Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

该方法的总体目标是快速量化果蝇黑腹果蝇的腹部色素沉着。这种方法可以帮助回答进化生物学领域的关键问题，例如识别反过来构成信任特异性变异形态基础的遗传位点，以及了解形态表型的发展和进化。该技术的主要优点是它允许用户无损地测量腹部色素沉着的各个方面，包括色素沉着的扩散和深度。

虽然这种方法可以深入了解黑腹果蝇的腹部色素沉着，但它也可以应用于其他果蝇物种，并且很容易适应测量其他昆虫和动物类群的色素沉着模式。在成像之前，可以将果蝇储存在 70% 乙醇中以保持其色素沉着。可视化需要一个安装板。

将 60 毫米培养皿中加入约 10 毫升 1.25% 琼脂的水溶液。在显微镜下，使用细镊子在凝胶中挖出一条 20 毫米长、2 毫米宽、1 毫米深的沟槽。一个盘子里可以做几个沟。

然后将果蝇嵌入沟槽中，用于分析的表面位于凝胶表面的正上方。在这种情况下，背侧是有趣的。现在，用 70% 乙醇填充培养皿，直到苍蝇完全浸没。

这减少了角质层的反射，这些反射会掩盖色素沉着模式。现在，启动连接到显微镜的成像软件和数码相机。对于光源，来自双鹅颈装置的冷光就足够了。

在图像分析软件中，将图像类型设置为 8 位。然后在图像捕捉软件中，切换 Live 设置以打开摄像机的视图窗口。将图像类型设置为 Grayscale （灰度）。

现在，将光源设置为最大强度，并将灯光放置在距离舞台约 120 毫米的位置。将显微镜设置为 60 倍放大倍率，使视野为 3 毫米宽。然后将两毫米载物台千分尺放入视野中并聚焦于它。

返回软件，调整曝光时间以使用曝光框中的视野查看千分尺。然后设置比例。打开直线工具，然后沿载物台千分尺绘制两毫米的长度。

然后在 设置比例 选项。然后，窗口应以每微米像素数显示比例。记下比例并确定调整。

现在，返回图像捕捉软件，使用 Stop 和 Snap 命令捕捉载物台千分尺的图像。然后返回图像分析软件并将图像保存为 Tiff 文件。现在，专注于已安装的苍蝇的背中线。

中线应笔直向上放置以获得最佳成像效果。将翅膀和任何其他突出的结构推到一边，调整照明以最好地照亮角质层。接下来，使用像素值直方图作为指导，在图像捕捉软件中设置曝光，以捕捉图像的整个像素范围而不饱和，从而最大限度地提高对比度。

在整个实验过程中保持这种曝光和照明。现在，在捕获图像之前，请确保感兴趣的腹部节段在视图中。然后捕获图像，并在文件名中使用样本 ID 号保存图像。

使用书面协议中描述的格式。此分析利用了作者提供的宏。要分析的图像序列应全部包含在同一个文件夹中。

现在，启动宏并按照提示的命令进行作。首先，确定存储文件的位置。然后确定分析数据的存储位置。

接下来，输入文件名中使用的字符数，以便软件正确读取图像序列。下一个提示是感兴趣区域的宽度。在这里，输入需要分析的沿前后条带的像素数。

现在，在提示符下，选择分析该系列的第一张图像。其他选项是分析系列中的下一个图像或退出分析。线条工具将自动选中。

使用它通过沿图像向前到向后绘制一条线来识别图像上的中线。接下来，按照宏提示使用线条工具识别 Tergite4 的后边缘。线条工具可用于从后中线边缘到右侧边缘绘制线条，以便线条的中心刚好位于颜料带后边缘的后方。

然后使用线条工具定义 Tergite4 的前边缘。从前中线边缘到右侧边缘画一条线。由白色方块定义的线的中间应位于浅色角质层的前边缘。

有了这些信息，宏现在会生成色素沉着概况。但是，如果刷毛或其他瑕疵穿过测量轮廓所沿的条带，则轮廓可能不准确。要更正此问题，请在直方图窗口上选择 Live preview 并调整线条，使配置文件平滑。

为了使图像分析试纸准确捕捉色素沉着的各个方面，确定一个由图像或标本不规则引起的噪声最小的分析区域至关重要。现在继续分析同一图像中的 Tergite3，然后继续下一个图像。所描述的程序用于探索由饲养温度引起的已知腹部色素沉着变化。

第三和第四个 tergites 在各种照明和曝光下进行了多次检查。探索了色素沉着的各个方面。具体来说，发现当苍蝇在较低的温度下饲养时，色素沉着带更宽。

然后将计算值与 5 名不同观察者对同一只果蝇所做的一般主观测量进行比较。在对 45 只雌性果蝇的评估中，观察到的第四腹部色素沉着带宽度的平均排名与宏观的自动测量密切相关。同样的色素沉着带也使用成像软件手动测量。

这些结果也与使用宏生成的测量值密切相关。然后测试该软件以测量雌性乌木突变体的色素沉着，众所周知，雌性黑檀木突变体在第三和第四条色素带中的色素沉着增加。该方法还用于测量野生型雌性的第 5 和第 6 腹带。

自动化技术始终提供色素密度和条带大小的有用测量。看完这个视频，你应该对如何快速准确地量化果蝇的腹部色素沉着有了很好的了解。掌握该技术主要需要深度使用镊子。

一旦掌握，该技术的成像部分可以以每小时 50 个标本的速度完成。从这些图像中提取色素沉着测量值可以以每小时 70 张图像的速度完成。