Name: 时间依赖性增加对微电极阵列刺激神经元细胞培养物的网络响应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习使用微电极阵列培养E17小鼠神经元网络并进行电刺激记录，以研究学习与记忆的神经机制。该方法可同时记录多位点活动，提供更高的时空分辨率。

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本工作由美国国家科学基金会资助项目 CMMI-1300007 支持。我们谨向乔治梅森大学实验室的前任成员致以感谢，他们在过去五年中协助设计了这些实验方案，并负责细胞培养的维护工作：Joseph J. Pancrazio 博士、Hamid Charkhkar 博士、Gretchen Knaack 博士、Franz Hamilton 博士、Michael Maquera 和 Robert Graham。

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中概述的步骤为初学者提供了足够的细节，以在其自身的MEA上接种神经元培养物并记录网络活动。本方案将有助于确保培养物正确贴壁，在电极阵列上形成一层连续的细胞覆盖层，并在数月内保持健康且无污染。
尽管最好遵循方案的全部步骤，但整个过程中有一些步骤对成功的结果至关重要。在整个操作过程中必须使用无菌技术，以防止培养物受到污染。新的多电极阵列（MEA）必须按照方案所述处理为亲水性，否则将导致细胞贴壁不良。在细胞解离过程中避免剧烈吹打和气泡产生，可减少接种时受损细胞的数量，从而获得更高且更健康的细胞产量。在首次换液后，需从DMEM 5/5培养基更换为DMEM+培养基，这一点也很重要。DMEM 5/5含有马血清，若持续使用会导致胶质细胞在培养物中占主导地位，从而引起神经元活性低下，尽管此时培养物外观可能仍显正常17。按时换液并保持适宜的培养条件同样至关重要。
在MEA上接种细胞培养物涉及诸多变量，可能导致结果不理想。尽管目标是获得完美的 &#34;地毯&#34; 细胞，若未妥善处理上述关键步骤，将导致细胞成熟度差或发生污染。细胞贴壁不良（不同于细胞成熟度差）也是一个需要关注的问题。其可能由多种因素引起，包括铺板前微电极阵列（MEA）制备不当或使用了陈旧的培养基。若使用含有稳定型L-谷氨酰胺和神经细胞培养用无血清添加剂的陈旧培养基（参见 材料 表格使用该培养基时，细胞最初会贴壁，但约两周后会漂浮脱落。如果细菌污染问题持续存在，可在培养基中添加抗生素，如氨苄青霉素或青霉素-链霉素（pen-strep）。此外，也有可用的杀菌剂用于处理真菌污染。这些是影响培养结果的一些常见变量，还有许多其他因素需在长期实践和经验积累后才会遇到。
与玻璃微电极技术相比，该方法在研究神经网络动态和药理学反应方面具有显著优势。它能够实现多种不同的时空刺激模式，并允许同时记录来自多个区域的神经元反应。先前的研究团队已采用类似本文中所述的实验方案，取得了有趣的研究成果18。由于培养物可维持数周甚至数月，且可对同一培养物进行重复利用，因此该技术还支持在相同神经网络上进行多次时间序列实验。
然而，该技术也存在局限性。多电极阵列（MEAs）属于非侵入性技术，因此只能记录细胞外活动，而无法实现膜片钳或微管电极细胞内记录。此外，由于阵列中的每个电极均被多个细胞覆盖，因而无法分辨单个神经元的活动。相反，由于这些是 体外 培养物无法完全再现大脑网络的结构特性。此外，若无某种提供 CO₂ 的机制，每次记录活动的时间通常无法超过 30 分钟。2 为细胞提供维持其pH平衡的环境。
一旦掌握该技术，便可探索结合或不结合电刺激的药理学干预手段。同时可设计并测试用于研究神经网络中学习与记忆形成的新型方案，以及针对海马体或脊髓网络的实验方案。已有文献报道过神经网络刺激与训练的相关方案，其中部分方案已被进一步优化和发展为 体内 方案，例如 &#34;选择性适应&#34; 由 Eytan 提出 等19测试了多种方案，但此处仅展示对 Ruaro 于 2005 年提出的破伤风程序进行修改后的结果。14,20.

微电极阵列（MEAs）可用于研究药物毒性、设计下一代个性化医疗方案，以及探究神经元培养物中的网络动态1。与传统方法相比，MEA具有显著优势：例如膜片钳技术仅能记录单个细胞的活动，或玻璃微电极场电位记录仅能在单一位置记录电极周围神经元的胞外反应，而MEA则能够在细胞培养物中同时从多个位点进行记录，且无需繁琐地逐个放置电极。这使得研究人员能够研究培养物中形成网络的细胞群体之间的动态相互作用。此外，电刺激对神经元网络放电模式2,3,4,5以及网络调控6的影响已有充分报道，在同一实验体系中可轻松施加多种电刺激模式和控制条件，从而能够广泛探索各种时空动态特性。
这些研究中一个关键的关注动力学 体外 研究的重点一直是培养的神经网络在多大程度上表现出可指示学习能力的特性7,8,9,10,11,12,13Peixoto 实验室此前已研究过高频训练信号的影响，如 Ruaro 所述 等14，基于接种在微电极阵列上的小鼠神经元网络15在这些实验中，通过电刺激诱导训练后，神经网络表现出反应增强。这种增强的反应被视为一种通过刺激识别形成的学习形式，即在施加特定刺激后，神经网络对刺激变化产生一致性的反应。即， 训练）方案。
本方案演示了如何在微电极阵列（MEA）上培养神经元细胞，成功对超过95%的接种培养皿进行记录，建立训练神经网络以响应特定刺激模式的方案，对单个神经元活动进行分类，绘制直方图，并解读此类实验的结果。文中展示了使用专有系统（见材料表）对神经元培养物进行刺激和记录的方法，以及应用软件包（见材料表）对神经元单元进行分类的技术。通过定制设计的图形用户界面（见材料表），可可视化刺激后时间直方图、簇间间隔和簇发放持续时间，并比较训练方案前后细胞对刺激的响应情况。

<table><tbody><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>配制成 4 mg/mL 的分装液</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>神经细胞培养用无血清添加剂。配制成 1 mL 分装液后冷冻保存</td></tr><tr><td>烧杯 - 玻璃 - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>烧杯 - 玻璃 - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>冻存管 - 无菌，2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>冻存管 - 无菌，5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>含 Glutamax 的 DMEM 培养基</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>含有稳定型 L-谷氨酰胺的细胞培养基</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>细头镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>用作补充剂的稳定型 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>血细胞计数板芯片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB 完全培养基</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>常温 CO&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞保存培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS 滤波放大器</td><td>MultiChannel System</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS 头级放大器/前置放大器</td><td>MultiChannel System</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS 微电极阵列</td><td>MultiChannel System</td><td>60MEA200/10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS 电源</td><td>MultiChannel System</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS 信号分配器</td><td>MultiChannel System</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS 刺激发生器</td><td>MultiChannel System</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS 温度控制器</td><td>MultiChannel System</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>培养基储存瓶 - 玻璃，500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>微量离心管 - 0.4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>微量离心管 - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>移液器吸头 - 10 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>移液器吸头 - 1,000 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>移液器吸头 - 200 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>移液器 - 10 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>移液器 - 1,000 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>移液器 - 200 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶 - 0.22 微米滤过</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 - 100 mm 一次性</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 - 100 mm 玻璃</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 - 35 mm&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）(1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗系统</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯锥形（离心）管 - 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯锥形（离心）管 - 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>手术口罩</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>World Precision Instruments</td><td>&amp;nbsp;500237-G</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>大剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>小手术剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>&amp;nbsp;501733-G</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 - 无菌，1 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 - 无菌，2 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 - 无菌，25 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 - 无菌，50 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>软件：Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>用于分析 .mat 文件。&amp;nbsp; 可免费索取。&amp;nbsp; 请发送邮件至 npeixoto@gmu.edu 获取副本。</td></tr><tr><td>软件：MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>用于数据采集</td></tr><tr><td>软件：NeuroExplorer</td><td>Plexon&amp;nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>用于将 .nex 文件转换为 .mat 文件</td></tr><tr><td>软件：Offline Sorter</td><td>Plexon&amp;nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>用于神经元峰电位分选，并将数据文件转换为 .plx 格式，再转为 .nex 格式</td></tr><tr><td>软件手册：MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>软件手册：NeuroExplorer</td><td>Plexon&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>软件手册：Offline Sorter</td><td>Plexon&amp;nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>刮勺 - 小型双头</td><td>World Precision Instruments</td><td>&amp;nbsp;503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &amp;micro;m 孔径滤器 - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>转移移液管 - 大孔径&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>转移移液管 - 小孔径&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>裁成 8 个扇形片，置于玻璃培养皿中高压灭菌</td></tr></tbody></table>

微电极阵列上神经元细胞培养物对刺激反应的时程依赖性增强

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

微电极阵列（MEAs）可用于研究药物毒性、设计下一代个性化医疗方案，以及探究神经元培养物中的网络动态。与传统的膜片钳等仅能记录单个细胞活动的方法相比，MEA能够同时记录网络中多个位点的电活动，且无需繁琐地逐个放置电极。此外，在同一实验装置中可轻松实现多种控制与刺激配置，从而能够探索广泛的网络动态行为。其中，研究人员重点关注的关键动态之一是这些 体外 研究的一个关键问题是培养的神经网络在多大程度上表现出可指示学习能力的特性。在微电极阵列（MEAs）上培养的小鼠神经元细胞在接受电刺激诱导的训练后，其反应性会增强。本实验方案展示了如何在微电极阵列上培养神经元细胞；成功对超过95%的培养皿进行记录；建立训练神经网络以响应特定刺激模式的方案；并对实验结果进行数据分选、绘图与解读。文中演示了使用专有系统对神经元培养物进行刺激和记录的过程，同时采用软件包对神经元放电单元进行分类。通过自行设计的图形用户界面，可可视化呈现刺激后时间直方图、簇间间隔、簇发放持续时间，并比较训练前后细胞对刺激的反应。最后，讨论了该研究的代表性结果及未来发展方向。

在多电极阵列上培养的小鼠神经元细胞在接受电刺激后表现出反应增强。本方案演示了如何培养神经元、如何记录其活动，以及如何建立一种训练网络以响应特定刺激模式的实验方案。

微电极阵列（MEAs）可用于研究药物毒性、设计下一代个性化医疗方案以及研究神经网络……

本实验的总体目标是分离并连接 E17 小鼠神经组织，以便在微电极阵列上培养、记录和刺激神经网络。该方法有助于回答与学习和记忆基本机制相关的神经网络动力学研究中的关键问题。该技术的主要优势在于，微电极阵列能够同时从多个位点进行记录，与传统的单点玻璃电极记录相比，可提供更优的空间和时间分辨率。尽管该方法可用于研究学习与记忆的网络动态，也可用于探究药物毒性或设计下一代个性化医疗的实验范式。此过程的可视化演示至关重要，因为在解剖和组织解离过程中对组织的操作仅通过阅读实验方案难以掌握。准备阵列时，使用无菌移液器吸头，向每片多电极阵列（MEA）的中央加入40至50微升解冻的层粘连蛋白，并向对照培养板中加入0.2毫升层粘连蛋白。用生物安全罩盖住所有MEA和对照培养皿，转移至37摄氏度培养箱中孵育1小时。1小时后，使用无菌巴斯德移液管通过抽吸小心移除MEA中心多余的层粘连蛋白，待表面风干后进行细胞接种。接着，将L-15培养基倒入四个100毫米的培养皿中，盖上皿盖，置于-20摄氏度冰箱中冷冻约40至60分钟，直至培养基呈冰沙状但未完全冻结。为解剖做准备，将一个玻璃培养皿倒扣在装满冰的托盘中。现在用70%乙醇喷洒动物的下腹部。使用小型手术剪，在下腹部的皮肤和皮下脂肪处剪出一个V形切口，将切口延伸至胸腔远端，暴露子宫。用镊子小心地在胚胎之间夹起子宫。用解剖剪剪除结缔组织，直至整个子宫完全游离。然后用70%乙醇短暂冲洗子宫以去除血液，再将其放入盛有冷L-15的四个培养皿之一中。随后，使用两对尖头镊子将每个胚胎从子宫及内部的胚囊中分离。将分离出的胚胎放入盛有冷L-15的第二培养皿中，然后将头部转移至第三培养皿，躯体转移至第四培养皿。在生物安全柜中，将一片经高压灭菌的滤纸楔形放置于冷藏的玻璃培养皿台上，再将一个胚胎头部置于滤纸上。接下来，将虹膜剪的下刃剪尖置于颅底，保持下刃紧贴颅骨内表面并远离脑组织，剪开枕骨板，然后沿顶骨板之间的中线继续剪开。接着，沿软骨性额骨板之间向前（喙侧）继续剪开。随后，从枕骨板中心开始，分别向中心切口的左侧和右侧做垂直剪切。随后，小心地将小刮铲插入脑腹面与颅底骨板之间，直至刮铲完全位于脑下方。然后抬起刮铲以取出脑组织。使用干净的刮铲，先切除嗅球，再以梯形模式解剖额叶。接下来，将组织转移至含有保存液的15毫升离心管中。在此步骤中，使用两把无菌解剖刀将组织切碎。然后向培养皿中的切碎组织加入2.5毫升DNase-木瓜蛋白酶混合液。轻轻晃动培养皿，确保所有组织均悬浮于溶液中，未贴附于皿底。随后将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育15分钟。在生物安全柜中，使用无菌宽口移液管将全部培养基和组织转移至一支5毫升无菌冻存管中。将同一支移液管的管尖靠近管底，轻柔吹打混合液10至15次。然后向解离的细胞混合液中加入2毫升预热的DMEM 5/5培养基，盖紧离心管。轻轻颠倒混匀，于室温下以573 × g离心5分钟。在生物安全柜中，弃去所有上清液，注意不要破坏沉淀。随后，在离心管中加入1 mL预热的DMEM 5/5培养基，以重悬细胞。使用无菌的细口移液管轻轻吹打沉淀，上下吹打数次直至混合液均匀。然后将10 µL细胞悬液转移至微量离心管中。在生物安全柜外，向微量离心管中的10 µL细胞悬液加入10 µL台盼蓝。然后取10 µL台盼蓝染色后的细胞悬液，加入一次性血细胞计数板芯片中，用于细胞计数。在生物安全柜中，使用无菌微量移液器将 50 微升细胞悬液转移至每个阵列以及每个对照培养皿的中央。然后将盖好的培养皿置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 3 至 4 小时。接着，向每个 MEA 轻柔地加入 1 毫升预热的 DMEM 5/5 培养基。小心地将培养基一滴一滴地沿MEA内侧边缘加入，避免将细胞从阵列中心冲走。随后，在每个MEA上盖上带有透气性FEP膜的盖子，再放回培养箱中。两天后，用预热的DMEM+通过从培养皿中吸出旧培养基，进行完全换液。小心地将移液枪枪头置于培养皿内壁，加入一毫升预热的DMEM+培养基。后续换液时，从培养皿中吸出500微升旧培养基，再加入500微升预热的DMEM+培养基。在此过程中，每隔一天在显微镜下检查培养皿样本，观察细胞在阵列表面的覆盖情况以及是否存在细菌或真菌污染。在将培养物从培养箱中取出前，插入温度控制器并开启系统，使前置放大器的加热底板温度升至35摄氏度。然后将带盖的培养物放入前置放大器中，使MEA孔中的黑线与参考接地点对齐。确保前置放大器的针脚正确对接，使前置放大器顶部固定到位，同时培养物盖子仍保持盖上状态。接下来，在软件环境中点击“开始”，以启动信号的可视化。在主窗口中选择“Spikes”（尖峰）、“Detection”（检测）、“Automatic”（自动），将标准差值更改为负五，然后单击“Refresh”（刷新）以重置阈值。可视化信号后，单击“Stop”（停止）、“Record”（记录）和“Play”（播放）以开始记录活动。将小鼠胚胎神经元接种于60通道MEA上，可同时通过每个电极记录神经网络中的神经元活动。以下是训练前后刺激响应期间八个电极活动的代表性点阵图。垂直红线表示刺激时间，黑色刻度线表示动作电位。训练前，各通道对刺激脉冲即刻产生响应。训练后，该网络表现出更持久的活动反应，以及对刺激的即时反应。图中显示了12个训练组和10个对照组网络的平均结果，训练组网络的放电频率发生显著改变。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离和获取胚胎小鼠的神经组织，并掌握在微电极阵列上培养、记录和刺激神经网络的方法。

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神经科学

时间依赖性增加对微电极阵列刺激神经元细胞培养物的网络响应

本方案提供了在微电极阵列（MEA）上建立、维护、记录和电刺激神经元培养物所需的全部信息。In vitro...

如何在微电极阵列（MEAs）上培养、记录和刺激神经元网络

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

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使用微电极阵列测量神经元网络的电生理活动

本视频演示了使用多电极阵列（MEA）在三维共培养球体中测量突触生理学的实验步骤。该方法有助于理解三维球体内的神经网络动态以及突触网络簇状放电活动。...

利用多电极阵列测量三维共培养球体中的突触生理学

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

我们介绍一种在多电极阵列上培养原代小鼠螺旋神经节神经元外植体的方案，用于研究神经元的反应特性并优化刺激参数。此类研究旨在改善人工耳蜗植入体的神经元-电极界面，从而提高患者的听力效果，并降低设备的能量消耗。...

螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列电生理记录

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利用多电极阵列评估内分泌干扰物对脊椎动物神经网络功能发育的影响

本方案旨在演示如何结合 体外...

将微流控技术与微电极阵列结合用于研究神经元通讯及轴突信号传导

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

在微米尺度上进行3D打印，能够快速制备用于神经元细胞培养的聚合物装置。作为原理验证，通过构建影响神经突生长的屏障和通道来限制神经元之间的结构连接，同时通过细胞外电生理记录观察此类操作的功能性后果。...

双光子聚合三维打印微尺度神经元细胞培养装置

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

学习使用微电极阵列培养E17小鼠神经元网络并进行电刺激记录，以研究学习与记忆的神经机制。该方法可同时记录多位点活动，提供更高的时空分辨率。

微电极阵列上神经元细胞培养物对刺激反应的时程依赖性增强

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