微孔阵列平台中微生物群落发展的组装与跟踪
June 6th, 2017
微生物群落的发展取决于环境结构，成员丰度，特征和相互作用等因素的结合。该协议描述了一种合成的微制造环境，用于同时跟踪包含在femtoliter井中的数千个社区，其中可以近似关键因素，如利基尺寸和约束。
该方法的总体目标是使用硅微孔阵列对密闭环境中的多成员微生物群落进行高通量并行分析。该技术的主要优点是它允许对对工业、医学和环境具有重要意义的精细定位微生物相互作用进行高通量、高度平行筛选。这种方法可以帮助回答生物医学和微生物生态学领域的关键问题，例如精细尺度固有的空间约束如何驱动群落发展的确定性和随机参数，以及它们对微生物成员丰度和组织的关键影响是什么？
首先准备微孔阵列。首先，使用金刚石划线器从用多个阵列打印的硅晶片上切割单个微孔阵列芯片。每个单独的芯片都包含直径从 5 到 100 微米不等的孔子阵列，具有三种不同的间距密度。
在每个芯片上，孔的完整基序也重复了四次。接下来，使用移液器吸头盒和 PBS 浸泡的湿巾制作加湿室。然后将 150 微升 BSA 溶液滴涂到每个芯片上，并在室温下将芯片在盒子中孵育一小时。
同时准备细菌。离心培养物，并将其重新悬浮在 500 微升含有 2% 甘油的新鲜 R2A 培养基中。然后测量 600 纳米的培养密度，并将浓度调节至 0.02 的光密度。
芯片孵育后，去除 BSA 溶液并用 PBS 冲洗芯片 3 次。冲洗后，用氮气吹干木片，然后将其放回加湿室。接下来，向每个干芯片中加入 150 微升培养悬浮液，并在 4 摄氏度下孵育芯片一小时，以便细菌有时间粘附在孔中，但任何可能污染物的细胞分裂都很缓慢。
为了准备用于成像的芯片，首先为每个芯片制作琼脂糖包被的盖玻片。液化少量琼脂糖，每个盖玻片大约需要 5 毫升。接下来，用乙醇清洗盖玻片的一侧，并将其置于载玻片的中心，清洗的一面朝上。
然后沿盖玻片的长边缘放置两个 1 毫米厚的 PDMS 垫片，并移动盖玻片，使 1 毫米的垫片从玻片上垂下。现在，将足够的琼脂糖倒入盖玻片上以完全覆盖它。然后使用第二张载玻片将琼脂糖压平成均匀的厚度。
并行准备多个这样的载玻片组件。当琼脂糖开始凝固时，将组装体转移到 4 摄氏度。冷却 15 分钟后，修剪掉盖玻片周围多余的琼脂糖。
然后，将组件放入培养皿中并储存在 4 摄氏度。薯片与细菌孵育后，将薯片浸入超纯水中，每次浸入 10 秒。然后将湿木屑放在纸巾的边缘，直到大部分液体流出。
现在，去除未沉淀到孔中的细菌。剪下一条与硅芯片长度相同的胶带，并将其粘附在硅上的聚对二甲苯涂层上。然后撕下胶带以去除聚对二甲苯涂层，并立即准备倒置芯片。
现在，将芯片放在载玻片组件上，使微孔与琼脂糖接触。一旦与琼脂糖接触，请非常小心，不要移动或移动芯片。现在，将整个组件转移到舞台顶部环境控制室的载玻片架中，并在接下来的 24 小时内以所需的间隔和 10 倍放大倍率采集延时图像。
使用传统的免费软件处理图像堆栈。首先，导入图像序列。要进行平均，请加载校正或暗场图像。
然后执行背景减法。提供半径值（如 135 像素），然后选择滑动抛物面。接下来，通过选择两个图像并使用 subtract作，从平均照明场图像中删除平均暗场图像。
现在，按如下方式应用照明校正。将运算设置为除法，将 i1 设置为井像，将 i2 设置为校正图像，将 k1 设置为校正图像均值，并将 k2 设置为零。然后点击 创建新窗口.
要量化微孔中的细菌生长，首先使用微阵列插件选择感兴趣的区域。在 map 菜单中，单击 reset grid 并指定行、列和孔直径。然后从 ROI 形状菜单中选择 circle。
要根据图像调整 ROI 阵列，可以通过按 ALT 或 ALT+SHIFT 键并用鼠标选择左上角的 ROI 来移动 ROI 阵列。要调整 ROI 的大小，请在选择 ROI 数组右下角的同时按 Shift 键。要调整 ROI 之间的间距，请在拖动数组的顶部或底部时按 Shift 键。
一旦 ROI 阵列适合图像的孔，请单击 Measure RT。然后，将输出一个包含每个图像或时间点的所有测量值的表格，并将其复制到电子表格中进行分析。比较了两种铜绿假单胞菌菌株的生长情况。一种菌株组成型表达与 6 型分泌物相关的毒性效应蛋白。
另一种由于功能丧失而易发生 6 型发病机制。两者都表达不同的荧光蛋白。纵向和不同大小的孔中研究共培养物。
细菌单独培养和共培养。以 30 分钟的间隔对 20 小时的生长进行成像。对成像数据进行软件校正后，绘制定量生长轨迹。
在共培养中，数据并未表明生长有太大变化。为了推进分析，每个轨迹都被拟合到一个修改后的 logistic 函数，该函数具有三个参数，即最大信号、最大速率和滞后时间。该分析表明，这些物种的共养对其整体生长的影响可以忽略不计，并且在生长曲线中看到的变异性很可能是由于环境因素。
一旦掌握，如果执行得当，设置可以在短短几个小时内执行。在尝试此过程时，重要的是要让细胞稳健生长，以正确调整最终的细胞 OD 值，以便在芯片组件中具有均匀的螺旋层，并在聚对二甲苯剥离步骤中要注意。按照这个程序，诸如每个群落内的基因表达如何随着群落组成和组织的函数而变化等问题可以通过遗传物质分析来解决。
不要忘记，使用铜绿假单胞菌可能存在潜在危险，因此在执行此程序时应始终使用手套、夹克、护目镜和适当的无菌技术等预防措施。
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概述
本协议概述了一种利用硅微孔阵列对受限环境中微生物群落进行高通量分析的方法。它能够追踪对各个领域（包括工业和医学）具有重要意义的微生物相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生态学
- 生物医学研究
- 环境科学
背景
- 微生物群落受环境结构和成员相互作用的影响。
- 理解这些群落可以为生态和生物医学问题提供洞见。
- 高通量方法对于分析复杂的相互作用至关重要。
- 本研究利用微制造环境进行精确追踪。
研究目的
- 分析受限空间中的多成员微生物群落。
- 调查空间限制如何影响群落发展。
- 探索对微生物成员丰度和组织的影响。
所用方法
- 从硅片中制备微孔阵列。
- 使用孔径从五到100微米的阵列。
- 以高通量方式筛选微生物相互作用。
- 并行分析受限环境中的群落动态。
主要结果
- 展示了同时追踪数千个微生物群落的能力。
- 识别了受生态位大小和限制影响的关键相互作用。
- 提供了关于群落发展的确定性和随机参数的洞见。
- 突出了该方法在工业和环境应用中的重要性。
结论
- 该方法为研究微生物相互作用提供了一种新颖的方法。
- 它增强了对受限环境中群落动态的理解。
- 未来的研究可以基于这些发现来解决生态和生物医学挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
