细胞外基质的糖蛋白质组学：一种利用质谱进行完整糖肽分析的方法

本方案的总体目标是分析心血管组织中细胞外基质蛋白的组成，包括鉴定糖基化位点以及糖链形式的组成特征。该方法有助于回答组织纤维化过程中的关键问题，例如结构基质蛋白的糖基化如何影响心血管疾病中的组织纤维化。该技术的主要优势在于，与以往仅分析整体糖基化变化的方案不同，它能够对结构基质蛋白特定部位的糖基化进行表征，从而为后续更精准的机制研究提供工具。

本实验操作将由本实验室的 Dr. Marika Fava 和 Ms. Ferheen Baig 示范。开始此操作前，请按照文本方案中所述配制所有提取缓冲液。接着，使用手术刀将 20 至 50 毫克组织切成三到四个约 2 毫米大小的小块。

将切碎的组织放入一个1.5毫升离心管中，加入500微升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。每次使用500微升PBS，共洗涤组织五次，以最大程度减少血液污染。将洗涤后的样品转移至带螺口盖的1.5毫升离心管中，并加入相当于组织重量10倍体积的氯化钠缓冲液。

室温下以最低转速涡旋振荡一小时。然后将提取物转移至新的离心管中，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。用新鲜的氯化钠缓冲液短暂洗涤所得的组织沉淀。

此后，加入相当于组织重量10倍体积的SDS缓冲液，在室温下以最低转速涡旋振荡16小时。将提取液转移至新的离心管中，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。用双蒸水洗涤所得沉淀。

加入相当于组织重量五倍体积的盐酸胍缓冲液，室温下最大速度涡旋振荡72小时。将所得提取物转移至新管中，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。蛋白定量后，每个样本分别取10微克分装至新管中，用于糖基化位点占用率检测，另取50微克分装至另一管中，用于直接糖肽分析。

向每个样品中加入10倍体积的乙醇，并在20摄氏度下孵育过夜。第二天，在4摄氏度下以16,000 × g离心30分钟。小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀的沉淀物。

然后使用真空浓缩仪在室温下将沉淀物干燥15分钟。向每个样品中加入10 µL已配制好的去糖基化缓冲液。将样品管放入一个50 mL的锥形管中，并在25 °C下以45度角孵育2小时。

此后，将温度升至 37 摄氏度，在轻微振荡条件下孵育 36 小时。在 16,000 ×g 条件下离心 1 分钟后，于室温下使用真空浓缩仪浓缩 45 分钟以蒸发水分。用 10 微升含有 50 单位/毫升 PNGase F 的 O-18 标记水重新悬浮干燥的样品，在 37 摄氏度下持续振荡孵育 36 小时，然后对所有样品进行溶液内胰蛋白酶消化，并进行 C-18 净化处理。

首先，向 C-18 离心板的每个孔中加入 200 µL 甲醇，以活化树脂。在 1,000 ×g 条件下离心 1 分钟。然后向每个孔中加入 200 µL 水相中含 80% ACN 和 0.1% TFA 的溶液，在 1,000 ×g 条件下离心 1 分钟。

接下来，向每个孔中加入 200 微升含有 1% 乙腈和 0.1% 三氟乙酸的水溶液，然后在 1,000 ×g 条件下离心 1 分钟。重复加入该溶液并离心两次。随后，将样品加入离心板的孔中，在 1,500 ×g 条件下离心 1 分钟。重新收集穿流液，并重复离心步骤。

然后向每个孔中加入 200 微升含有 1% ACN 和 0.1% TFA 的水溶液，并在 1500 × g 下离心 1 分钟。重复加入该溶液并离心两次。接着，向每个孔中加入 170 微升含有 50% ACN 和 0.1% TFA 的水溶液，并在 1500 × g 下离心 1 分钟。

重复上述加样和离心步骤一次。使用真空浓缩仪在室温下干燥合并的洗脱液，持续两小时。将干燥后的样品于 -80 摄氏度保存，直至使用。

此后，对拟用于糖基化位点占有率评估的样品进行液相色谱-串联质谱分析。对于拟进行直接糖肽分析的样品，首先按照文本方案中所述的标准步骤进行TMT零标记。开始时，向每个含有10 µL TMT零标记样品的管中加入50 µL提供的结合缓冲液。

然后，取50 µL均一的糖捕获树脂悬液分装至新的1.5 mL离心管中，在2500 ×g条件下离心1分钟。弃去上清液，使用移液器向含有树脂沉淀的离心管中加入60 µL样品与结合缓冲液混合。室温下以1200 rpm振荡孵育20分钟。在2000 ×g条件下离心2分钟后，将上清液转移至新的离心管中。

此后，使用移液器向每个树脂管中加入 150 µL 洗涤缓冲液，并混匀以开始洗涤过程。在室温下以 1200 RPM 振荡孵育 10 分钟。在 2500 ×g 条件下离心 2 分钟后，将各上清液转移至相应的上清液储存管中，以完成洗涤。

重复此洗涤步骤两次。接着，加入 75 µL 洗脱缓冲液，并用移液器混匀。在室温下孵育 5 分钟，同时以 1200 RPM 振荡。

在2500 × g条件下离心两分钟，并将每份上清液转移至新的1.5毫升离心管中。使用移液器加入75 µL洗脱缓冲液并混匀，然后重复样品的孵育和离心步骤。将每份洗脱液转移至对应的离心管中。

将合并的洗脱液在2500 × g条件下离心2分钟，随后将每份上清液转移至新的离心管中，以确保完全去除树脂。此后，使用真空浓缩仪在室温下干燥洗脱液2小时。将干燥后的糖肽重新溶解于15 µL含2% ACN和0.5% TFA的双蒸水中。

然后，按照文本方案中所述进行质谱分析。在本研究中，心血管组织的细胞外基质（ECM）蛋白被制备用于液相色谱-串联质谱分析，以检测ECM成分以及进行间接和直接糖肽分析。核心策略基于依次使用氯化钠、SDS和盐酸胍孵育，随后进行间接或直接糖肽分析。

通过银染法在双-Tris丙烯酰胺凝胶上监测提取效率以进行可视化。在所运行的三种提取物中，大部分细胞外基质糖蛋白出现在盐酸胍分装样品中。细胞外基质糖蛋白沿其结构带有长而重复的氨基糖胺聚糖链，以及短而多样的N-连接和O-连接寡糖链。

通过添加可消化氨基聚糖的酶以及靶向较小N-连接和O-连接寡糖的酶，可观察到去糖基化的效率。随后，通过检测NXT或NXS序列模体中天冬酰胺残基的脱酰胺化及其标记的氧18，来鉴定糖蛋白。此处展示的是核心蛋白聚糖（decorin）肽段的代表性HCD串联质谱图，其中第二个天冬酰胺位于第11位并发生脱酰胺化。

随后使用HCD和ETD碎裂技术分析富集糖蛋白的ECM提取物。ETD串联质谱可用于表征糖链组成。掌握该技术后，整个过程大约需要两到三周时间。

这种糖蛋白质组学方法使我们不仅能够基于蛋白质组的变化，还能结合糖基的组成，深入探究纤维化功能的生理与病理机制。观看本视频后，您应能充分掌握如何通过质谱技术开展蛋白质糖基化研究的样品制备流程。尽管该方法可用于心血管疾病的研究，但也同样适用于其他涉及纤维化的病理过程，如呼吸系统疾病或癌症。