Name: 鼠短轴心脏心脏切片用于电生理研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习制备小鼠心室切片用于心脏电生理研究。该方法利用琼脂糖模具和振动切片机获取具有体内样结构的活性组织，适用于记录动作电位、评估移植心肌细胞整合及药物效应。

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我们感谢神经生理学研究所的车间和动物设施提供的支持。本工作得到了科隆Walter und Marga Boll基金会、Köln Fortune以及德国心脏研究基金会的资助。

动物操作必须符合当地动物福利委员会的指南以及欧洲议会的2010/63/EU指令。
1. 准备溶液
<ol>
	<li>制备无 Ca2+ 的 Tyrode 溶液（成分单位为 mM）：NaCl 136、KCl 5.4、NaH2PO4 0.33、MgCl2 1、葡萄糖 10、HEPES 5、2,3-丁二酮单肟（BDM）30。在 4 °C 下用 NaOH 调节 pH 至 7.4。</li>
	<li>制备含 Ca2+ 的 Tyrode 溶液（成分单位为 mM）：NaCl 136、KCl 5.4、NaH2PO4 0.33、MgCl2 1、葡萄糖 10、HEPES 5、BDM 30、CaCl2 0.9。在 4 °C 下用 NaOH 调节 pH 至 7.4。</li>
	<li>制备 4% 低熔点琼脂糖：将 0.6 g 低熔点琼脂糖加入 15 mL 无 Ca2+ 的 Tyrode 溶液中。在微波炉中以 750 W 功率加热两次，每次 10–15 秒，直至琼脂糖完全溶解。将溶液保持在 37 °C 恒温，并持续搅拌。</li>
	<li>将无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）在 37 °C 下用碳氧混合气（5% CO2、95% O2）持续通气维持。</li>
</ol>
2. 准备切片机
<ol>
	<li>打开切片机。</li>
	<li>将冰填入切片机的外室。</li>
	<li>用冰冷的无钙台罗德液填充切片机内腔2+ 并用100%氧气持续充氧溶液2.</li>
	<li>将钢制刀片放入切片机的刀片架中。</li>
</ol>
3. 小鼠心脏分离
<ol>
	<li>皮下注射 2,500 U 肝素。等待 15 分钟。</li>
	<li>通过颈椎脱位处死动物。</li>
	<li>通过胸骨切开术打开胸腔。</li>
	<li>使用小型剪刀和5号镊子仔细解剖心包膜。</li>
	<li>将套管插入升主动脉并灌注冠状动脉 原位 用不含钙的冰冷Tyrode溶液2+ 直至残留血液被完全清除。</li>
	<li>用镊子和剪刀小心地切除心脏，并将心脏转移至不含钙的冰冻台氏液中2+.</li>
	<li>用手术刀或剪刀将心房与心室分离。</li>
</ol>
4. 使用4%低熔点琼脂糖包埋心室
<ol>
	<li>将心室尖端朝上放置于琼脂糖模具中（图1）。将针头插入模具中央的左心室腔内。</li>
	<li>用37 °C的4%低熔点琼脂糖填充模具，直至完全覆盖心脏组织。</li>
	<li>将模具置于冰上，以加快琼脂糖凝固，防止组织漂浮。</li>
	<li>用解剖刀将含有心室的琼脂糖块从模具中取出。</li>
	<li>将琼脂糖块倒置，使用带有20 G针头的注射器，向心室腔及模具针头留下的背面空隙中填充4%低熔点琼脂糖。</li>
	<li>用解剖刀修整琼脂糖块，使其底部平整，并确保心尖垂直向上。</li>
</ol>
5. 心室组织切片
<ol>
	<li>用一滴氰基丙烯酸酯胶水将组织块固定在切片机的样品夹持器上，使心尖朝上。</li>
	<li>将样本架放入切片机的内样本室中，内样本室已充满无钙的冰冻Tyrode液2+用 Tyrode 溶液完全浸没琼脂糖块。</li>
	<li>根据后续应用需求制备150-400 µm厚度的短轴切片（用于尖电极记录时为150-200 µm），将刀片振动频率保持在60-70 Hz，并以尽可能慢的速度向前推进刀片。</li>
	<li>使用细毛刷小心地将琼脂糖从切片上彻底清除。</li>
	<li>用巴斯德移液管将切片轻柔转移至含有 0.9 mM Ca 的台罗德液中2+ 以100% O₂通气2 并在冰上保存至少30分钟，以使组织从切片过程中恢复。</li>
	<li>随后，将脑片置于37 °C、通入碳氧混合气（carbogen）的DMEM中孵育30分钟，以洗去BDM，再进行后续实验。</li>
</ol>
6. 准备尖端电极装置
<ol>
	<li>预热时，在开始记录前30分钟打开所有电子设备。</li>
	<li>将一个3 cm的细胞培养皿放置在倒置显微镜上的加热板上。</li>
	<li>将定制的环形电极（图2）放入培养皿中，并连接前置放大器和刺激电极的接地线。</li>
	<li>将灌流系统的柔性管路连接到培养皿上。</li>
	<li>用经碳氧混合气（carbogen）饱和的DMEM填充灌流系统的储液罐。</li>
	<li>启动灌流泵，并将灌流速度设定为2–3 mL/min。</li>
	<li>通过调节流路加热器和加热板，将培养皿中DMEM的温度调整至37 °C。</li>
</ol>
7. 动作电位记录
<ol>
	<li>将心室切片放入盛有DMEM的培养皿中。</li>
	<li>使用倒置显微镜检查组织的结构完整性和活性（基于收缩功能）。</li>
	<li>用3 M KCl填充记录玻璃电极。</li>
	<li>用DMEM填充刺激电极。</li>
	<li>将记录电极和刺激电极安装到电极夹持器上。</li>
	<li>小心地将刺激电极放置在切片上，并打开电刺激器。起始刺激频率设为1-2 Hz。</li>
	<li>使用显微操作器将记录电极移至目标记录位置上方。</li>
	<li>缓慢降低记录电极，直至其尖端接触组织。</li>
	<li>通过记录电极施加一个短暂的矩形电脉冲，以穿透细胞膜。</li>
	<li>仔细调整记录电极的位置，直至获得稳定的信号。</li>
	<li>开始记录动作电位。</li>
</ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
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<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

心室切片可实现电生理学、药理学和机械研究，同时保持组织结构的完整性 体内 如组织结构以及测量技术对心脏所有区域的直接可及性。已在胚胎期、新生期和成年期的心脏切片中证实了生理性的动作电位特性。 9,10,11除切片操作直接损伤的表面层外，其余组织的活性已通过活性染色得到证实 9使用锐利的玻璃电极在脑片中记录动作电位，可用于研究移植心肌细胞的整合与成熟情况（如本文所述），或在添加心脏活性化合物后进行药理学研究。可在单个细胞中实现持续一小时或更长时间的长时程记录。该记录时长足以通过依次灌注和洗脱不同药理学化合物，来检测其对同一细胞的作用效果。
关键制备步骤
为优化切片质量，应避免缺血性组织损伤。因此，需对心脏进行灌注 原位 用Tyrode溶液进行灌注时，快速切除心脏并立即...

自1966年Yamamot和Mcllwain证明脑组织切片的电活动可在体外（in vitro）维持以来，薄组织切片已广泛应用于基础科学研究1。此后，研究人员已在来自脑2、肝3、肺4和心肌组织5,6,7的切片上开展电生理学和药理学研究。1990年首次报道了对新生大鼠心脏心室切片进行的膜片钳记录8，但该技术一度被弃用。十余年之后，我们课题组建立了一种制备小鼠胚胎期9、新生期10和成年期11心脏切片的新方法。这些具有活性的组织切片可用于急性实验（成年切片可培养数小时）或短期培养实验（胚胎期和新生期切片可培养数天）。通过锐利微电极动作电位记录和微电极阵列检测发现，这些切片表现出类似体内（in vivo）的电生理特性，并具有均匀的兴奋传导11。由于其&#34;二维&#34;结构形态，记录电极可直接接触心室所有区域，使其成为电生理研究的有力工具，并相较于Langendorff灌流的整体心脏提供了新的实验可能性。切片对离子通道阻滞剂的药物反应，如维拉帕米（L型Ca2+通道阻滞剂）、利多卡因（Na+通道阻滞剂）、4-氨基吡啶（非选择性电压依赖性K+通道阻滞剂）和林诺吡啶（KCNQ K+通道阻滞剂）9,11，与已知的分离心肌细胞反应一致。等长收缩力测量显示存在正性频率-收缩力关系，并强烈提示其收缩功能保持完整10。这些结果表明，小鼠心室切片可作为生理学和药理学研究的体外（in vitro）组织模型。此外，受体心脏的心室切片结合锐利微电极记录已被证实为一种非常有用的工具，可用于表征移植胎儿12,13,14和干细胞来源15心肌细胞的电整合、机械整合及成熟过程。
总之，心室切片是一种有价值且成熟的多细胞组织模型，在心血管研究中应被视为离体心肌细胞和Langendorff灌流心脏模型的补充。其主要优势在于既能提供类似in vivo的组织结构（与离体细胞相比），又能使测量技术（如尖锐电极记录）直接接触心脏各个区域（与完整心脏制备相比）。

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>带振动刀片的切片机。</td></tr><tr><td>不锈钢刀片</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>细毛刷，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 6号（4/32&quot;）</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>制作用于琼脂糖包埋心室的准备台</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>用于在琼脂糖中包埋心室的模具</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G × 3/4`` 针头</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` 针头</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>#5 镊子，尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>氧气（医用级 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酰气（95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Linde, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（含GlutaMAX）</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX 放大器</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低倍镜用显微操作仪</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>高倍镜用三轴显微操作仪</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>蠕动灌流泵</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>双通道温度控制器</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>方波刺激器</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

小鼠心肌细胞已被广泛用于 体外 心脏生理学研究及新治疗策略。然而，分离的心肌细胞多细胞样本并不能代表复杂的 体内 心肌细胞、非肌细胞及细胞外基质的结构，这些结构影响心脏的机械和电生理特性。本文介绍一种制备成年小鼠心脏存活心室切片的技术，该切片可保持原有的 体内 类似组织结构，并证明其适用于电生理记录。心脏切除后，心室与心房分离，用 Ca2+不含2,3-丁二酮单肟的溶液，并包埋于4% 低熔点 琼脂糖块。将该琼脂糖块置于带有振动刀片的切片机上，调整刀片振动频率为60–70 Hz，并以尽可能缓慢的速度推进刀片，制备厚度为150–400 µm的组织切片。切片厚度取决于后续应用。切片保存于冰冻的Tyrode溶液中，其中含0.9 mM Ca2+ 以及2,3-丁二酮单肟（BDM）中孵育30分钟。随后将组织片转移至37 °C的DMEM培养基中孵育30分钟，以洗去BDM。组织片可用于锋电极或微电极阵列的电生理研究、心肌收缩功能的力学测量，或用于研究移植的干细胞来源心肌细胞与宿主组织之间的相互作用。进行锋电极记录时，将一片组织置于倒置显微镜加热板上的3 cm细胞培养皿中，通过单极电极刺激组织，同时使用锋利的玻璃微电极记录组织片内心肌细胞的细胞内动作电位。

心肌梗死会导致心肌细胞几乎不可逆的丧失。利用干细胞衍生的心肌细胞进行外源性心脏再生的细胞替代疗法是一种有前景的治疗策略。移植细胞的电整合与成熟对于细胞替代疗法的安全性和有效性至关重要。
为评估细胞整合与成熟情况，我们将表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSCM；每次注射0.5 × 106个iPSCM/10 µL，共注射两次）移植到成年小鼠的健康心脏中（详见Peinkofer et al. 对实验方法的详细描述15）。移植后第六天，按照所述方案制备受体心脏的室壁切片。典型的记录结果如图3所示。将含有移植iPSCM的切片置于37 °C的DMEM培养基中，并通过置于宿主组织中的单极电极进行局部刺激（图3A，左图）。使用充满...

在此，我们描述了成年小鼠心室切片的制备方法及其在尖电极动作电位记录中的应用。这些多细胞制备物提供了结构完整的 体内 类似组织的结构，使其成为电生理学和药理学研究的有价值模型 体外.

小鼠心肌细胞已被广泛用于心脏生理学及新治疗策略的体外研究。然而，多细胞……

该技术的总体目标是获得可用于电生理记录的活性心室心脏切片。该方法有助于回答心脏电生理学领域中关于组织层面的关键问题，例如移植心肌细胞的电整合情况或心脏活性药物的作用效果。该技术的主要优势在于，活性心室组织切片保留了类似体内的真实组织结构，并能够在心脏的所有区域进行直接测量。尽管该方法可为小鼠心脏电生理学提供研究依据，也可应用于其他动物，如兔或豚鼠。开始操作前，先用70%乙醇擦拭动物皮肤。打开胸腔后，使用小剪刀和镊子仔细分离心脏的心包膜。将套管插入左心室，并用冰冷的无钙台罗德溶液原位灌注心脏，直至清除残留血液。然后，轻柔地切除心脏并将其转移至冰冷的无钙台罗德溶液中。用手术刀或剪刀将心房与心室分离。接下来，将心室尖端朝上放入琼脂糖模具中。随后，将针置于模具中央及左心室腔内。用37摄氏度的4%低熔点琼脂糖填充模具，直至完全覆盖心脏。然后将模具置于冰上，以加快琼脂糖凝固，防止组织漂浮。一分钟后，用解剖刀将含有脑室的琼脂糖块从模具中取出。随后将琼脂糖块倒置，使用注射器将4%低熔点琼脂糖填充至脑室腔及琼脂糖块背面的缝隙中。然后，使用解剖刀修整琼脂糖块，使其底部平整，并保持心尖垂直向上。在此步骤中，将琼脂糖块用一滴氰基丙烯酸酯胶固定于切片机的样品台，心尖朝上。接着，将样品台放入切片机的内部样品室中，样品室内充满无钙的冰冷台氏液。确保琼脂糖块完全浸没在台氏液中。根据后续应用需求，将组织切片制备为150至400微米的厚度。刀片振动频率保持在60至70赫兹，并以尽可能缓慢的速度向前移动刀片。随后，使用细刷小心地将切片上残留的琼脂糖去除。然后，用巴斯德移液管将切片轻轻转移至含有0.9毫摩尔钙、并通入100%氧气的台氏液中。将切片置于冰上至少30分钟，以使其从切片过程中恢复。将切片置于网架上有助于保持其平整。随后，使用滤纸和第二个网架将切片转移至已用碳氧混合气饱和、37摄氏度的DMEM中，以洗去BDM，供后续使用。为预热设备，应在记录开始前30分钟打开所有电子仪器。将一个直径三厘米的细胞培养皿放置在倒置显微镜的加热板上。然后，将自制的环形电极放入培养皿中，并连接前置放大器和刺激电极的接地线。随后，将灌流系统的柔性管路连接至培养皿。用 DMEM 填充灌流系统的储液器，并用碳氧混合气体（carbogen）进行通气。然后打开灌流泵，将灌流速度设置为每分钟 2 至 3 毫升。通过调节流路加热器和加热板，将培养皿中 DMEM 的温度调节至 37 摄氏度。现在，将一个心室切片放入盛有DMEM的培养皿中。在倒置显微镜下检查组织的结构完整性和活性。然后，用3摩尔氯化钾溶液填充记录用玻璃电极，用DMEM填充刺激电极。接下来，将记录电极放置在电极架上的刺激电极中。随后，小心地将刺激电极置于脑片上。打开电刺激器，以1至2赫兹的刺激频率开始刺激。然后，使用显微操作器将记录电极移至预定的记录位置。缓慢降低记录电极，直至其尖端接触组织。一旦记录到接触信号，通过记录电极施加一个短暂的矩形电脉冲，以穿透细胞膜。接下来，仔细调整记录电极的位置，直至获得稳定的信号。随后，开始记录动作电位。为评估细胞的整合与成熟情况，将来源于表达eGFP的iPSCM的心肌细胞移植到成年小鼠的健康心脏中。图中显示的是包含移植iPSCM的心室心肌切片，通过置于宿主组织中的单极电极进行局部刺激。使用充满三摩尔氯化钾的尖锐玻璃微电极，记录了eGFP阳性移植iPSCM以及切片内邻近宿主组织的细胞内动作电位。以下是健康宿主组织和移植iPSCM的动作电位记录结果。将刺激电极置于宿主组织中，以大约 2 赫兹和 5 赫兹的频率对脑片进行局部刺激。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一至两小时内完成。在实施该操作过程中，需特别注意将切片机刀片的前进速度尽可能放慢。完成此操作后，可进行其他方法，如首次测量，以回答更多问题。该技术在建立后，为细胞治疗领域的研究人员探索移植心肌细胞在受体心脏中的电活动、整合及成熟过程开辟了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何使用振动刀片微切片机制备具有活性的心室短轴切片。这些切片特别适用于尖端玻璃电极的电生理记录。

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Medicine

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鼠短轴心脏心脏切片用于电生理研究

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人源心肌组织长期培养的制备

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用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

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