通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

本实验的总体目标是评估中枢神经系统（CNS）内不同巨噬细胞亚群所表达的各种标志物。该方法有助于回答神经免疫学领域中的关键问题，例如在我们试图研究CNS中巨噬细胞的功能时，这些细胞的表型特征是什么。该技术的主要优势在于能够分离出大量高纯度的巨噬细胞亚群，并对巨噬细胞亚群的细胞标志物进行鉴定。

首先使用精细剪刀在剑突下方剪开腹侧皮肤，以暴露胸腔。在膈肌上做切口，并从尾侧向头侧方向剪开肋骨的两侧，以暴露心脏。确定左心室和右心房后，将带有25号针头的蝶形导管插入左心室。

在右心房做一切口，一旦血液开始流出，立即通过导管以每分钟10毫升的速度灌注20毫升PBS。当血液被置换时，肺和肝脏出现褪色，表明灌注成功。接下来，使用精细剪刀解剖脊柱。

在脊柱腹侧切除腹壁肌肉组织，并在尾部基底处切断椎骨，以取出脊柱。将装有磷酸盐缓冲液（PBS）的10毫升注射器（配备经改造的200微升移液器吸头）插入脊柱腰段侧面，然后从颈段一侧冲洗脊髓。

去除颅骨上方的皮肤，将剪刀的一侧刀尖插入颅骨基部。沿矢状缝剪开颅骨，然后将小镊子插入切口，轻轻移除颅骨顶部。

从小鼠头部解剖出脑组织，并切除嗅球和小脑。然后将脑组织和脊髓放入含有1.128毫升消化液的一点五毫升离心管中。为分离细胞，使用小剪刀将脑组织和脊髓精细剪切成1至2立方毫米大小的组织块，并将组织块置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育30分钟。

孵育结束后，加入20微升0.5摩尔的EDTA终止消化反应，随后用5毫升移液器轻轻吹打。使用10毫升注射器的推杆将所得细胞悬液通过70微米细胞筛过滤至50毫升锥形管中，以轻轻研磨任何残留的脑或脊髓组织。用20毫升含5% FBS的PBS冲洗细胞筛。

通过离心收集过滤后的细胞。然后，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。对于细胞的密度梯度分离，我们将沉淀重悬于4毫升30%密度梯度介质中，并将细胞转移至15毫升锥形管中。

在37%密度梯度介质下方轻轻铺加4毫升37%密度梯度介质，随后在37%密度梯度介质下方再铺加4毫升70%密度梯度介质。将试管转移至台式离心机中以分离细胞。小胶质细胞和巨噬细胞将位于70%与37%密度梯度层的界面处。

试管将呈现分层现象。小心移除上层髓鞘后，将3至4毫升的微胶质细胞-巨噬细胞界面层转移至新的15毫升试管中。随后用15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）通过三次离心洗涤免疫细胞，最后一次洗涤后将沉淀重悬于1毫升PBS中。

为了评估巨噬细胞亚群标志物的表达，将细胞转移至5毫升流式细胞术分析管中，随后加入1微升可固定死细胞染色试剂。置于冰上避光孵育30分钟后，用2毫升PBS洗涤样本，并将细胞沉淀重悬于每管实验分析管中400微升FACS缓冲液中。将细胞分装至适当数量的5毫升流式细胞术分析管中。

然后，在冰上避光孵育10至15分钟，每100 µL细胞加入1 µg CD16/CD32封闭抗体混合物，以阻断非特异性Fc受体结合。接着，加入100 µL相应的初级抗体对细胞进行标记，在冰上避光孵育30分钟。孵育结束后，用2 mL PBS洗涤细胞四次。

然后在冰上避光孵育30分钟，加入100 µL相应的二抗，随后如上所述用PBS洗涤四次。最后一次洗涤后，在避光条件下，将细胞沉淀轻轻重悬于100 µL的1%多聚甲醛中，室温固定15分钟。然后将细胞用PBS洗涤四次。

将最终的沉淀重悬于200微升新鲜PBS中，并通过流式细胞术分析细胞。基于CD11B和CD45的表达情况，可鉴定出脑和脊髓来源的小胶质细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞。CD11B阳性、CD45中等表达的小胶质细胞表达CX3CR1和Tmem119，借此可进一步将其与CD11C阳性、CD45高表达的单核细胞来源巨噬细胞区分开来，后者不表达这两种标志物，但表达CCR2。

经过密度梯度分离后，仍有85%至95%的细胞保持活性。若未进行密度梯度分离，由于存在非巨噬细胞和髓鞘碎片，无法在前向散射-侧向散射图中识别巨噬细胞亚群。由于抗Tmem119抗体识别的表位位于细胞内，因此需要进行透化处理，以标记这一重要的小胶质细胞标志物。

请注意，透化处理会导致细胞收缩，从而使巨噬细胞亚群在前向散射与侧向散射分析中显得更小。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行该操作时，务必牢记需非常小心地设置密度梯度。

完成此操作后，可采用其他方法（如定量 rt-PCR）进一步探究巨噬细胞亚群的信号通路。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索神经系统疾病小鼠模型中巨噬细胞亚群的活化提供了途径。观看本视频后，您应能够独立开展检测，或沿用本方法通过流式细胞术分析巨噬细胞亚群。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行本实验操作时必须采取防护措施，例如在通风橱中操作。