双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本实验的总体目标是鉴定逆转录病毒载体在宿主基因组中的整合位点，并量化共享相同整合位点的各个克隆细胞群体的相对频率。该方法有助于回答逆转录病毒基因治疗中的关键问题，例如载体整合到了宿主基因组的哪个区域、基因工程改造的细胞在移植后将如何重新增殖，以及它们在功能上存在哪些差异。该技术的主要优势在于，通过同时测序载体与宿主DNA上下游连接区域，可更准确、更灵敏地分析逆转录整合位点序列。

尽管该方法可为基因治疗研究中载体和基因工程细胞的安全性提供参考，也可应用于其他基础生物学研究，以探究单个细胞在体内的行为。本实验的第一步是测定待分析基因组DNA的浓度，以及其在260和280纳米波长处的吸光度比值。随后，使用无核酸酶水将一至两微克的样本基因组DNA稀释至终体积为170微升的基因组DNA溶液。

在微量离心管中混合以下组分，配制200微升PCR反应液：2.5微升HIV-1特异性生物素引物（若使用四种慢病毒特异性引物，则共10微升）、20微升10X耐热DNA聚合酶缓冲液、4微升10毫摩尔dNTPs、3微升耐热DNA聚合酶，以及163微升基因组DNA。将溶液均等分至四个PCR管中，并在以下条件下进行一次延伸循环。

94 摄氏度 5 分钟，56 摄氏度 3 分钟，72 摄氏度 5 分钟，4 摄氏度保存。将全部四个 PCR 反应产物合并至一个 2 毫升微量离心管中。按照 PCR 纯化试剂盒的生产商操作步骤进行纯化，并用 50 微升洗脱缓冲液洗脱。

准备100微升的消化反应，将以下组分加入一个微量离心管中：50微升DNA、10微升10X缓冲液A、2微升RSAI酶以及38微升无核酸酶水。在37摄氏度的热循环仪中孵育一小时。

接下来，向反应体系中加入1 µL CviQI酶，在25°C下孵育30分钟。当RSAI和CviQI消化反应完成后，立即进行平末端处理。准备4.5 µL混合液，其中包含2.5 µL DNA聚合酶I大片段和2 µL 10 mM dNTPs。

取1微升混合物加入DNA样品中，总体积为102微升。充分涡旋混匀，于25摄氏度孵育1小时。

孵育完成后立即进行链霉亲和素磁珠结合。通过短暂涡旋混匀磁珠溶液，并将50 µL转移至新的2 mL微量离心管中。使用磁力架去除上清液，并用200 µL结合缓冲液洗涤磁珠。

将磁珠重悬于100微升结合溶液中，并将离心管从磁力架上取下放置。取100微升样品DNA加入至100微升重悬的磁珠溶液中，通过移液小心混匀，避免溶液产生气泡。将离心管置于旋转摇床上，室温孵育3小时。

使用磁力架捕获磁珠，并弃去上清液。用400微升洗涤液洗涤磁珠两次，再用400微升1×T4 DNA连接酶缓冲液洗涤两次。将磁珠重悬于200微升1×T4 DNA连接酶缓冲液中，然后将其移离磁力架。

连接子连接反应应在链霉亲和素磁珠结合后立即进行。在2毫升微量离心管中混合以下组分，配制400微升连接反应体系：0.5微升DNA连接子、10微升10X T4 DNA连接酶缓冲液、20微升5X T4 DNA连接酶缓冲液、5微升T4 DNA连接酶、164.5微升无核酸酶水以及200微升重悬的磁珠。

将反应管置于室温下的旋转轮上孵育3小时。用洗涤液洗涤磁珠2次，再用1×耐热DNA聚合酶缓冲液洗涤2次。将磁珠重悬于50 µL的1×耐热DNA聚合酶PCR缓冲液中，并将其移离磁力架。

开始此实验步骤时，通过向重悬的磁珠中加入以下组分来配制一个200微升的PCR反应体系：10微升1L引物、10微升1R引物、20微升引物Link1、10微升10×耐热DNA聚合酶缓冲液、4微升10毫摩尔dNTPs、8微升耐热DNA聚合酶以及88微升无核酸酶水。将反应混合物分装至四个PCR管中，并按照以下条件进行PCR扩增。

94 摄氏度预变性 2 分钟，然后进行 25 个循环：94 摄氏度变性 20 秒，56 摄氏度退火 25 秒，72 摄氏度延伸 2 分钟，最后在 72 摄氏度进行最终延伸 5 分钟。将全部四个 PCR 反应产物合并至一个 2 ml 微离心管中。按照 PCR 纯化试剂盒的操作步骤进行纯化，并用 50 µL 洗脱缓冲液洗脱。

使用紫外-可见分光光度计测定DNA浓度以及260纳米与280纳米处吸光度的比值。DNA现在可于-20°C保存，直至进行下一步实验。由于左连接区和右连接区特异性扩增的实验步骤完全相同，仅PCR中所用引物不同，因此仅演示左连接区的扩增过程。

在PCR管中混合以下组分，配制50微升PCR反应体系：5微升DNA、5微升10微摩尔的2L引物、5微升10微摩尔的Link2引物、5微升10X耐热DNA聚合酶缓冲液、1微升10毫摩尔的dNTPs、2微升耐热DNA聚合酶，以及27微升无核酸酶水。按以下条件进行PCR反应。

94摄氏度预变性3分钟，进行8到15个循环：94摄氏度变性20秒，56摄氏度退火25秒，72摄氏度延伸2分钟，最后在72摄氏度延伸5分钟。使用PCR纯化试剂盒纯化DNA，并用50微升洗脱缓冲液洗脱。测定DNA浓度及在260纳米和280纳米处的吸光度比值。

生成左右侧接序列文库的最后一步是通过毛细管电泳分析PCR扩增子的长度变异。该代表性结果展示了慢病毒载体整合位点中上游和下游载体-宿主接合处PCR扩增子长度的差异。DNA大小标记位于M泳道。

对PCR扩增子进行测序后，使用内部开发的编程脚本进行计算整合位点序列分析。双向整合位点检测通过毛细管电泳可观察到慢病毒载体上游和下游的病毒-宿主连接处产生不同大小的PCR扩增子。通过对人源化小鼠重建造血细胞中慢病毒载体在Alu和L1重复序列区域的基因内整合比例与计算机模拟生成的随机整合事件进行比较，结果表明整合位点在基因中显著富集。

仅使用产生小于500 bp PCR扩增子的整合位点连接序列读数来计算载体整合子的相对检测频率。约77%的载体可通过双向方法进行定量分析。在克隆定量策略中，我们假设每个独立克隆具有相同的载体整合子。

左右连接的相对频率被合并以表示克隆群体的相对数量，即QVI。该配色方案展示了人源化小鼠重建造血细胞中44个QVI克隆的相对频率。根据计算机模拟的10,000次随机整合分析，使用GTAC基序酶时，克隆频率预计被高估1.25倍，而使用TCGA基序酶时，预计被高估2.56倍。

一旦掌握，该技术可分阶段进行，若操作得当，可在两天内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记 PCR 步骤极为敏感，必须采取预防措施以避免任何污染。该技术为研究治疗性逆转录病毒载体的安全性，以及探索移植后恒河猴造血干细胞克隆的长期重群体化模式奠定了基础。