Name: 通过流式细胞术分析来自中枢神经系统的小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解如何使用流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞亚群。该方法可精确鉴定细胞表面标志物，为神经免疫学研究提供可靠的技术框架。

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本工作获得了法国国家研究署（ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD）、法国阿尔茨海默病协会和法国公共投资银行的资助。我们的实验室还得到了法国国家健康与医学研究院（Inserm）、法国国家科学研究中心（CNRS）、皮埃尔与玛丽·居里大学以及“未来投资计划”（ANR-10-IAIHU-06，IHU-A-ICM）的支持。&#34;Investissements d'avenir&#34;。我们谨此感谢CELIS细胞培养核心设施提供的协助。&#160;

本研究所述所有方法均已获得ICM研究所机构动物护理和使用委员会以及Darwin French动物伦理委员会的批准，涵盖在方案01407.02之下。
1. 准备
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中配制消化液混合物，每只小鼠所需成分为：1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）；123 µL消化酶（见材料表），浓度为13 wunsch/mL（储存液），终浓度为1.6 wunsch/mL；以及5 µL DNase I（见材料表），浓度为100 mg/mL（储存液），终浓度为0.5 mg/mL。</li>
</ol>
2. 灌注与解剖
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠致死剂量（100 µL，400 mg/mL）处死小鼠。</li>
	<li>将动物仰卧放置，并用70%乙醇润湿身体表面。</li>
	<li>用精细剪刀在剑突下方剪开腹侧皮肤，暴露胸腔。</li>
	<li>切开膈肌，并用精细剪刀从尾侧向头侧方向剪开肋骨两侧，以暴露心脏（注意避免损伤其他器官）。辨认左心室（LV）和右心房（RA）。</li>
	<li>将带有25 G针头的蝶形导管插入左心室。用精细剪刀剪开右心房，在血液开始流出时，通过左心室以10 mL/min的流速灌注20 mL PBS，以清除血管中的细胞和血液；当肺和肝脏因血液被置换而变苍白时，表明灌注成功。</li>
	<li>用中型剪刀剪下动物头部。用精细剪刀解剖脊柱，并通过切除脊柱腹侧的腹壁肌肉以及在尾部基底处切断椎骨，将脊柱与身体分离。</li>
	<li>将装有PBS的10 mL注射器和连接的200 µL移液器吸头插入脊柱腰段，从颈段冲洗脊髓。 
	注意：将200 µL移液器吸头的最宽端（约1 cm）用剪刀剪开，并紧密安装在预先装满PBS的10 mL注射器上。</li>
	<li>去除颅骨上方的皮肤，用镊子暴露脑组织。将剪刀尖插入颅底，沿矢状缝剪开颅骨。将小镊子插入切口，轻轻抬起颅骨。将脑组织从小鼠头部剥离，并切除嗅球和小脑。</li>
	<li>将脑组织和脊髓收集至含有1.128 mL PBS消化液混合物（来自步骤1.1）的1.5 mL离心管中。</li>
</ol>
3. 细胞解离
<ol>
	<li>用小剪刀将1.5 mL离心管中的脑和脊髓组织（步骤2.9）精细剪切成1–2 mm3大小的组织块（图1）。</li>
	<li>将含有剪碎组织的1.5 mL离心管置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟。 
	注意：在此步骤中准备密度梯度液。</li>
	<li>向1.5 mL离心管中加入20 µL 0.5 M EDTA（储存液），终浓度为10 mM，以终止酶反应。</li>
	<li>用5 mL移液器轻轻吹打，制成单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液通过装在50 mL离心管上的尼龙滤网（孔径70 µm），使用10 mL注射器的推杆推动细胞悬液过滤。</li>
	<li>用20 mL含5%胎牛血清（FBS）的PBS冲洗尼龙滤网。</li>
	<li>室温（18 °C）下离心7分钟（300 × g）。用移液器小心吸弃上清液后进入下一步操作。去除上清液时务必格外小心，避免扰动沉淀物，以防沉淀被移液器吸入而丢失。</li>
</ol>
4. 密度梯度
<ol>
	<li>通过向密度梯度介质中加入适量的10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS），配制密度梯度介质的储备液。 
	注意：将1份10x PBS加入9份密度梯度介质中。</li>
	<li>按照 表1 所述，用1x PBS将储备密度梯度介质稀释成不同浓度。</li>
	<li>用4 mL 30%密度梯度介质重悬步骤3.7所得沉淀，并转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>将一根巴斯德吸管插入15 mL离心管底部，缓慢加入4 mL 37%密度梯度介质，使其位于下层。</li>
	<li>按照上述方法，加入4 mL 70%密度梯度介质。</li>
	<li>在室温（18 °C）下以800 × g离心40分钟。确保离心机停止时制动最小或无制动，以免干扰界面层。 
	注意：离心后管内液体将呈现分层现象。位于70%与37%密度梯度界面处的细胞为单核免疫细胞（小胶质细胞和巨噬细胞亚群）；上层分别为细胞碎片和髓鞘（图2）。</li>
	<li>使用移液器小心移除髓鞘层。</li>
	<li>收集3–4 mL位于70%–37%密度梯度界面的细胞悬液（含巨噬细胞亚群），转移至洁净的15 mL离心管中。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，每次总体积为15 mL。确保含有细胞的密度梯度介质至少被PBS稀释三倍，并在4 °C下以500 × g离心7分钟，离心时制动需设为 &#34;开启&#34;。</li>
	<li>用1 mL PBS重悬细胞沉淀，用于细胞标记或其他功能检测。</li>
</ol>
5. 流式细胞术的细胞标记
<ol>
	<li>将细胞（步骤 4.10）转移至流式细胞术管中。</li>
	<li>向步骤 4.10 中获得的每份细胞样品加入 1 µL 可固定死细胞染色试剂。冰上孵育 30 分钟，避光。</li>
	<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞一次，离心 5 分钟（300 × g，4 °C）。</li>
	<li>吸除上清液，用 400 µL 含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 重悬细胞沉淀。</li>
	<li>向 100 µL 细胞中加入 1 µg CD16/CD32 抗体以阻断 Fc 受体。冰上孵育 10–15 分钟，避光。</li>
	<li>在含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 或含 1% BSA、0.1% 叠氮化钠和 0.25% 皂苷的 PBS 中配制一抗混合液，用于细胞通透及胞内染色。</li>
	<li>加入 100 µL 一抗混合液（2×），冰上孵育 30 分钟，避光。 
	注意：所有抗体在实验前均应进行滴定，以确保最佳结果。</li>
	<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞，离心 5 分钟（300 × g，4 °C）。重复此步骤三次。</li>
	<li>若一抗未直接偶联荧光染料，则加入 100 µL 二抗，冰上孵育 30 分钟，避光。</li>
	<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞，于 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。重复此步骤三次。</li>
	<li>用 100 µL 1% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 15 分钟，避光。 
	注意：警告：PFA 具有毒性。应在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。</li>
	<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞，于 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。重复此步骤三次。</li>
	<li>用 200 µL PBS 重悬细胞沉淀，进行流式细胞术检测与分析。参照图 3中的设门策略。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

已有研究表明，小胶质细胞和骨髓源性巨噬细胞（MDM）在中枢神经系统中具有不同的功能和表型，因此鉴定和分析这些巨噬细胞亚群对于深入理解神经系统疾病至关重要。9,18,25通过使用两种标记物（CD11b 和 CD45）进行流式细胞术分析，可区分各亚群图3C）。该策略先前已通过使用其他特异性标志物（如用于单核细胞来源巨噬细胞的 CCR2 和用于小胶质细胞的 CX3CR1）进行验证，并结合最近开发的一种使用抗 Tmem119 抗体的方法图3E-3G）。我们使用 CCR2 和 CX3CR1 抗体进行了实验（图3F，3G如我们先前发表的那样18</su...

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）实质组织中的常驻巨噬细胞。它们具有两个关键功能：免疫防御以及维持中枢神经系统的稳态。与来源于骨髓造血干细胞并持续更新的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）不同，小胶质细胞起源于胚胎发育期间由卵黄囊（YS）产生的原始造血祖细胞，并在胚胎期定植于脑组织1,2,3。在啮齿类动物中，转录因子Myb对所有骨髓来源的单核细胞和巨噬细胞的发育至关重要，但对于卵黄囊来源的小胶质细胞而言，该因子并非必需，其分化过程仍依赖于转录因子PU.14。
在健康的中枢神经系统（CNS）中，小胶质细胞是具有动态特性的细胞，能够持续监测其周围环境，扫描并识别入侵的病原体或组织损伤5。一旦检测到此类信号，便会启动一系列反应以修复损伤。小胶质细胞会迅速从分支状形态转变为阿米巴样形态，随后进行吞噬作用，并释放多种介质，如促炎性或抗炎性细胞因子。因此，根据其所处的微环境不同，活化的小胶质细胞可获得一系列不同的致敏状态6。
小胶质细胞对多种神经系统疾病的发育和进展具有深远影响。在阿尔茨海默病（AD）7、肌萎缩侧索硬化症（ALS）8、多发性硬化症（MS）9 或帕金森病（PD）10 的啮齿类动物模型中，小胶质细胞表现出双重作用：既可诱导有害的神经毒性，也可发挥神经保护作用，具体作用取决于特定疾病类型、疾病阶段以及是否受到全身免疫系统的影响7,8,9,10,11。上述疾病中观察到的大多数中枢神经系统（CNS）病变均包含异质性的髓系细胞群体，不仅包括实质小胶质细胞，还包括血管周围和软脑膜巨噬细胞，以及浸润中枢神经系统的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）。这些不同类型的细胞可能在与损伤和修复相关的病理生理机制中发挥差异性作用7,12,13,14,15。目前，研究这些疾病模型的研究人员面临的主要挑战在于：确定外周单核细胞和巨噬细胞是否浸润中枢神经系统，以及如果发生浸润，如何将常驻小胶质细胞与这些浸润细胞区分开来。事实上，小胶质细胞具有高度可塑性；当其被激活时，会重新表达通常由外周单核细胞和巨噬细胞表达的标志物。因此，关键问题在于识别能够区分常驻小胶质细胞与浸润性单核细胞及巨噬细胞的特异性标志物。
由于缺乏特异性抗体，通过免疫组织化学方法在脑切片上区分这些细胞群体存在局限性。然而，流式细胞术是一种有效的技术，可用于检测多种标志物的表达，并区分不同的细胞群体（例如淋巴细胞、巨噬细胞/单核源性巨噬细胞 CD11b+CD45high，以及小胶质细胞 CD11b+CD45med）以及细胞亚群16,17,18。本实验方案描述了在神经系统疾病小鼠模型中，通过优化的酶法组织解离和密度梯度离心法分离中枢神经系统单个核细胞的操作步骤；同时介绍了一种利用流式细胞术区分中枢神经系统中小胶质细胞与单核源性巨噬细胞群体的方法。
另一种方法是利用与特异性抗体偶联的磁珠去除髓鞘并纯化细胞19,20,21。使用抗髓鞘磁珠去除髓鞘的方法成本较高，且会影响分离细胞的存活率和得率22。该步骤以及后续的小胶质细胞免疫磁珠分离过程，限制了对特定免疫细胞亚群的进一步研究21,22。
这些实验步骤为研究疾病发展过程中巨噬细胞亚群提供了简便的方法，并可用于确定药物作用或基因修饰对巨噬细胞表型及活化状态的影响。

<table><tbody><tr><td>5月龄小鼠</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL 研究级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>消化酶</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 尼龙细胞滤筛</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>活塞式注射器 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x)，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>30% 牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>注意 - 有毒</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 大鼠抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-氰青5.5 标记大鼠 IgG2b K 同型对照</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 大鼠抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 大鼠 IgG2b, &amp;kappa; 同型对照 RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠 TMEM119（克隆28 - 3）</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 驴抗兔 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/CD32 纯化抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>小鼠 Fc 封闭</td></tr><tr><td>可固定死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CCR2 APC 标记抗体</td><td>R&amp;D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2B APC 标记同型对照</td><td>R&amp;D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CX3CR1 PE 标记抗体</td><td>R&amp;D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>山羊 IgG PE 标记抗体</td><td>R&amp;D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>标准型镊子</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

大量研究已证实免疫细胞，特别是巨噬细胞，在中枢神经系统（CNS）病理过程中的作用。CNS中存在两类主要的巨噬细胞群体：（i）小胶质细胞，即CNS的常驻巨噬细胞，起源于胚胎发育过程中的卵黄囊前体细胞；（ii）单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），可在疾病状态下侵入CNS，起源于骨髓前体细胞。不同巨噬细胞亚群的功能因所研究的病理类型而异。此外，目前尚无统一共识确定用于区分这些巨噬细胞亚群的组织学标志物或判别标准。然而，通过流式细胞术分析CD11b和CD45标志物的表达谱，可有效区分小胶质细胞（CD11b+CD45med）与MDM（CD11b+CD45high）。在本实验方案中，我们证明密度梯度离心结合流式细胞术分析可用于表征这些CNS巨噬细胞亚群，并检测这些细胞表达的多种目标标志物，正如我们近期所发表的研究。因此，该技术有助于深入理解巨噬细胞在神经疾病小鼠模型中的作用，也可用于评估药物对这些细胞的影响。

经密度梯度离心及抗体染色后，使用流式细胞仪采集细胞，并按如下形态学设门策略进行分析。首先在前向散射面积（FSC-A）点图中设定第一个门 与 前向散射高度（FSC-H）用于区分单细胞与双联体（doublets）图 3A）。随后将单细胞根据FSC-A进行门控 与侧向散射面积（SSC-A）点图，用于根据细胞相对大小和细胞颗粒度排除细胞碎片和固缩细胞图3B然后，根据小胶质细胞和单核细胞来源巨噬细胞（MDM）对 CD11b 和 CD45 标记物的表达水平进行鉴定（图3C, 三维）。最后，针对每种巨噬细胞亚群分析了其他表达标志物（图3E-3G）。据报道，小胶质细胞表达 CX3CR1，但不表达 CCR2 标志物，而与之不同的是单核细胞来源的巨噬细胞...

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。

大量研究已证实免疫细胞，尤其是巨噬细胞，在中枢神经系统（CNS）病理过程中的作用。主要有两种...

本实验的总体目标是评估中枢神经系统（CNS）内巨噬细胞亚群所表达的各种标志物。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题，例如在研究CNS稳态与疾病过程中小胶质细胞的作用，以及CNS内巨噬细胞的表型特征。该技术的主要优势在于能够分离获得大量高纯度的巨噬细胞亚群，并实现对巨噬细胞亚群细胞标志物的鉴定与表征。首先使用精细剪刀在剑突下方剪开腹侧皮肤，以暴露胸腔。切开膈肌，并从尾侧向头侧方向剪开肋骨的侧缘，以暴露心脏。确定左心室和右心房后，将带有25号针头的蝶形导管插入左心室。在右心房做一切口，并立即以每分钟10毫升的速度通过导管灌注20毫升磷酸盐缓冲液（PBS），当血液开始流出时即开始灌注。成功的灌注表现为肺和肝脏因血液被置换而出现出苍白。接下来，使用精细剪刀解剖脊柱。沿脊柱腹侧切除腹壁肌肉，并在尾部基底处切断椎骨，以取出脊柱。将装有10毫升PBS并配有经改造的200微升移液头的注射器插入脊柱腰段一侧，随后从颈段侧冲洗脊髓。去除颅骨上方的皮肤，将剪刀的一侧刀尖插入颅骨基部。沿矢状缝剪开颅骨，然后将小镊子插入切口，轻轻移除颅骨顶部。从鼠头中解剖出脑组织，并移除嗅球和小脑。然后将脑组织和脊髓放入含有1.128 mL消化液的1.5 mL离心管中。为分离细胞，使用小剪刀将脑和脊髓精细剪切成1至2 mm³的组织块，并将组织块置于37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。孵育结束后，加入20微升0.5摩尔的EDTA终止消化，随后用5毫升移液器轻柔吹打。使用10毫升注射器的推杆将所得细胞悬液通过70微米细胞筛过滤至50毫升锥形管中，以轻柔压碎任何残留的脑或脊髓组织。用20毫升含5% FBS的PBS冲洗细胞筛。通过离心收集过滤后的细胞。然后，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。对于细胞的密度梯度分离，我们将沉淀重悬于4毫升30%密度梯度介质中，并将细胞转移至15毫升锥形管中。轻柔地在下方加入4毫升37%密度梯度液，随后在37%密度梯度液下方加入4毫升70%密度梯度液。将试管转移至台式离心机中以分离细胞。小胶质细胞和巨噬细胞将位于70%与37%密度梯度层的界面处。试管将出现分层现象。小心移除上层的髓鞘后，将3至4毫升的微胶质细胞-巨噬细胞界面层转移至新的15毫升离心管中。随后用15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）对免疫细胞进行三次离心洗涤，最后一次洗涤后将沉淀重悬于1毫升PBS中。为了评估巨噬细胞亚群标志物的表达，将细胞转移至5 mL流式细胞术分析管中，随后加入1 µL可固定死细胞染色试剂。冰上避光孵育30分钟后，用2 mL PBS洗涤样本，并将细胞沉淀重悬于每管实验分析管中400 µL的fax缓冲液中。将细胞分装至适当数量的5 mL流式细胞术分析管中。然后，在冰上避光孵育10至15分钟，每100 µL细胞加入1 µg CD 16 CD 32封闭抗体混合物，以阻断非特异性FC受体结合。接着，加入100 µL相应的一抗抗体标记细胞，在冰上避光孵育30分钟。孵育结束后，用2 mL PBS洗涤细胞四次。然后加入100微升相应的二抗，冰上孵育30分钟，避光；随后如前所述用PBS洗涤四次。最后一次洗涤后，将沉淀物轻轻重悬于100微升1%多聚甲醛中，室温孵育15分钟，避光。然后用PBS将细胞洗涤四次。将最终的沉淀物重悬于200 µL新鲜PBS中，并通过流式细胞术分析细胞。基于CD11B和CD45的表达情况，可鉴定出脑和脊髓来源的小胶质细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞。CD11B阳性、CD45中等表达的小胶质细胞表达CX3CR1和Tmem119，从而可进一步将其与CD11C阳性、CD45高表达的单核细胞来源巨噬细胞区分开来；后者不表达这两种标志物，但表达CCR2。经密度梯度分离后，85%至95%的细胞仍具有活性。若不进行密度梯度分离，由于存在非巨噬细胞和髓鞘碎片，无法在前向散射-侧向散射散点图中识别巨噬细胞亚群。由于抗Tmem119抗体识别的表位位于细胞内，因此需要进行透膜处理，以标记这一重要的小胶质细胞标志物。请注意，透化处理会导致细胞收缩，从而使巨噬细胞亚群在前向散射与侧向散射分析中显得更小。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行该操作时，务必牢记需非常小心地设置密度梯度。完成此操作后，可采用其他方法（如定量 rt-PCR）进一步探究巨噬细胞亚群的信号通路。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索神经疾病小鼠模型中巨噬细胞亚群的活化机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够独立开展检测，或沿用本方法通过流式细胞术分析巨噬细胞亚群。请勿忘记，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时应始终采取防护措施，例如在通风橱中操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过流式细胞术分析来自中枢神经系统的小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G...

使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。...

利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

本方案提供了一种将完整眼球消化为单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析，以鉴定特定的眼部单核吞噬细胞群体，包括单核细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞。...

小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。...

利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。...

利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。...

微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

了解如何使用流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞亚群。该方法可精确鉴定细胞表面标志物，为神经免疫学研究提供可靠的技术框架。

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

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