分离小鼠脂肪组织来源的微血管片段作为组织工程中的血管化单元

本实验的总体目标是从鼠类脂肪组织中分离出微血管片段，以制备用于组织工程的血管化单元。该方法有助于回答组织工程领域中关于组织替代物在体内实现血管化的一些关键问题。该技术的一个优势在于，无需复杂的体外处理即可获得完全具有功能的微血管节段，这些节段可接种于支架材料上，并植入组织缺损部位。

该方法还可应用于其他系统，例如体外血管生成实验，以揭示微血管网络形成与重塑的分子机制。首先将一只麻醉的雄性野生型C57黑六小鼠仰卧置于手术体视显微镜下，并确认其对脚趾夹捏无反应。用胶带固定四肢，对腹部进行消毒。

接下来，使用解剖剪将腹壁层与下方的肌肉组织分离，进行正中剖腹切口。将腹壁的瓣膜向两侧展开，双侧辨认睾丸、附睾及附睾脂肪垫。然后使用小型解剖剪和精细镊子采集脂肪垫，注意避免收集任何附睾组织，并将脂肪垫放入含有15 ml 37°C DMEM的培养皿中。

在超净工作台中，将脂肪组织块分别放入三个含有 15 ml PBS 的培养皿中清洗，并将清洗后的脂肪转移至一个空的 14 ml 聚丙烯管中。使用试管称重仪测定所获取脂肪的体积。然后使用精细剪刀对脂肪组织进行机械剪碎。

当获得均匀的组织悬液后，使用10 mL量筒将剪碎的组织与两倍体积的胶原酶NB 4G转移至含有25毫米搅拌子的50 mL锥形瓶中。将锥形瓶置于细胞培养孵箱中，在剧烈搅拌条件下消化10分钟。随后，取10 µL消化后的组织在显微镜下观察。

该分离过程中最困难的步骤是确定停止消化的合适时机。脂肪垫消化时间过长会导致仅得到单细胞悬液，而无任何微血管片段。若消化产物中除单细胞外还含有游离的脂肪组织来源的微血管片段，则需加入两倍体积的含20% FCS的PBS中和酶活性，并将细胞与血管片段悬液转移至新的聚丙烯管中。

将溶液在 37 摄氏度下孵育五分钟，通过重力作用使微血管片段与残留脂肪分离。随后，使用 1 mL 精密移液器小心移除 1 mL 主要脂肪上清液，再用 100 µL 精密移液器去除剩余上清液，直至悬浮液看起来无脂肪。当所有脂肪完全去除后，使用 10 mL 量液管将细胞悬液通过 50 µm 滤网过滤至 50 mL 锥形管中，并将过滤后的悬液转移至新的 14 mL 聚丙烯管中，每管对应一个独立的微血管片段分离物。

通过离心收集微血管片段沉淀，并从每根离心管中弃去上清液，仅保留最后1 mL。用剩余的上清液重悬沉淀。然后，将每种悬液转移至各自的1.5 mL锥形微量离心管中，再次离心沉淀微血管片段，随后重悬于适当终体积的PBS和20%FCS中，用于后续计划的分析。

此处展示了从六至十二月龄野生型C57黑六小鼠中 freshly 分离得到的微血管片段的长度分布，其平均长度约为42微米。如该代表性脂肪组织血管悬液涂片所示，当脂肪组织被充分消化后，可观察到大、中、小不同尺寸的微血管片段以及单个细胞。高倍镜下可见，这些微血管片段呈现出具有分级微血管节段的成熟微血管形态。

通过流式细胞术对微血管片段进行表征表明，这些片段含有 CD31 阳性的内皮细胞、α-平滑肌肌动蛋白阳性的血管周细胞以及 CD117 阳性的间充质干细胞等标志物表达细胞。在真皮皮肤替代物上接种后，较大的微血管片段主要定位于植入物表面，部分毛细血管样结构可在植入物核心内被检测到。对接种后的微血管片段进行免疫组织化学染色进一步显示，其具有类似小动脉、小静脉和毛细血管的生理性微血管结构。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在两小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何从小鼠脂肪组织中分离微血管片段，作为组织工程中的血管化单元。