量化腹部色素沉着 黑腹果蝇

本方法的总体目标是快速量化黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的腹部色素沉积。该方法有助于回答进化生物学领域中的关键问题，例如鉴定控制特定物种间形态差异的遗传位点，以及理解形态表型的发育与进化过程。该技术的主要优势在于，它能够以非破坏性方式测量腹部色素沉积的多个方面，包括色素分布范围和沉积深度。

尽管该方法可用于研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）腹部色素沉积，也可推广至其他果蝇物种，并可轻松调整用于测量其他昆虫及动物类群的色素沉积模式。成像前，可将果蝇保存于70%乙醇中以维持其色素沉积状态。可视化过程需要使用固定垫。

在60毫米的培养皿中加入约10毫升1.25%的水琼脂。在显微镜下，使用精细镊子在凝胶中挖掘一条长约20毫米、宽2毫米、深1毫米的沟槽。一个培养皿中可制作多条沟槽。

然后将果蝇嵌入沟槽中，使其待分析的表面刚好位于凝胶表面之上。在此情况下，关注的是背侧。现在，向培养皿中加入70%乙醇，直至果蝇完全浸没。

这可以减少角质层反射，从而避免掩盖色素沉着模式。现在启动与显微镜连接的成像软件和数码相机。作为光源，双臂蛇形灯提供的冷光已足够充足。

在图像分析软件中，将图像类型设置为8位。然后在图像采集软件中，打开实时设置以开启相机的视图窗口。将图像类型设置为灰度。

现在，将光源调至最大强度，并将灯光置于距离载物台约120毫米的位置。将显微镜调至60倍放大倍数，使视野直径为3毫米。然后将2毫米的载物台测微尺放入视野中，并对其聚焦。

返回软件，通过曝光框中的设置调整曝光时间以观察显微尺。然后设置刻度。打开直线工具，沿镜台测微尺绘制两毫米长度的线段。

然后在“设置比例”选项下输入该长度。窗口将显示每微米对应的像素数。记录下该比例尺，并确认调整。

现在，返回图像采集软件，使用停止和拍摄命令捕获载物台测微尺的图像。然后返回图像分析软件，将图像保存为 Tiff 文件。现在，聚焦于固定果蝇的背中线。

为了获得最佳成像效果，应将中线垂直对准。拨开翅和其他遮挡结构，并调节光照以最佳地照亮体壁。接下来，在图像采集软件中设置曝光参数，以像素值直方图作为参考，确保捕获完整的像素范围而不出现饱和，从而最大化图像对比度。

在整个实验过程中保持相同的曝光和光照条件。现在，在拍摄图像之前，确保目标腹部节段位于视野范围内。随后拍摄图像，并使用样本编号作为文件名保存图像。

使用书面方案中描述的格式。本分析使用了作者提供的宏。待分析的图像序列应全部包含在同一文件夹中。

现在，启动宏并按照提示的命令操作。首先，确定存储文件的位置。然后，确定分析数据应保存的位置。

接下来，输入文件名中使用的字符数量，以便软件能够正确读取图像序列。随后的提示要求输入感兴趣区域的宽度。此处，输入需要分析的前-后方向条带所包含的像素数量。

现在，在提示符下选择分析该系列中的第一幅图像。其他选项包括分析系列中的下一幅图像或退出分析。此时将自动选中直线工具。

使用该工具沿图像从前到后的方向绘制一条线，以确定中线位置。接下来，根据宏提示，使用线条工具识别第四背板的后缘。使用线条工具从后中线边缘向右侧侧缘绘制一条线，使该线的中心位于色素带后缘稍偏后方的位置。

然后使用线条工具定义第四背板的前缘。从腹中线前缘画一条线至右侧侧缘。由白色方块标记的线段中点应位于浅色素表皮的前缘处。

根据这些信息，宏现在将生成一个色素分布图。然而，如果刚毛或其他瑕疵穿过用于测量分布图的条带区域，则该分布图可能会不准确。为校正此问题，请在直方图窗口中选择“实时预览”，并调整线条位置，使分布曲线平滑。

为了使图像分析条带能够准确捕捉色素沉着的各个方面，至关重要的是确定一个分析区域，以尽量减少由图像或样本不规则性引起的噪声。接下来，请在同一图像中分析 Tergite3，然后继续分析下一张图像。上述步骤描述的方法已被用于研究因饲养温度变化而导致的腹部色素沉着的已知改变。

在不同光照和曝光条件下，多次检查了第三和第四背板。探索了色素沉着的各个方面。具体发现，在较低温度下培养的果蝇，其色素沉着带更宽。

随后将计算值与五位不同观察者对同一批果蝇进行的一般主观评估结果进行比较。在对45只雌性果蝇的评估中，第四腹节色素带宽度的平均观察排序与宏程序的自动测量结果高度相关。该色素带也使用成像软件进行了人工测量。

这些结果与使用宏程序生成的测量数据也表现出高度相关性。随后，该软件被用于检测雌性 ebony 突变体的色素沉积，这类突变体已知在第三和第四色素带中具有增强的色素沉积。该方法还被用于测量野生型雌性果蝇第五和第六腹节色素带。

该自动化技术始终能够提供色素密度和条带大小的有效测量结果。观看本视频后，您应能充分理解如何快速而精确地定量分析果蝇腹部的色素沉积。掌握该技术主要需要熟练使用镊子。

一旦掌握，该技术的成像部分可达到每小时处理 50 个样本的速度。从这些图像中提取色素特征参数的速度可达每小时 70 张图像。