双向逆转录病毒整合位点PCR方法和定量数据分析工作流程

该程序的总体目标是识别宿主基因组中的逆转录病毒载体整合位点，并量化每个克隆细胞群共享相同整合位点的相对频率。这种方法可以帮助回答逆转录病毒基因治疗中的关键问题，例如宿主基因组载体的哪一部分已经整合，基因工程细胞在移植后将如何重新繁殖，以及它们在功能上有何不同。该技术的主要优点是，通过同时对上游和下游载体宿主 DNA 连接进行测序，可以以更高的准确性和灵敏度分析逆整合位点序列。

虽然这种方法可以深入了解基因治疗研究中载体和基因工程细胞的安全性，但它也可以应用于其他基础生物学研究，以研究体内单个细胞的行为。该程序的第一步是确定待分析基因组 DNA 的 DNA 浓度和 260 纳米和 280 纳米处的吸光度比值。之后，使用不含核酸酶的水将 1 至 2 μg 样品基因组 DNA 稀释至最终体积为 170 μL 的基因组 DNA 溶液。

在微量离心管中混合，制备 200 μL PCR 反应物。每种 HIV-1 特异性生物素引物 2.5 μL，或四种慢病毒特异性引物共计 10 μL，20 μL 10X 热稳定 DNA 聚合酶缓冲液，4 μL 10 毫摩尔 dNTP，3 μL 热稳定 DNA 聚合酶和 163 μL 基因组 DNA。将溶液均匀分成四个 PCR 管，并在以下条件下进行单个延伸循环。

94 摄氏度 5 分钟，56 摄氏度 3 分钟，72 摄氏度 5 分钟，4 摄氏度存放。将所有 4 个 PCR 反应物汇集到 2 mL 微量离心管中。按照制造商的 PCR 纯化试剂盒程序，用 50 μL 洗脱缓冲液洗脱。

将以下物质添加到微量离心管中，准备进行 100 μL 消化。50 μL DNA、10 μL 10X 缓冲液 A、2 μL RSAI 酶和 38 μL 无核酸酶水。在 37 摄氏度下在热循环仪中孵育 1 小时。

接下来，向反应中加入 1 微升 CviQI 酶，并在 25 摄氏度下孵育 30 分钟。当 RSAI 和 CviQI 消化完成后，立即进行直接结束。制备 4.5 μL 混合物，其中包含 2.5 μL DNA 聚合酶 I、大片段和 2 μL 10 毫摩尔 dNTP。

将 1 μL 混合物转移到 DNA 样品中。总体积为 102 微升。涡旋混合均匀，并在 25 摄氏度下孵育 1 小时。

孵育完成后，立即进行链霉亲和素微珠结合。通过短暂涡旋磁珠溶液并将 50 μL 转移到新的 2 mL 微量离心管中来制备链霉亲和素微珠。使用磁力架去除上清液，并用 200 微升结合溶液洗涤咖啡豆。

将磁珠重悬于 100 μL 结合溶液中，并将试管远离磁力架放置。将 100 μL 样品 DNA 转移到 100 μL 重悬的磁珠溶液中，并通过移液小心混合，以避免溶液起泡。将试管在室温下在旋转轮上孵育 3 小时。

使用磁力架捕获磁珠并丢弃上清液。在 400 μL 洗涤液中洗涤磁珠两次，在 400 μL 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中洗涤两次。将磁珠重悬于 200 μL 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中，并将其远离磁力架放置。

连接子连接应在链霉亲和素珠结合后立即进行。通过在 2 mL 微量离心管中混合以下物质来制备 400 μL 连接反应溶液。0.5 μL DNA 接头、10 μL 10X T4 DNA 连接酶缓冲液、20 μL 5X T4 DNA 连接酶缓冲液、5 μL T4 DNA 连接酶、164.5 μL 无核酸酶水和 200 μL 重悬磁珠。

将反应管放在室温下的旋转轮上 3 小时。用洗涤液洗涤磁珠两次，用 1X 热稳定 DNA 聚合酶缓冲液洗涤两次。将磁珠重悬于 50 μL 1X 热稳定 DNA 聚合酶 PCR 缓冲液中，并将其远离磁力架放置。

要开始此程序，请向重悬的磁珠中加入以下内容，制备 200 μL 的 PCR 反应物。10 μL 1 L 引物、10 μL 1R 引物、20 μL 引物 Link1、10 μL 10X 热稳定 DNA 聚合酶缓冲液、4 μL 10 milimolar dNTP、8 μL 热稳定 DNA 聚合酶和 88 μL 无核酸酶水。将反应混合物分装到四个 PCR 管中，并在以下条件下进行 PCR。

94 摄氏度 2 分钟，94 摄氏度 20 秒、56 摄氏度 25 秒和 72 摄氏度 2 分钟的 25 个周期，最后在 72 摄氏度延长 5 分钟。将所有四个 PCR 反应合并到 2 ml 微量离心管中。按照 PCR 纯化试剂盒的程序，用 50 μL 洗脱缓冲液洗脱。

使用紫外可见分光光度计测定 DNA 浓度和 260 和 280 纳米处的吸光度比。DNA 现在可以储存在零下 20 摄氏度，直到为下一步做好准备。由于左连接和右连接特异性扩增的程序除了 PCR 中使用的引物外是相同的，因此将仅演示左连接扩增。

通过在 PCR 管中混合以下内容来制备 50 μL PCR 反应物。5 μL DNA、5 μL 10 μmol 2L 引物、5 μL 10 μmol 引物 Link2、5 μL 10X 热稳定 DNA 聚合酶缓冲液、1 μL 10 milimolar dNTP、2 μL 热稳定 DNA 聚合酶和 27 μL 无核酸酶水。在以下条件下进行 PCR。

94 摄氏度 3 分钟，8 到 15 个周期，94 摄氏度 20 秒，56 摄氏度 25 秒，72 摄氏度 2 分钟，最后在 72 摄氏度延长 5 分钟。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA，并用 50 μL 洗脱缓冲液洗脱。测定 DNA 浓度和 260 和 280 纳米处的吸光度比。

生成左右连接序列文库的最后一步是通过进行毛细管电泳来分析 PCR 扩增子长度变化。该代表性结果显示，上游和下游载体宿主连接在慢病毒载体整合位点中 PCR 扩增子的长度不同。DNA 大小标记位于 M 泳道中。

对 PCR 扩增子进行测序后，使用内部编程脚本进行计算整合位点序列分析。双向整合位点检测可为上游和下游载体宿主连接生成不同大小的 PCR 扩增子，通过毛细管电泳进行可视化。在计算机生成的随机整合事件中，人源化小鼠重新配种细胞中慢病毒载体的基因 Alu 和 L1 重复序列的整合百分比比较表明，整合位点在基因中显著富集。

产生小于 500 bp PCR 扩增子的整合位点连接的序列计数来计算载体整合组的相对检测频率。大约 77% 的向量可以通过双向方法进行定量分析。在克隆定量策略中，我们假设每个单独的克隆共享相同的载体积分组。

将左右交界线的相对频率相加，以表示克隆种群 （QVI） 的相对数量。该配色方案显示了人源化小鼠再填充细胞中 44 个 QVI 克隆的相对频率。根据计算机模拟 10， 000 随机积分分析，当使用 GTAC 基序酶时，预计克隆频率会高估 1.25 倍，而当使用 TCGA 基序酶时，预计克隆频率会高估 2.56 倍。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以分成几个部分并在两天内完成。在尝试此过程时，请务必记住 PCR 步骤非常敏感，应采取预防措施以避免任何污染。这项技术为检查治疗性逆转录病毒载体的安全性以及探索恒河猴移植后造血干细胞克隆的长期再繁殖模式铺平了道路。