闪光-冷冻：一种利用电子显微镜捕捉膜动态的新型技术

本实验的总体目标是通过光遗传学方法诱导神经元活动，随后在刺激后的特定时间点快速冷冻细胞，利用电子显微镜捕捉细胞膜动态变化。该方法有助于解答神经科学和细胞生物学领域中关于突触囊泡循环机制的关键问题，甚至可能实现超快速时间尺度下的动态建模。该技术的主要优势在于能够在毫秒级时间尺度上，通过电子显微镜直接观察细胞内的形态学变化。

该实验操作将由本实验室的研究生 Shuo Li 和研究助理 Sumana Raychaudhuri 演示。在配制固定剂之前，使用铅笔根据样本编号标记两支毫升级低温冻存管。

然后将所有固定剂试剂混合，并将固定剂每份一毫升分装至各小瓶中。盖紧管盖后，立即将固定剂浸入液氮中，并将小瓶存放在密闭的泡沫箱内。接着，向自动冷冻置换装置和高压冷冻仪中注入液氮。

然后将一个盛有丙酮的小容器放入自动置换仪的样品室中，并等待置换仪的温度降至零下90摄氏度。要设置光刺激程序，请点击触摸屏显示器上光刺激窗口中的“编辑”按钮，另一个窗口将随之打开。

暗期输入15秒，周期输入100毫秒，脉冲输入10毫秒，单次10毫秒刺激的周期数输入1。

在主界面中，确认已勾选光刺激选项，然后依次点击标本储存和编辑。在新弹出的窗口中，使用加号或减号按钮选择每个通道储存两个标本，并确认已选中启用储存液氮选项。现在，在体视显微镜下，将蓝宝石载样盘细胞面向上放置于黑色中板的孔中。

随后放置一个100微米的间隔环。将一片空白蓝宝石圆片的一侧浸入预热的生理盐水溶液中，然后将圆片覆盖在间隔环上，使含生理盐水的一面朝下。再放置另一个100微米的间隔环。

在最后一片蓝宝石圆盘上方放置一个400微米的间隔环，并用滤纸去除任何多余的液体。在持取样品时，确保蓝宝石圆盘之间没有夹入气泡。然后将整个组件置于两个透明半圆柱体之间，并合上顶部的红色盖子以启动冷冻过程。

冷冻过程完成后，红色盖子会自动弹起。当所有样品都已冻结后，打开储存杜瓦瓶的盖子，将杜瓦瓶转移至实验台。将样品室从储存杜瓦瓶转移至装有液氮的专用样品托盘中。

松开旋钮以取出样本杯。然后使用尖端经液氮冷却的镊子将透明的半圆柱体从样本杯中取出，并小心地将中间的黑色板状物转移至盛有液氮的小杯中。

始终注意将冷冻样品保存在液氮中，并始终使用预冷的镊子操作样品。再次预冷镊子，迅速将第一块中间板转移至预冷的丙酮中。轻轻摇晃并轻敲该板，以使蓝宝石圆盘与板分离。

然后将装有固定剂的敞口低温管放入置换装置的样品室中。将蓝宝石圆片转移至小瓶内，并立即盖紧瓶盖。

当所有样品转移完毕后，设置适当的游离置换程序参数并启动程序。游离置换程序结束后，戴手套将冷冻样本从样品室转移至化学通风橱，用移液器向每个小瓶中加入室温丙酮。在一至两小时内，将每个小瓶中的洗涤液更换为新鲜丙酮四到六次。

然后向每个小瓶中加入新配制的30%环氧树脂，在室温下于120 rpm的摇床中孵育2至3小时。孵育结束后，将30%环氧树脂更换为70%环氧树脂，在摇床上继续孵育3至4小时。随后用镊子将每个圆片（细胞面朝上）转移至包埋胶囊的盖子中，并向圆片上加入90%环氧树脂，在4°C条件下孵育过夜。

第二天早晨，将每一片蓝宝石圆盘转移至新的包埋胶囊的帽部，并用新配制的100%环氧树脂充满帽部。在最后一次100%环氧树脂浸润后，将样品置于60°C的烘箱中聚合48小时。样品聚合完成后，将第一个样品倒置放在体视显微镜上，使蓝宝石圆盘位于树脂块的顶部，然后用剃刀片从样品顶部去除一层薄薄的树脂。

接下来，使用刀片沿圆盘边缘划出浅切口，以将蓝宝石圆盘与环氧树脂分离。将圆盘浸入液氮中约10秒，使圆盘与剩余的树脂分离。将树脂转移至解剖显微镜下，并用胶带将样品固定在显微镜载物台上。

使用 4 至 10 倍放大倍数找到含有细胞的区域，并用双刃剃须刀片在目标区域周围切割出一个 2 毫米 × 2 毫米的区域。然后使用超级胶水将细胞粘附到由环氧树脂制成的圆柱形假块上，并将该假块在 60°C 下孵育 1 小时。在超薄切片机上切片后，将样品转移至透射电子显微镜，在 930,000× 放大倍数下进行成像。

在此图像中，显示了小鼠海马神经元突触前膜活性区在光照开始后15毫秒时通过胞吐作用记录到的突触小泡融合现象。光照开始后100毫秒，可在活性区附近观察到一个内吞凹陷，展示了神经细胞的超快内吞作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用闪光-冷冻实验处理样本。

请注意，使用戊二醛、四氧化锇和液氮时可能非常危险，因此务必穿戴防护服。一旦掌握，该方案的冷冻部分可在几小时内完成12个样品的处理，但其余步骤（包括成像和图像分析）可能需要数天、数周甚至数月，因此整个流程可能相当耗时。如果需要对蛋白质进行定位或观察其动态变化，也可采用不同的方案来保留抗原性，或保留珠光蛋白的珠光特性，并利用这些技术观察其动态行为。