用于啮齿类动物脑部显微注射的个性化针头

本方法的总体目标是优化一种使用个性化可重复使用的石英针进行脑部微注射的实验方案，该石英针不会产生可检测到的组织损伤，并能确保即使在深部脑区也能实现可靠的递送。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如神经退行性疾病和精神类疾病的发病机制，以及通过病毒载体和细胞移植进行基因治疗与细胞治疗的效果。该方法的主要优势在于，这些石英针不会造成可检测的组织损伤，从而确保了在深部脑区的可靠递送。

它们具有成本效益，因为可以清洗后重复使用。开始此操作前，将石英毛细管放入蒸馏水中清洗5分钟，再在99%乙醇中放置5分钟，随后在二乙醚中放置5分钟，以完成清洁和灭菌。

然后将毛细管置于通风橱中至少一小时，使其完全干燥。在此期间，使用激光拉制仪制备细长的针头。随后将针头放入先前用70%乙醇清洗过的培养皿中。

用塑料封口膜覆盖培养皿。接着，在显微解剖镜下切断毛细管。将针头牢固地固定在显微镜载物台上，并将其尖端置于电脑屏幕中央。

在菜单栏上，单击铅笔图标，并用其绘制标记以确定针头的切割位置。在侧边栏功能中，选择包含“开始切割”按钮的标志，以启动激光切割先前标记的位置。如有需要，可在不重新定位针头的情况下，通过绘制标记并重复切割步骤来切割侧面的小孔。

切割针头后，通过塑料管将其连接至真空泵。接着启动泵，并手动将正向流速设置为每分钟3 µL。然后依次吸取99%乙醇和蒸馏水，以去除因切割产生的杂质。

随后，再次吸除99%乙醇以利于干燥。之后，将针头存放于适当盖好的培养皿中，直至手术当天使用。若需重复使用针头，在实验结束时，应使用适当的洗涤剂和70%乙醇清洗，以去除注射液及可能残留的组织。

如有需要，这些针头甚至可以在装有蒸馏水的专用玻璃瓶中煮沸。在此步骤中，选择设置菜单，根据显微注射器的直径与体积比校准泵，并将流速设置为 0.3 微升每分钟。

然后用无菌水填充一支10毫升的注射器，并用其填充手动显微注射泵的显微注射器及注射组件套件。之后，将注射针连接至手动显微注射泵套件上。

缓慢推动活塞的同时，将10毫升注射器从显微注射器上断开，以便在显微注射器顶端留下一滴水。然后，将活塞插入显微注射器中。接着，将显微注射器连接至泵，并将流速设定为0.3 µL/min。

随后，将流速调整为 0.1 微升每分钟，并开始手术操作。进行手术时，剃除动物头部毛发，并用酒精棉片清洁。接着，将大鼠置于立体定位仪中。

使用无菌手术刀在颅骨上做一个纵向切口。操作时应轻柔，以避免过度出血。随后，用扁平刮刀打开头皮，并在皮肤瓣上使用外科夹固定，以保持切口开放。

非常轻柔地剥离骨膜，暴露前囟以及将要插入针头的颅骨区域。随后，将臂固定在立体定位仪框架上，将针尖移至前囟正上方，注意避免损坏针尖。记录前囟的前后向和内外侧坐标，并将针头移动至目标坐标位置。

然后，降低针头，使其尖端几乎接触颅骨，在稍微抬起立体定位臂后标记钻孔位置。在标记的位置钻开颅骨，注意不要损伤脑膜和脑组织。接着，剪取一小片塑料石蜡膜并将其放置在颅骨上。

使用10微升移液器，在塑料石蜡膜上滴加一滴溶液。停止泵运行，轻微回拉泵的推杆，并通过轻轻拉动显微注射器的活塞在毛细管中形成一个小气泡。降低针尖，直至其接触到液滴。

通过缓慢拉动显微注射器的活塞吸取样品，避免产生气泡。将泵的推杆重新与活塞接触，然后以每分钟0.3微升的流速启动泵。随后，等待液滴形成后再进行下一步操作。

随后，将流速降低至 0.1 微升每分钟。使用不锈钢斜面针头划破硬脑膜，并缓慢下放针头以进入脑组织。当到达目标位置后，再继续下降 0.1 毫米，然后停止泵送。

将体视显微镜的固定臂升高0.1毫米，并以0.3微升/分钟的流速重新启动泵。随后启动计时器并开始注射。注射过程中监测气泡的移动情况。

最后，停止泵送，等待五分钟，然后缓慢取出针头。当石英针完全拔出后，重新启动泵，并检查针尖处是否有液滴形成。接着，用骨蜡封闭颅骨表面的开口。

移除固定夹并缝合头皮。在伤口周围涂抹抗生素软膏，然后将动物放回饲养笼中。这些是大鼠脑组织在纹状体水平的8微米冠状切片。

该图像显示了使用26号钝端不锈钢针头注射两微升ACSF后产生的损伤。相反，使用石英针头注射的纹状体未显示出任何可检测到的损伤。这些其他图像显示了两种针头在背侧海马水平诱导的损伤情况。

但石英针未造成任何可检测到的损伤。通过台盼蓝的分布情况可证实两种针头注射均成功。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成。

通过这些操作步骤，可以进一步开展其他手术，以回答不同的科学问题，例如药物诱导效应。该技术的发展为神经科学领域的研究人员探索毒素、药物，以及近年来的基因治疗和细胞治疗产品在动物模型中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用定制的石英针在脑深部区域进行显微注射，并确保不产生可检测到的损伤。

请注意，使用激光显微切割的试剂和/或病原体可能具有极高危险性。在进行该操作时，必须始终采取激光安全防护措施和个人防护装备等预防措施。