小时内从 -90 °C 升至 -20 °C（升温速率为 5 °C/h），(iii) 在 -20 °C 下维持 12 小时，(iv) 在 4 小时内从 -20 °C 升至 20 °C（升温速率为 10 °C/h）。 
	注意：第一步在 -90 °C 下的持续时间可根据需要调整。冷冻置换的总时长应设置为使程序在实验后约 1.5 天的早晨（约上午 8 点）结束，以便后续操作可在白天进行。</li>
</ol>
4. 环氧树脂渗透与包埋
<ol>
	<li>程序结束后，戴上手套将冷冻管中的蓝宝石圆片从置换仪的样品室转移至化学通风橱中。</li>
	<li>使用移液器向每个冷冻管中加入丙酮（室温），每个蓝宝石圆片用丙酮清洗 4 - 6 次，每次 1 - 2 小时。</li>
	<li>如需增强对比度，可选步骤：将样品在 0.1% 醋酸铀酰溶液中孵育 1 小时，随后用丙酮清洗 4 - 6 次，持续 1 - 2 小时。 
	注意：警告：吸入醋酸铀酰可能导致体内暴露，引起上呼吸道刺激，高浓度暴露可能损伤血细胞。操作醋酸铀酰应在排风通风条件下进行，建议穿戴防护服。</li>
	<li>通过称取 6.2 g 甘油聚甘油醚、4.4 g 双酚 A 环氧树脂和 12.2 g 十二烯基琥珀酸酐（DDSA）配制液态环氧树脂介质，充分混合，边搅拌边加入 800 µL 苯甲基二甲胺（BDMA），随后脱气 10 分钟。</li>
	<li>用步骤 4.4 配制的 100% 环氧树脂与丙酮配制 30%、70% 和 90% 的环氧树脂溶液。</li>
	<li>向含有蓝宝石圆片的冷冻管中加入 30% 环氧树脂，在室温下于 120 rpm 的旋转摇床中孵育 2 - 3 小时。</li>
	<li>用移液器将 30% 环氧树脂替换为 70% 环氧树脂，在室温下于旋转摇床中孵育 3 - 4 小时。</li>
	<li>使用镊子将每片蓝宝石圆片（细胞面朝上）转移至包埋胶囊的盖子中，向盖子中加入 90% 环氧树脂，在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>次日，按照步骤 4.4 重新配制新鲜环氧树脂介质。</li>
	<li>将每片蓝宝石圆片（细胞面朝上）转移至包埋胶囊的盖子中，用新配制的 100% 环氧树脂充满盖子，每 2 小时更换一次新鲜 100% 环氧树脂，重复三次。</li>
	<li>将样品置于 60 °C 烤箱中 48 小时以完成聚合。</li>
</ol>
5. 样品封片
<ol>
	<li>将样品倒置放置在体视显微镜上，使蓝宝石圆盘位于树脂块的顶部。用剃刀片刮除顶部的一层薄环氧树脂。</li>
	<li>使用剃刀片沿蓝宝石圆盘边缘切出一条浅线；该切线有助于在步骤5.3中将蓝宝石圆盘与环氧树脂分离。</li>
	<li>将蓝宝石圆盘浸入液氮中约10秒，使其与环氧树脂分离。 
	注意：细胞将保留在环氧树脂中。</li>
	<li>移除蓝宝石圆盘后，使用解剖显微镜寻找含有细胞的区域（4–10倍放大倍数）。使用双刃剃刀片在目标区域周围（约2 × 2 mm）进行切割。为固定样品位置，可在样品用胶带固定于显微镜表面时进行此操作。</li>
	<li>将含有细胞的小块塑料（约2&#160;× 2&#160;× 5 mm）用含乙基氰基丙烯酸酯的胶水粘附在由环氧树脂制成的圆柱形假块上。在60 °C下孵育1小时。</li>
</ol>
6. 切片
<ol>
	<li>使用超薄切片机对样品进行切片。
	<ol>
		<li>用玻璃刀以 3 mm/s 的速度和 200 nm/切片的厚度修切塑料包埋的样品表面。从星形胶质细胞所在区域的表面切取 4 - 5 个切片。</li>
		<li>更换为金刚石刀，以 0.8 mm/s 的速度和 40 nm/切片的厚度进行切片，共切取 20 - 25 个切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片条带收集到覆盖有 0.7% 聚醋酸乙烯酯的单槽铜网上（参见材料表）。</li>
</ol>
7. 使用透射电子显微镜（TEM）进行成像
<ol>
	<li>透射电镜成像前，用甲醇配制的2.5%醋酸铀酰溶液对切片染色5分钟。</li>
	<li>在50%甲醇中清洗载网15次，随后在超纯水中清洗15次，每次清洗持续30秒。</li>
	<li>将切片短暂晾干，然后将载网放入透射电镜的样品 holder 中。</li>
	<li>以93,000倍放大倍数进行成像。</li>
	<li>采集图像。 
	注意：成像通常对时间点或基因型设盲进行，每个时间点通常采集约200张图像。</li>
</ol>
8. 图像分析
<ol>
	<li>使用软件（例如，ImageJ）和自定义宏（Watanabe, Davis, and Jorgensen，未发表）分析图像。 
	注意：记录突触处囊泡、质膜、活性区膜以及所有其他膜结合细胞器的 x/y 坐标。包含这些信息的文本文件被导出至另一软件（例如，Matlab），并使用自定义程序进一步分析数据。</li>
</ol>

<ol><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500(2015).</li>
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</ol>

开放获取出版&#160;本文由赞助&#160;由 Leica Mikrosysteme GmbH 公司生产。

该 &#34;闪光与冷冻&#34; 该方法通过光遗传学诱导特定的细胞事件，并在刺激后设定的时间点对细胞进行冷冻，从而实现对膜动态的可视化19在本演示中，我们使用了通道视紫红质（channelrhodopsin），一种对光敏感的阳离子通道，来刺激神经元，并捕获了突触末梢突触囊泡的融合与回收过程。近年来，许多光遗传学工具已被开发出来22,23，这些均与闪光-冷冻技术兼容。例如，可利用隐花色素与CIB1的光诱导异源二聚化来诱导细胞器运输24类似地，可通过光诱导磷脂酰肌醇磷酸酶向质膜的转位来改变质膜的脂质组成25此外，像偶氮苯这类对光敏感的小分子化合物会根据照射光的波长改变其构象。这种构象变化可用于激活配体门控通道，或改变膜中的脂质组成。26,27笼锁化合物也可用于诱导细胞活动。然而，当前装置所用的LED可能无法提供足够的能量以实现解笼锁，因此可能需要对系统进行进一步优化。尽管如此，这些光可激活工具的应用具有高度灵活性——许多细胞事件均可通过一束闪光来诱导。 &#34;闪光-冷冻&#34; 能够捕捉到膜动力学的动态变化。
主要存在两个局限性 &#34;闪光-冷冻&#34; 方法。首先，它捕获 &#34;快照&#34; 从不同细胞中获取某一特定事件的信息。换句话说，无法在一段时间内持续追踪单个细胞的膜动态变化。因此，为了重建任何细胞事件，必须从每个样本的每个时间点采集并分析大量图像。此外，在神经元中需要的图像数量更大，因为突触囊泡的融合仅发生在小鼠海马神经元约20–30%的突触中18,28如此庞大的数据集分析需要耗费大量时间。未来需要实现图像采集与分析的自动化，以提高该方法的效率。29,30.
第二个限制源于高压冷冻技术本身的特性。当细胞冷冻时，如果冷冻速率低于100 K/s21，细胞内的水会重新排列形成冰晶。这些冰晶可能穿透膜结构，或使溶质浓缩从而改变局部渗透压，导致膜破裂。为避免冰晶形成，需对样品施加高压（约2,000 atm）。由于过冷效应，在此压力下冷冻速率达到100 K/s即可防止水形成冰晶21。理论上，厚度达500 µm的样品也可实现无冰晶冷冻，但实际操作中约200 µm可能是极限，因为在较厚组织中容易形成立方形冰晶，从而破坏形态结构。处理厚度超过5 µm的样品时，必须使用适当的冷冻保护剂（如BSA）。然而，BSA会改变溶液的渗透压，可能影响细胞的生理反应。因此，需进行大量对照实验以验证BSA在特定系统中的适用性。即使经过高压冷冻，若样品意外从液氮浴中取出，仍可能形成冰晶。因此，必须始终将样品保存在液氮中，并使用预冷的镊子进行操作。
设计实验时，应考虑以下三个要点。第一，最大光强（460 nm谱线）为5.5 - 8.0 mW/mm2这种强度是否足以诱导细胞活动，必须在进行闪光-冷冻实验之前，通过荧光显微镜上的活细胞成像加以验证。其次，实验必须在生理温度下进行。对于小鼠海马神经元的实验，高压冷冻仪的载物台需预热至 37 °C。31最后，必须谨慎选择时间点以捕捉膜动力学变化。初步研究表明，内吞作用在刺激开始后100毫秒内完成。因此，额外设置了三个时间点（15、30、 &amp;#38; 50 毫秒）也被用于追踪膜动力学变化17,18这些时间点对于观察突触传递过程中的膜 trafficking 事件是必要的。然而，不同的细胞事件对时间点数量的要求各不相同。因此，在开始大规模数据采集之前，应先选取少量时间点进行采样。

可视化细胞内膜结构与蛋白质的动态变化是理解特定生物学过程细胞机制的关键步骤。利用光学显微镜或荧光显微镜可捕捉动态的转运事件。然而，此类图像通常缺乏完整的亚细胞背景信息，因为亚细胞结构无法被完全呈现 &#34;涂绘&#34; 通过染料或荧光探针进行染色，并在空间和光谱上实现分辨1,2另一方面，尽管电子显微镜能够以极高的细节分辨率展示亚细胞结构，但由于样品必须在成像前固定，因此无法捕捉细胞动态过程。因此，仅依赖一种成像方式通常不足以全面理解细胞动态。
为了克服光学显微镜和电子显微镜的局限性，人们开发了相关显微技术。相关光学与电子显微镜（CLEM）利用光学显微镜观察细胞内动态过程，同时结合电子显微镜揭示其背后的亚细胞结构。在 CLEM 中，经历各种生物学过程（如胞质分裂和内吞作用）3,4,5,6 的细胞首先进行活细胞成像，随后制备用于电子显微镜观察。尽管 CLEM 能够捕捉细胞内动态过程的某些方面，但该方法的应用受到四个因素的限制。第一，时间分辨率受限于细胞固定速度，通常需要数秒至数分钟，这是由于固定剂扩散和反应速度较慢所致7。第二，亚细胞结构是在事件发生后才进行观察post facto8，因此无法通过该方法捕捉动态的形态学变化。第三，由于电子显微镜样品制备过程中脱水引起的组织收缩，荧光图像与电子显微图像难以精确对齐9,10。第四，诸如胞质分裂和内吞作用等事件并非在所有细胞中同时发生5,11，因此必须从大量细胞群体中识别出正处于目标事件中的特定细胞，这一过程通常十分繁琐。因此，亟需一种新方法，能够在所有细胞中同步诱导特定事件，并在预定时间点快速固定细胞，从而捕获相应的细胞动态过程。
近年来，已开发出多种利用光来诱导特定细胞动态的工具（光遗传学）。通道视紫红质是一种来自Chlamydomonas reinhardtii的光敏感性非选择性阳离子通道12,13。当通道视紫红质在神经元膜中表达时，短暂的光脉冲可诱导钠离子流入神经元，从而触发动作电位14,15。该动作电位随后传播至突触末梢，导致突触小泡在数毫秒内发生融合16,17,18。因此，通道视紫红质可诱导神经元活动。为了在刺激后以毫秒级精度在特定时间点观察突触末梢的膜动态，必须在规定时间点固定神经元。
为了在诱导神经元活动后捕捉膜的动态变化，我们将光刺激与高压冷冻技术相结合17,18,19。高压冷冻可近乎瞬时地固定细胞，同时减少冰晶的形成20。冰晶可能破坏膜结构并扰乱亚细胞架构21。通过改变刺激与冷冻之间的时间间隔，可在动作电位诱导后捕捉到突触终末内的膜运输过程。
本文演示了一种利用商业化高压冷冻仪的实验流程，该仪器可将毫秒级时间精度的光刺激与高压冷冻技术相结合。与其他需要外部设备来控制光刺激和冷冻过程的仪器不同，该系统将光刺激完全集成于内部，能够以毫秒级精度施加刺激19。该流程包含多个步骤：1）将小鼠海马神经元培养在蓝宝石圆片上，并用携带通道视紫红质表达载体的慢病毒感染18；2）在设定的刺激后时间点对神经元进行光刺激并迅速冷冻；3）用有机溶剂置换玻璃态水，同时利用固定剂对脂质和蛋白质进行交联，以保存细胞内结构；4）样品经渗透处理后包埋于环氧树脂中；5）使用超薄切片机收集超薄切片；6）在透射电子显微镜下对薄切片成像；7）图像采集与分析过程对时间点或基因型设盲进行。通过时间分辨图像的重建，可确定细胞动态变化过程17,18。样品制备（即上述步骤2至5）约需一周时间，而后续图像分析则需要数月到一年时间。

<table><tbody><tr><td>用于光镜和电镜的冷冻置换与低温包埋系统&amp;nbsp; -AFS II</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压冷冻仪 - EM-ICE</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>EM ICE 是一种专用的高压冷冻仪，可精确控制光照刺激和冷冻过程。</td></tr><tr><td>渗透压仪</td><td>Gonotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机 UC7</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Blue M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Personna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16530</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>RT19132</td><td>有毒，仅可在经认证的化学通风橱中开启</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Emdmillipore</td><td>391340-250GM</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>49159-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>746436-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>21115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>液体环氧树脂 Eponate 12</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>双酚A环氧树脂 Araldite 502</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐（DDSA）</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>苄基二甲胺（BDMA）</td><td>Ted Pella</td><td>18241</td><td></td></tr><tr><td>专用包埋（BEEM）胶囊</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>铜网</td><td>Ted Pella</td><td>1GC12H</td><td></td></tr><tr><td>聚醋酸乙烯酯（Pioloform F）</td><td>Ted Pella</td><td>19244</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸乙酯（超级胶水）</td><td>Scotch</td><td>170497</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Themo scientific</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）</td><td>Thermo scientific</td><td>10569-044</td><td>使用前应预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Thermo scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen-Strep）</td><td>Thermo scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>氟脱氧尿苷（FUDR）</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher</td><td>S175223</td><td>应进行酸洗处理</td></tr><tr><td>蓝宝石圆盘</td><td>Technotrade</td><td>616-100</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Emdmillipore</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸（PDL）</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白</td><td>Thermo scientific</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Fisher</td><td>10888022</td><td>使用前应预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Glutamax）</td><td>Fisher</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>无血清添加剂&amp;nbsp;（B-27）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo scientific</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>每批应计算其活性单位</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>03-731-0</td><td></td></tr><tr><td>荷包牡丹碱</td><td>Tocris</td><td>01-091-0</td><td></td></tr><tr><td>Whatman I 型滤纸</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Philips CM20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

闪光-冷冻：一种利用电子显微镜捕捉膜动态的新型技术

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

细胞不断改变其膜结构和蛋白质分布，但在毫秒级的时间分辨率和纳米级的空间分辨率下观察这些事件极为困难。我们开发了一种时间分辨电子显微镜技术， &#34;闪光与冷冻，&#34; 通过光遗传学诱导细胞事件，并在刺激后特定时间点快速冷冻细胞，以观察由此产生的膜动态变化。为演示该技术，我们在小鼠海马神经元中表达了光敏感阳离子通道——通道视紫红质。短暂光刺激可激活神经元活动，并通过突触囊泡的融合引发突触末梢释放神经递质。将神经元的光遗传刺激与高压冷冻技术相结合，可追踪突触传递过程中的形态学变化。利用商用仪器，我们捕捉到了突触囊泡融合过程以及突触囊泡膜的回收现象。为呈现事件的连续过程，我们生成了大规模数据集并进行盲法分析，因为形态学变化是在不同细胞中随时间追踪的。尽管如此，闪光-冷冻技术仍可在电子显微图像中以毫秒级时间分辨率实现膜动态的可视化。

根据上述方案，我们在表达光敏通道蛋白的小鼠海马神经元中进行了“闪光-冷冻”实验。这些神经元在光照开始后15 ms或100 ms被迅速冷冻。我们先前已证明，突触小泡的胞吐和胞吞事件分别发生在15 ms和100 ms的时间点18。这些事件在相应时间点被成功捕获（图2），表明在所选的专用高压冷冻仪上可成功开展闪光-冷冻实验（参见材料表）。
<img alt="带有蓝宝石神经元层、环氧树脂包埋和刺激数据表的CLEM装置示意图。" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 高压冷冻机中的样品装载与程序设置。A) 高压冷冻机的样品装载台。中间板（插图中显示其结构细节）被放置在CLEM样品架中用于装载样品。其中一个半圆柱体置于样品装载台的底部，另一个则通过夹子固定在顶部盖板上。样品装载完成后，将中间板向前推至底部半圆柱体位置，并关闭盖子以启动冷冻过程。B) 样品组装。将含有神经元的蓝宝石圆盘放入中间板的凹槽中，细胞面朝上。在凹槽内的蓝宝石圆盘正上方放置一个100 µm的环。然后，将另一个浸有生理盐水的空白蓝宝石圆盘溶液面朝下放置。必须避免产生气泡。最后，在上方紧密叠加一个100 µm环和一个400 µm环。用滤纸吸除多余的液体。C) 包埋胶囊的横截面图，其中蓝宝石圆盘浸没在环氧树脂中。蓝宝石圆盘置于胶囊底部，细胞面朝上，并覆盖环氧树脂以进行渗透和包埋。D) 设置高压冷冻机程序以施加单次、持续10 ms的刺激。样品在光脉冲后90 ms被冷冻。E) 设置高压冷冻机程序以施加20 Hz频率下的10次刺激。样品在最后一次光脉冲后5 ms被冷冻。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光刺激后15毫秒和100毫秒时突触外排和内吞事件的电子显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠海马神经元中外排和内吞过程的可视化。 海马神经元接受一次刺激后，在指定时间点迅速冷冻。电子显微图像显示了突触小泡的外排过程 A) 和超快内吞过程 B)。PSD，突触后密度。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们开发了一种电子显微镜下的新方法， &#34;闪光与冷冻，&#34; 能够以毫秒级时间分辨率可视化膜动态变化。该技术结合了光遗传学神经元刺激与高压冷冻技术。本文中，我们演示了相关操作步骤并详细描述了实验方案。

细胞不断改变其膜结构和蛋白质分布，但在时间和……

本实验的总体目标是通过光遗传学诱导神经元活动，随后在刺激后的特定时间点快速冷冻细胞，利用电子显微镜捕捉细胞膜动态变化。该方法有助于解答神经科学和细胞生物学领域中关于突触囊泡循环机制的关键问题，甚至可能实现极短时间内生物学过程的建模。该技术的主要优势在于能够在毫秒时间尺度上，通过电子显微镜直接观察细胞内的形态学变化。该实验步骤将由本实验室的研究生 Shuo Li 和研究助理 Sumana Raychaudhuri 演示。在配制固定液之前，使用铅笔根据样本编号标记两个毫升的低温冻存管。然后混合所有固定剂试剂，并将固定剂以每瓶一毫升的量分装至各小瓶中。盖紧管盖后，立即将固定剂浸入液氮中，并将小瓶存放在密闭的泡沫箱内。接着，向自动冷冻置换装置和高压冷冻仪中充满液氮。然后将一小容器丙酮放入自动置换仪的样品室中，并等待置换仪温度降至零下90摄氏度。要设置光刺激程序，请点击触摸屏显示器上光刺激窗口中的“编辑”按钮，此时将打开另一个窗口。输入暗期为15秒，周期为100毫秒，脉冲为10毫秒，单次10毫秒刺激的周期数为1。在主界面中，确认已勾选光刺激选项，然后依次点击样本储存和编辑。在新弹出的窗口中，使用加号或减号按钮选择每个通道储存两个样本，并确认已选中储存液氮启用选项。现在，在体视显微镜下，将蓝宝石圆片有细胞的一面朝上放入黑色中板的孔中。随后放置一个100微米的间隔环。将一片空白蓝宝石圆片的一侧浸入预热的生理盐水溶液中，然后将圆片覆盖在间隔环上，使沾有生理盐水的一面朝下。再放置另一个100微米的间隔环。在最后一片蓝宝石圆盘上方放置一个400微米的间隔环，并用滤纸吸去多余的液体。在持握样品时，确保蓝宝石圆盘之间没有夹入气泡。然后将整个组件置于两个透明半圆柱体之间，合上顶部红色盖子，以启动冷冻过程。冷冻过程完成后，红色盖子会自动弹起。当所有样品均已完成冷冻后，打开储存杜瓦瓶的盖子，将杜瓦瓶转移至实验台面。将样品室从储存杜瓦瓶中取出，转移至装有液氮的专用样品托盘中。松开旋钮以取出样本杯。然后使用尖端经液氮冷却的镊子将透明的半圆柱体从样本杯中取出，并小心地将中间的黑色板状物转移至盛有液氮的小杯中。始终注意将冷冻样品保存在液氮中，并始终使用预冷的镊子操作样品。再次预冷镊子，迅速将第一块中层板转移至预冷的丙酮中。轻轻摇晃并轻敲该板，以使蓝宝石圆盘与板分离。然后将装有固定剂的敞口低温管放入置换仪的样品室中。将蓝宝石圆片转移至小瓶中，并立即盖紧瓶盖。当所有样品转移完毕后，设置适当的游离置换程序参数并启动程序。游离置换程序结束后，戴手套将冷冻样品从样品室转移至化学通风橱，并使用移液器向每个小瓶中加入室温丙酮。在1至2小时内，将每个小瓶中的洗涤液更换为新鲜丙酮，重复4到6次。然后将新配制的30%环氧树脂加入每个小瓶中，在120 rpm的摇床中室温孵育2至3小时。孵育结束后，将30%环氧树脂更换为70%环氧树脂，在摇床上继续孵育3至4小时。随后用镊子将每个圆片（细胞面朝上）转移至包埋胶囊的盖子中，并向圆片加入90%环氧树脂，在4摄氏度下孵育过夜。次日早晨，将每片蓝宝石圆片转移至新的包埋胶囊的帽盖中，并用新配制的100%环氧树脂充满帽盖。在最后一次100%环氧树脂孵育后，将样品置于60°C烘箱中聚合48小时。样品聚合完成后，将第一个样品倒置放置在体视显微镜上，使蓝宝石圆片位于树脂块的顶部，然后使用刀片从样品顶部去除一层薄薄的树脂。接下来，使用刀片沿圆盘边缘切割一条浅槽，以分离蓝宝石圆盘与环氧树脂。将圆盘浸入液氮中约10秒，使圆盘与剩余树脂分离。将树脂转移至解剖显微镜下，并用胶带将样品固定在显微镜载物台上。使用 4 到 10 倍的放大倍数找到含有细胞的区域，并使用双刃剃刀片在目标区域周围切割出一个 2×2 毫米的区域。然后使用超级胶水将细胞粘附到由环氧树脂制成的圆柱形空白块上，并将样品块在 60 摄氏度下孵育 1 小时。在超薄切片机上切片后，将样品转移至透射电子显微镜，在 930,000 倍放大倍数下进行成像。在此图像中，显示了小鼠海马神经元突触前膜活性区在光照开始后15毫秒通过胞吐作用记录到的突触小泡融合现象。光照开始后100毫秒，可在活性区附近观察到内吞凹陷，展示了神经细胞的超快内吞作用。观看本视频后，您应能较好地掌握如何利用闪光-冷冻实验处理样本。请注意，使用戊二醛、四氧化锇和液氮时可能存在极高危险性，因此务必穿戴防护服。掌握相关技术后，该实验的冷冻步骤可在数小时内完成12个样品，但后续步骤（包括成像和图像分析）可能需要数天、数周甚至数月，因此整个流程可能非常耗时。若需对蛋白质进行定位或观察其动态变化，也可采用不同的方案以保留抗原性，或保留珠光蛋白的珠光特性，并利用这些技术观察其动态行为。

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