Name: 微孔阵列平台中微生物群落发展的组装与跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解利用硅微孔阵列高通量分析受限环境中多成员微生物群落的方法。该技术可同时追踪数千个群落的动态，揭示空间约束对微生物成员丰度和组织的影响，为工业、医学和环境科学提供重要见解。

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微孔阵列在美国能源部基础能源科学办公室纳米相材料科学用户设施中心制造并表征。本研究工作得到了橡树岭国家实验室主任研究与开发基金的资助。作者还要感谢华盛顿大学西雅图分校J. Mougous实验室提供本研究中使用的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株。

1. 硅微孔阵列的制备
<ol>
	<li>聚对二甲苯涂层
	<ol>
		<li>加入1-1.5 µm 在硅晶圆上使用商用派瑞林涂层系统，按照制造商的规格和说明进行派瑞林N的沉积（参数设置：汽化器设定值 = 160 °C；炉温设定值 = 650 °C). 
		注意：将约 6 g 的聚对二甲苯 N 型装入腔室，可获得 1-1.5 µm 厚</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光刻技术
	<ol>
		<li>将已涂覆聚对二甲苯N的晶圆用附着促进剂进行旋涂，该促进剂由20%六甲基二硅氮烷（HMDS）和80%丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）组成（参见 材料表以 3,000 rpm 转速离心 45 秒。用 2 mL 移液器吸取粘附促进剂，均匀滴加至整个晶圆表面。静置约 10 秒后，再旋转甩干。</li>
		<li>用2 mL移液管吸取正性光刻胶（参见 材料清单）并在晶圆中心滴加光刻胶。以3,000 rpm转速旋转45 s，得到厚度约为 1.5 µm 厚</li>
		<li>在热板上软烘样品 115 °C 1 分钟。</li>
		<li>使用接触式光刻机和带有目标孔图案的光掩模，将样品暴露于紫外光下。通过图案化光掩模对旋涂晶圆曝光6秒，使曝光剂量约为60–80 mJ/cm²。2 在365 nm处测定。</li>
		<li>通过将样品浸入显影剂中来显影图案（&lt; 3% 四甲基氢氧化铵水溶液；参见 材料表）2 分钟。用去离子水冲洗，并用洁净、干燥的氮气吹干。 
		注意：在显影过程中，应清除暴露于紫外光下的光刻胶区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应离子刻蚀
	<ol>
		<li>使用氧气等离子体刻蚀去除暴露的聚对二甲苯，直至硅基底。 
		注意：可根据需要调整配方以改变聚对二甲苯的蚀刻速率。适用于1至2微米之间的聚对二甲苯厚度。 5 µm，使用60 mTorr的工艺参数， 20 °C，100 sccm O2，10 W 射频功率和 2,000 W 电感耦合等离子体功率在反应离子刻蚀（RIE）设备上进行。刻蚀并去除暴露的聚对二甲苯层后，所得图案区域（即暴露的硅表面应呈现闪亮的银色。</li>
		<li>使用深度反应离子刻蚀（DRIE； 例如， Bosch DRIE 刻蚀工艺用于在硅中进行刻蚀。 
		注意：蚀刻速率和持续时间将决定孔洞的深度。博世工艺的一个完整循环（3 秒沉积步骤：20 mTorr， 15 °C，140 sccm C4 F8，10 W 射频功率，1,750 W 电感耦合等离子体，随后进行10秒刻蚀过程：20 mTorr， 15 °C，120 标准立方厘米每分钟 SF6，8 W 射频功率，1,750 W 等离子体功率）对应于约 1 µm 蚀刻深度。本演示中使用的孔深度范围为 3 - 3.5 µm 深</li>
		<li>使用物理轮廓仪验证蚀刻深度。
		<ol>
			<li>将样品载入物理轮廓仪（参见 材料表).</li>
			<li>打开样品真空并按下手动装载按钮。</li>
			<li>按“聚焦”按钮将系统对准样品。在视图屏幕上定位一个适合测量的特征区域。</li>
			<li>扫描样品。调整轮廓线并测量特征深度。</li>
			<li>记录刻蚀速率，并调节后续刻蚀时间以达到所需深度。 
			注意：测量内容将包括硅微腔的深度、沉积聚对二甲苯的厚度以及光刻胶的厚度。在整个工艺过程中验证各层厚度对于获得精确的微腔深度至关重要。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细菌培养与接种（图1a）
<ol>
	<li>从甘油菌种中在Luria肉汤（LB）琼脂平板上启动菌落，并在两周内使用。从LB琼脂平板上挑取所需菌株的菌落，接种P. aeruginosa的过夜培养物。在R2A培养基中，于37 °C、220 rpm振荡条件下培养过夜，时间约为18小时。 
	注意：为确保突变和荧光报告基因得以保留，应在平板接种后两周内挑取菌落。P. aeruginosa的所有操作均应在BSL-2条件下进行。</li>
	<li>使用金刚石刻划刀将硅晶圆切割成单个芯片，每个芯片包含不同尺寸和间距的微孔阵列。确保每块芯片均包含研究所需全部规格的微孔尺寸和间距组合。</li>
</ol>
<img alt="微流控装置制备示意图；包含层组装及孔隙分布分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：装置制备与细胞接种流程。（a）将微孔阵列蚀刻至涂覆有一层薄聚对二甲苯（parylene）的硅晶圆上（i）。为润湿微孔和/或对表面进行功能化处理，将蛋白溶液以液滴形式加在阵列表面（ii）。去除蛋白溶液后，将晶圆干燥，并加入含有目标细菌的新溶液（iii）。经过孵育后移除细菌溶液，晶圆自然干燥，使细菌保留在微孔及表面（iv）。通过聚对二甲苯剥离法去除表面附着的细菌，仅保留被干净接种于微孔内的细菌；由于使用含2%甘油的培养基，可保持微孔湿润，使细菌仍保持活性（v）。随后将硅芯片的阵列面朝下放置于涂有琼脂糖凝胶的玻璃盖玻片上，以支持微孔内细菌的生长（vi）。（b）单个硅器件上子阵列的布局。每个子阵列包含一组相同尺寸的微孔。所有子阵列中的微孔直径范围为5–100 µm，按2倍、3倍或4倍孔径间距排列，底部示意图中以从白色到深灰色的颜色表示。当微孔深度较浅（&lt;10 µm）时，5 µm和10 µm直径的微孔通常难以有效利用，主要是由于极少有细胞定植于这些极小的孔中。本研究中仅分析了直径为15–100 µm微孔的数据。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
注意：如图所示 图1b一个完整的芯片包含多个微孔亚阵列，微孔直径范围为5至 100 µm，具有三种不同的螺距（即 2倍、3倍和4倍直径，重复4次。
<ol start="3">
	<li>在芯片阵列上加入150 µL含500 µg/mL牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液液滴，以润湿微孔。将芯片置于湿润环境中，室温孵育1小时。
	<ol>
		<li>通过在空移液枪吸头盒底部加入磷酸盐缓冲液（PBS）来构建湿润环境。 
		注意：可使用其他物质（如特定凝集素）替代BSA，以实现微孔表面的功能化修饰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在硅芯片与BSA溶液孵育的同时，将菌液在2,500 rpm（相当于平均950 × g）条件下离心5分钟，随后用500 µL含2%甘油的新鲜R2A培养基重悬菌体。
	<ol>
		<li>使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定菌液的OD值，并用含2%甘油的R2A培养基将其调整至OD值为0.02。 
		注意：甘油有助于在聚对二甲苯剥离过程中防止微孔干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，移除BSA溶液，并用PBS反复冲洗芯片表面3次（每次更换覆盖在硅微孔阵列上的液滴），然后用氮气吹干。</li>
	<li>向置于湿润室中的干燥芯片阵列各加入150 µL OD值为0.02的菌液。于4 °C孵育1小时，使细菌附着于微孔壁上。 
	注意：孵育过程无需使用冰箱。采用4 °C孵育的目的是在成像开始前抑制细菌生长，以便观察菌群在生长前的空间分布结构。也可采用室温孵育。两种孵育方式所得的生长曲线相似。</li>
</ol>
3. 显微镜设置
<ol>
	<li>在开始将细菌接种到硅芯片上之前，先打开载物台环境控制腔室（参见材料表），并调节控制盒上的设置，使湿度（约100%）和温度（30–32 °C，见步骤3.2）在加入样品前预先达到平衡。</li>
	<li>调平样品架，并用PBS浸湿的实验擦拭纸（参见材料表）沿样品周围内壁铺设，以提高腔室内湿度至露点。将腔室温度设为30 °C，腔室盖温度设为32 °C，以减少成像平面上的冷凝。 
	注意：载玻片架可配合约1 cm厚的垫圈装入活细胞培养腔室中。通过将气泡水平仪放置在样品架顶部辅助调平。样品架可轻微倾斜，同时仍能在垫圈内保持密封状态以实现水平。</li>
	<li>在培养物于硅芯片上孵育期间，至少在成像前30分钟手动打开汞灯电源开关。手动开启相机和自动显微镜载物台。打开用于控制显微镜及外设的软件，并确认软件已识别相关设备。 
	注意：放大倍数为10X，数值孔径NA = 0.3。</li>
</ol>
4. 琼脂糖包被玻璃盖玻片的制备
<ol>
	<li>微波加热先前配制的琼脂糖溶液（即 2% 琼脂糖的 R2A 培养基加热至液态，约需 60 s。</li>
	<li>用乙醇润湿一块 75 mm x 22 mm、#1.5 玻璃盖玻片的背面，将其沿长边方向居中放置于一块 2 x 3 英寸（50 x 75 mm）的载玻片上。沿盖玻片的两条长边各放置一个 PDMS 间隔物（厚度约 1 mm），并移动玻璃盖玻片，使其约有 1 mm 的部分悬伸出载玻片边缘。</li>
	<li>在玻璃盖玻片上倒入5 mL液体琼脂糖溶液，用量以完全覆盖盖玻片为宜，然后将另一张2 × 3英寸的玻璃载片置于组装结构上方，使液体琼脂糖夹在盖玻片与载片之间，形成“三明治”结构。 
	注意：这用于控制琼脂糖的厚度，使盖玻片和凝固琼脂糖的总厚度与PDMS间隔片的厚度相等。</li>
	<li>让载玻片-盖玻片-琼脂糖凝胶-载玻片夹心结构静置，直至琼脂糖溶液开始凝固；然后将其转移至冰箱。15分钟后，去除多余的固体琼脂糖，并沿盖玻片边缘进行切割。将此结构转移至洁净的培养皿中，置于冰箱中保存备用。</li>
</ol>
5. 使用琼脂糖包被的盖玻片封固孔板并进行成像
<ol>
	<li>细菌孵育期结束后，从冰箱中取出涂有琼脂糖的盖玻片，并按如下步骤准备硅芯片。
	<ol>
		<li>将硅片逐片浸入超纯水中，每片 10 秒。取出后将硅片竖立放置在实验室擦拭纸上或纸巾上，直至芯片边缘的大部分多余液体流尽。</li>
		<li>裁剪一段与每个硅芯片边长相匹配的胶带。将胶带贴在覆盖于硅片表面的聚对二甲苯上，迅速将其剥离，以去除聚对二甲苯涂层。</li>
		<li>立即将每张去膜芯片倒置，并将其放置在琼脂糖包被的盖玻片上，使芯片的微孔阵列面朝下并与琼脂糖包被面接触。芯片一旦接触琼脂糖，应避免移动或滑动，以防止细菌在微孔外生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组装好的微孔阵列/琼脂糖盖玻片放入显微镜载物台顶部环境控制培养箱的载片架中。
	<ol>
		<li>使用环境光或定向光（例如， 使用手电筒）定位感兴趣的阵列。使用控制自动载物台的商用软件保存这些位置（参见材料表）。在位置保存后关闭环境光或定向光源。</li>
		<li>在商业软件中，打开“ND Acquisition”面板。 
		注：该面板包含自动保存至特定目录的菜单，以及可编程的图像采集功能。在本实验中，使用“Time”、“XY”和“λ”菜单。</li>
		<li>为在软件中保存位置，单击“XY菜单”，然后为每个需要保存的位置在左侧勾选一个空白框。同时，单击“包含Z”按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在所需波长下，使用适当的荧光滤光镜组（见材料表），以10倍放大倍数随时间采集图像。
	<ol>
		<li>使用控制软件和已保存的阵列位置，移动至每个已保存的位置并对焦到各孔。在已保存的列表中单击每个XY位置，并使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片调节对焦。通过单击指向z位置的箭头来保存新的z位置。 
		注意：此过程可能耗时较长。建议采取预防措施，提高增益并使用中性密度滤光片降低光照强度，以防止荧光淬灭。</li>
		<li>通过记录在聚焦于阵列表面时z轴位置的差异，确定每种波长下焦平面之间的z轴距离。从含有混合红/绿细菌种群的阵列中选择2-3个位置，并使用红色荧光蛋白（RFP）滤光片进行聚焦。
		<ol>
			<li>使用 GFP 和 RFP 荧光滤光片测量焦平面之间的距离，然后在“λ”菜单下添加相应的焦平面校正值。 
			注意：例如，如果在 z 位置为 50 µm，且同一阵列在RFP通道中也呈现清晰对焦 55 µm，在“λ”菜单中的RFP光学配置旁添加+5。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>开始进行延时成像采集。 
		注意：本实验中，使用商业软件控制相机、快门、滤光轮和电动载物台，通过多维图像采集，每隔30分钟对每个阵列位置采集一次RFP和GFP图像。
		<ol>
			<li>在"时间"菜单下，将"间隔"设置为30分钟，"实验持续时间"设置为24小时。点击"立即运行"。 
			注意：选中“时间”、“XY”和“λ”选项后，运行程序将移动载物台以对每个位置进行成像即 保存的XYZ位置），在单一波长下采集图像，调整z轴位置以校正焦平面差异（即， λ或波长控制），拍摄第二张图像，移至下一个阵列位置（多点），并以30分钟间隔循环此步骤（延时成像）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取照明控制图像。 
	注意：使用“ND Acquisition”、“Time”和“XY”菜单对4个位置各拍摄25倍图像。
	<ol>
		<li>通过关闭所有光源并对标准载玻片拍摄“图像”，连续采集100张“暗场”图像。这些图像将捕获相机噪声。使用延时成像过程中所用的最长曝光时间（步骤5.3.3）。</li>
		<li>通过成像标准载玻片，连续采集100张“照明场”图像即 在不同位置选择若干点（具有均匀的 RFP 或 GFP 强度）以获取在特定实验条件下不均匀照明的情况。选择能够最大化信号但未达到饱和的曝光时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 分析
<ol>
	<li>使用图像分析软件处理图像序列例如， ImageJ
	<ol>
		<li>使用商业软件将获取的图像转换为 TIFF 文件格式。通过点击“File”将图像上传至图像分析软件&gt; 导入&gt; 图像序列。</li>
		<li>通过平均所有“暗场”和“照明场”图像创建“校正图像”。选择“Process”（处理），将平均暗场图像从平均照明场图像中减去。 &gt; “图像计算器”中，选择两幅图像“Image1”和“Image2”，在“操作”字段中选择“减去”。点击“确定”。
		<ol>
			<li>用于平均时，加载校正（或暗场）图像，点击“Image” &gt; “堆叠” &gt; Z计划 &gt; 平均投影</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如有需要，执行图像配准。然后，单击“Process”执行背景扣除。 &gt; “减去背景。”输入一个半径（例如， 125）在“半径”字段中输入，并选择“滑动抛物面”。</li>
		<li>使用“Process”进行照明校正 &gt; “计算器 Plus。” 选择以下参数：运算方式为“除”；i1 为“孔图像”；i2 为“校正图像”；k1 为“校正图像均值”；k2 为 0。点击“创建新窗口”。 
		注意：本数据集无需进行注册，但在其他工作中，使用了 ImageJ 插件 StackReg，并采用“平移”变换。对于背景减除，每个图像集应使用相同的滑动抛物面半径。例如，若成像的最大孔径像素半径为 100，则应使用大于 100 的半径（例如， 125）每组图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定各菌株在微孔中的生长情况。
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 的“MicroArray”插件，在目标阵列中每个微孔周围选择感兴趣区域（ROIs）。
		<ol>
			<li>在“MAP”菜单中，单击“Reset Grid”。根据阵列上的孔尺寸和数量设置行数、列数和直径（参见 图1b）。从“ROI 形状”菜单中选择“圆形”。</li>
			<li>按住“Alt”键的同时用鼠标选择左上角的感兴趣区域（ROI），以移动ROI阵列。按住“Shift”键的同时选择阵列左下角的ROI，以改变阵列的大小。按住“Shift”键的同时选择阵列右侧（非角落位置）的ROI，以调整ROI之间的间距。</li>
			<li>使用上述命令将 ROI 阵列覆盖在图像中的孔上。点击“测量 RT”。 
			注意：该插件将从每个感兴趣区域（ROI）导出所需的测量值。使用三种 ROI 大小，围绕孔周围创建同心环，以采集局部背景信号即， 中间环信号从外环信号中减去）以及荧光测量（即， 来自内环的信号）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在电子表格软件中收集数据并计算背景信号。将其导入自定义脚本软件进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据整理与分析
	<ol>
		<li>导入数据，并将 ImageJ 中收集的数据按以下顺序整理为矩阵，涵盖所有时间点：第1列，子阵列编号；第2列，孔板行；第3列，孔板列；第4列，平均荧光强度；第5列，背景强度；第6列，平均荧光强度减去背景强度。
		<ol>
			<li>将 mCherry 和 GFP 采集结果分别分离到不同的矩阵中。将每个子阵列和每种颜色的结果分别存储在细胞数组的不同单元中。 
			注意：这种组织方式使得在图像数据与测量结果之间来回切换更加简便，有助于数据清理，并确保测量结果能够准确反映数据。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>调节自发荧光的影响 P. aeruginosa. 
		注意：在涉及GFP和mCherry菌株共培养的实验中，应分析仅含mCherry的芯片，以确定mCherry与绿色自发荧光之间的关系。
		<ol>
			<li>绘制所有时间点下 mCherry ΔretSΔtse/i1-6 孔的 mCherry 与 GFP 信号关系图，以确定 mCherry 信号与 GFP 通道中自发荧光之间的关系。从共培养样本中减去自发荧光信号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>绘制轨迹，并对每条轨迹拟合修正的逻辑方程，使用电子表格软件或自定义脚本软件通过最小二乘法拟合提取参数。</li>
		<li>寻找GFP和mCherry轨迹参数之间及内部的相关性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种微孔阵列装置及实验方案，旨在实现基于活细胞成像的细菌群落发育的高通量、高内涵分析。尽管本研究的示范重点在于探讨接触依赖性的VI型分泌系统对群落发育的影响，但该阵列设计具有灵活性，可适用于广泛微生物群落及微生物间相互作用的研究。本研究仅聚焦于使用持续表达荧光标记物的细菌，以便于追踪群落成员的丰度与位置。然而，在生长过程或通过改变化学环境进行扰动后，原则上可从单个微孔中取样生物材料，用于鉴定群落组成及基因表达情况。
每个硅基装置由数十个微孔阵列组成，阵列中微孔的孔径各异，按2倍、3倍或4倍孔径间距排列，刻蚀深度介于3之间 &amp;#38; 3.5 µm。由于营养物质和次级代谢产物可以自由穿过琼脂糖盖层并在其内部扩散，芯片中设置了不同间距的微孔亚阵列，以便研究微孔之间的信号传递或局部营养耗竭如何影响群落发育。在本实验中，微孔间距或其在阵列中的位置似乎并未对生长和群落发育产生明显影响。选择较浅的深度是为了简化图像分析，使所有微生物的生长和发育均限制在单一成像平面内。然而，此前已有研究使用更深的微孔（深度达20 µm），且通过调节硅刻蚀过程的持续时间可轻松调控微孔深度。增加微...

微生物群落的形成既受到确定性因素（如环境结构）的影响，也受到随机过程的影响，后者与细胞死亡、分裂、蛋白质浓度、细胞器数量以及突变相关1。在自然环境中，几乎无法区分这些因素对群落组成和活性各自的独立影响。由于自然结构的遮蔽以及化学和生物环境的复杂性，在自然环境中识别群落成员并进一步解析其时空分布极为困难。尽管如此，近年来的研究强调了空间组织对群落功能的重要性，并指出在持续的研究中需要同时考虑群落成员的丰度及其空间组织2,3,4。
显然，局部化学环境（即&#160;营养物质和次级代谢产物的可利用性）、物理结构（例如，土壤结构、植物根系、海洋颗粒或肠道微绒毛）、氧气的存在与否，以及致病物种的引入，均会影响微生物群落的组成、结构和功能5,6,7,8,9,10,11。然而，传统的培养技术往往忽略这些因素，却仍占主导地位。群落组成（例如，相互依赖物种的存在）、物理附着、信号分子浓度以及细胞间的直接接触，都是塑造微生物群落的重要因素，但在常规培养条件下这些特性可能丢失。这些特性在大量液体培养或琼脂平板上难以重现。然而，微流控、微图案化和纳米制造技术的发展使得研究人员能够复制自然环境中的关键物理和化学特征，从而构建细菌群落以研究其相互作用12,13,14，并开发出模拟自然条件的合成环境4,15,16,17,18,19,20。
本方案描述了一种微孔阵列装置的制备方法，并提供了详细的实验步骤，可用于对阵列中的微孔进行功能化处理，并在其中培养细菌，既可培养单一物种菌落，也可构建多物种菌群。本研究还展示了如何利用经改造后表达荧光报告蛋白的细菌，随时间监测微孔内细菌的生长情况。此前已有研究报道过类似的阵列装置，并证明了该系统可用于追踪单一物种菌落的生长过程 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）铜绿假单胞菌)&#160;在微孔中。通过调节孔的大小和接种密度，可并行改变数千个生长实验的起始条件，以确定初始接种条件如何影响细菌的生长能力21本研究采用了一种经过轻微改进的微孔阵列，该阵列在先前研究的基础上实现了多个阵列的同步比较，并采用了更为稳健的实验方案。本研究所用的阵列包含多个子阵列，即阵列集合，其孔径尺寸各不相同，范围为15 - 100 µm，按三种不同的间距排列即&#160;2x、3x 和 4x 井直径）。阵列被蚀刻到硅材料中，通过用载玻片密封阵列来支持接种细菌的生长，该载玻片表面涂有浸润培养基的琼脂糖凝胶。 P. aeruginosa 用于本演示的突变体旨在研究VI型分泌系统。
本文展示的结果朝着在微孔阵列中分析多成员群落的最终目标迈进了一步，使研究人员能够监测细菌的丰度与空间组织 原位 在控制和探测化学环境的同时，这最终应能提供对相关问题的深入理解 &#34;规则&#34; 调控群落发育与演替的机制。

<table><tbody><tr><td>聚对二甲苯N</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>CAS 号：1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>聚对二甲苯镀膜仪</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Labcoter 2 Parylene 沉积单元 PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>WRS Materials</td><td>直径100mm，厚度500-550&amp;mu;m，正面级，电阻率10-20，N/磷掺杂&amp;lt;100&gt;</td><td></td></tr><tr><td>附着力促进剂</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 附着力促进剂</td><td></td></tr><tr><td>正性光刻胶</td><td>Rohm and Haas 电子材料有限公司（隶属于陶氏）</td><td>Microposit S1818 正性光刻胶（货号 10018357）</td><td></td></tr><tr><td>Quintel 接触式光刻对准仪</td><td>Neutronix Quintel 公司</td><td>NXQ 7500 掩模对准仪</td><td></td></tr><tr><td>反应离子刻蚀设备</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasmalab System 100 反应离子刻蚀机</td><td></td></tr><tr><td>R2A 培养基</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire，2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>自动载物台</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>载物台顶部环境控制腔室</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 盖玻片</td><td>Nexterion</td><td>高性能 #1.5H 盖玻片</td><td></td></tr><tr><td>荧光参考标准片</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>物理探针轮廓仪</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>实验室擦拭纸</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE 品牌，34155</td><td></td></tr><tr><td>商用软件</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>Nikon</td><td>Nikon FITC (96311)，Nikon Texas Red (96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

微孔阵列平台中微生物群落构建与追踪

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

微生物群落的形成依赖于多种复杂的确定性与随机性因素的共同作用，这些因素会显著改变群落成员的空间分布及其活性。我们开发了一种微孔阵列平台，可用于并行快速构建并追踪数千个细菌群落。本实验方案重点介绍了该平台的应用价值，并详细描述了如何利用该平台对其中多个阵列内简单的双成员群落的发育过程进行光学监测。本示例使用了Pseudomonas aeruginosa的两种突变株，这些突变株属于一系列用于研究VI型分泌系统致病性的突变体。通过将mCherry或GFP基因插入染色体，可实现表达具有不同发射波长的荧光蛋白，从而用于监测每个微孔中群落成员的数量与位置。本方案详细阐述了将细菌混合物接种至阵列微孔中的构建方法，并利用延时荧光成像结合定量图像分析，测量各群落成员随时间变化的相对生长情况。文中还讨论了微孔阵列平台的接种与组装方法、对微孔阵列中微生物群落进行定量分析所需的成像步骤，以及可用于揭示微生物物种间相互作用的研究方法。

本文介绍的实验平台专为细菌群落的高通量、高内涵研究而设计。该设计可同时分析数千个在不同尺寸孔中生长的群落。利用这种微孔阵列设计，可确定最终群落组成对初始接种密度、孔尺寸和化学环境的依赖性。本研究展示了双菌群落在微孔阵列中的生长，并提出了分析群落组成与空间结构的方法。
本研究所采用的模式系统由 Mougous 实验室设计，用于研究 VI 型分泌系统 P. aeruginosa该系统由多个突变菌株组成，这些菌株分别携带GFP或mCherry荧光报告基因。本研究使用了两种不同的菌株。第一种是GFP标记的ΔretS突变菌株，该菌株组成型表达与VI型分泌系统相关的毒性效应蛋白，导致敏感细胞出现更高水平的细胞死亡。第二种是RFP标记的ΔretSΔtse/i1-6突变菌株，该菌株缺失了全部六种已知的效应蛋白，且已被证实对VI型致病作用更为敏感。22,<sup class="xre...

微生物群落的发展依赖于多种因素的共同作用，包括环境结构、成员丰度、特性及其相互作用。本方案描述了一种合成的微加工环境，可用于同时追踪容纳在飞升级微孔中的数千个群落，其中生态位大小和空间限制等关键因素可被近似模拟。

微生物群落的发展取决于多种复杂的确定性与随机性因素的共同作用，这些因素可能显著改变其空间...

本方法的总体目标是利用硅基微孔阵列，在受限环境中对多成员微生物群落进行高通量并行分析。该技术的主要优势在于，能够对在工业、医学和环境领域具有重要意义的、高度局域化的微生物相互作用进行高通量、高度并行的筛选。该方法有助于回答生物医学和微生物生态学领域的关键科学问题，例如：在精细尺度下固有的空间限制如何驱动群落发育的确定性与随机性参数？这些限制对微生物成员的丰度和空间组织会产生哪些关键影响？首先准备微孔阵列。使用金刚石刻划笔从印有多个阵列的硅晶圆上切割出单个的微孔阵列芯片。每个单独的芯片包含多个子阵列，孔径范围为5至100微米，分为三种不同的间距密度。每张芯片上，完整的孔阵模式也重复四次。接下来，使用移液器吸头盒和经 PBS 浸润的擦拭纸制作一个湿化室。然后向每张芯片上加入 150 微升 BSA 溶液液滴，并将芯片置于盒中，在室温下孵育一小时。同时准备细菌。离心收集菌体，然后将其重悬于500微升含2%甘油的新鲜R2A培养基中。随后在600纳米处测定菌液密度，并将浓度调整至光密度值为0.02。芯片孵育后，移除 BSA 溶液，并用 PBS 清洗芯片三次。清洗后，用氮气吹干芯片，并将其放回湿化室中。接着，向每片干燥的芯片加入 150 µL 培养物悬液，在 4°C 下孵育 1 小时，使细菌有足够时间附着于微孔中，同时抑制可能污染物的细胞分裂。为准备用于成像的芯片，首先为每个芯片制备一块琼脂糖包被的盖玻片。融化少量琼脂糖，每张盖玻片约需五毫升。接着，用乙醇清洗盖玻片的一面，并将清洗面朝上，居中放置于载玻片上。然后将两个厚度为1毫米的PDMS垫片沿盖玻片的长边放置，并移动盖玻片，使其一端伸出载玻片1毫米。接着，将足量的琼脂糖溶液倒入盖玻片上，使其完全覆盖盖玻片表面。随后，用另一块玻璃载玻片将琼脂糖压平，形成均匀的厚度。并行制备多个载玻片组件。当琼脂糖开始凝固时，将组件转移至4摄氏度环境中。冷却15分钟后，切除盖玻片周围多余的琼脂糖。然后，将组装好的芯片放入培养皿中，并在4摄氏度下保存。芯片与细菌共孵育后，依次将其浸入超纯水中，每次10秒。随后将湿润的芯片竖直放置在纸巾上，待大部分液体流尽。现在，去除未落入孔中的细菌。裁剪一段与硅芯片等长的胶带，将其粘附在硅片的聚对二甲苯涂层上。然后撕下胶带以去除聚对二甲苯涂层，并立即准备将芯片倒置。现在，将芯片放置在载玻片组件上，使微孔与琼脂糖接触。一旦芯片与琼脂糖接触后，务必小心避免移动或错位。随后，将整个组件转移至显微镜载物台环境控制腔室的载片架中，并在接下来的24小时内，以所需的间隔时间、在10倍放大倍数下采集延时图像。使用常规的免费软件处理图像序列。首先，导入图像序列。为进行平均化处理，载入校正图像或暗场图像。然后进行背景减除。提供一个半径值，例如135像素，并选择滑动抛物面法。接下来，通过选中两张图像并使用减法操作，从平均照明场图像中减去平均暗场图像。现在，按如下步骤进行照明校正。将操作模式设为除法，将 i1 设为孔板图像，将 i2 设为校正图像，将 k1 设为校正图像的平均值，将 k2 设为零。然后单击“创建新窗口”。为了定量微孔中的细菌生长，首先使用微阵列插件选择感兴趣区域。在地图菜单中，点击重置网格，并指定行数、列数和孔直径。然后从 ROI 形状菜单中选择圆形。调整ROI阵列与图像对齐时，可按住ALT键或ALT+SHIFT键，然后用鼠标选择ROI阵列的左上角ROI进行移动。如需调整ROI的大小，请在按住Shift键的同时选择ROI阵列的右下角。如需调整ROI之间的间距，请在按住Shift键的同时拖动阵列的顶部或底部边缘。当 ROI 阵列与图像中的孔位对齐后，单击“测量 RT”。随后将输出一个包含每幅图像或每个时间点所有测量数据的表格，可将其复制到电子表格中进行分析。实验比较了两种铜绿假单胞菌菌株的生长情况，其中一种菌株组成型表达与 VI 型分泌系统相关的毒性效应蛋白。另一种由于功能丧失而易感第六型致病机制。两者表达不同的荧光蛋白。对共培养物进行了不同孔板尺寸的纵向研究。细菌被单独培养以及共培养，在20小时的生长过程中以每30分钟间隔进行成像。对成像数据进行软件校正后，绘制了定量生长轨迹。在共培养条件下，数据并未显示出明显的生长变化。为了进一步分析，每条生长曲线均拟合至一个包含三个参数的修正逻辑函数：最大信号值、最大生长速率和延滞时间。该分析表明，这些物种的共培养对其总体生长几乎没有影响，生长曲线中观察到的变异很可能归因于环境因素。一旦掌握，若操作得当，该装置的搭建可在数小时内完成。进行此操作时，需使用生长旺盛的细胞，以准确调节最终的细胞OD值，确保芯片组件中的藻酸盐层均匀一致；同时，在聚对二甲苯剥离步骤中需格外谨慎。通过该方法，可进一步通过遗传物质分析，探讨诸如群落组成与空间结构如何影响各群落内基因表达变化等问题。请注意，操作铜绿假单胞菌可能存在潜在危险，因此在进行本实验时，应始终佩戴手套、实验服、护目镜，并采用适当的无菌操作技术。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微孔阵列平台中微生物群落发展的组装与跟踪

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

本文描述了一种组合功能性筛选方法，用于深入了解微环境分子组成对细胞功能的影响。该方法利用现有的基于微阵列的技术，构建支持细胞黏附和功能分析的、具有明确组合特征的微环境阵列。...

微环境微阵列（MEArrays）的制备与应用

来源：Fattahi, N., et al．用于细菌筛选、选择与分离的光降解水凝胶界面．J. Vis. Exp.

基于光降解水凝胶的微孔阵列细菌菌落分离

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基于微流控图案化与荧光标记的单细胞细菌生长追踪

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp.

在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

本文描述了用于量化贴壁细胞与微结构基底之间机械相互作用的实验方案。这些相互作用与细胞迁移、增殖、分化和凋亡等基本细胞行为密切相关。本方案介绍了一款名为 MechProfiler...

微柱阵列上简便而精确的力学表征

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细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

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构建多重人工细胞微环境阵列

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。...

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微型生物反应器阵列（MBRA）是一种高通量、可定制的连续流培养系统，能够培养复杂的微生物群落，支持并行实验，用于研究微生物组动态、治疗相互作用以及微生物对环境因素的响应。...

微型生物反应器阵列（MBRA）组装与使用的更新方案

了解利用硅微孔阵列高通量分析受限环境中多成员微生物群落的方法。该技术可同时追踪数千个群落的动态，揭示空间约束对微生物成员丰度和组织的影响，为工业、医学和环境科学提供重要见解。

微孔阵列平台中微生物群落构建与追踪

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