Name: 通过磁性活化细胞分选分离的血管周围脂肪组织的脂肪细胞祖细胞的扩增和脂肪生成诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用磁性活化细胞分选技术从血管周围脂肪组织中分离脂肪细胞祖细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞。该方法可提高细胞产量，适用于代谢疾病研究。

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Contreras 实验室、Watts 实验室以及 William Raphael 博士。本实验得到了以下资助：NHLBI F31 HL128035-01（组织消化方案的标准化）、NHLBI 5R01HL117847-02 和 2P01HL070687-11A1（动物实验）、以及 NHLBI 5R01HL117847-02（细胞分离与培养）。

本文所述所有实验步骤均遵循密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。所有缓冲液和培养基均应避光保存。
1. 缓冲液、培养基和仪器的准备
<ol>
	<li>配制 Krebs Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRBB）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1% 抗生素/抗真菌剂（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素、25 µg/mL 两性霉素 B）和 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液在无菌条件下 4 °C 保存时可稳定存放 3 周。</li>
	<li>配制 I 型胶原酶溶液：在含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的 KRBB 中配制成 1 mg/mL 浓度。该溶液应于 37 °C 保存，且在 4 小时内使用有效。</li>
	<li>配制红细胞裂解缓冲液：154 mM 氯化铵、10 mM 碳酸氢钾和 0.1 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。</li>
	<li>配制 MCS 封闭缓冲液：DMEM/F12 培养基基础液、10% 胎牛血清（FBS）、5% 正常驴血清、40 µL/mL F(ab) 片段驴抗大鼠 IgG。4 °C 条件下可保存长达一个月。</li>
	<li>配制 MCS 缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.5）、0.5% BSA 和 2 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。使用前将溶液在玻璃容器中加热至 37 °C 并抽真空 15 秒以去除气体。未使用的缓冲液应密封保存。</li>
	<li>配制基质血管组分（SVF）基础培养基：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）:F12、15% 胎牛血清（FCS）、1% 抗生素/抗真菌剂（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素、25 µg/mL 两性霉素 B）、44.05 mM 碳酸氢钠、100 µM 抗坏血酸、33 µM 生物素、17 µM 泛酸盐、2 mM L-谷氨酰胺和 20 mM HEPES。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。</li>
	<li>配制 APC&#160;培养基：在基础培养基中添加额外的生长因子，包括表皮生长因子（10 ng/mL）、白血病抑制因子（10 ng/mL）、血小板源性生长因子 BB（10 ng/mL）和碱性成纤维细胞生长因子（5 ng/mL）。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。</li>
	<li>配制 APC 诱导培养基：在 APC 培养基中加入 10% FBS、2.5 µg/mL 胰岛素、0.5 mM 2-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、1 µM 地塞米松和 200 pM T3（三碘甲腺原氨酸甲状腺激素）。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。</li>
</ol>
2. 脂肪细胞前体的分离
<ol>
	<li>根据机构指南对大鼠进行麻醉。将大鼠置于仰卧位。通过夹趾测试确认麻醉深度，并观察对该疼痛刺激的反射反应是否消失。 
	注意：本方案使用10周龄的Sprague Dawley大鼠，通过腹腔注射给予70 mg/kg戊巴比妥钠。</li>
	<li>使用剪刀沿胸骨区域从胸部至会阴部做一条垂直正中切口。进入腹腔，暴露肠系膜上动脉、小肠系膜阻力血管（mPVAT）和胸主动脉（aPVAT）。
	<ol>
		<li>切断肠系膜和主动脉的所有连接，取出血管。使用解剖显微镜和盛有KRBB溶液的培养皿观察血管，并分离PVAT。</li>
		<li>在本实验中，采集性腺脂肪组织（GON）作为非PVAT脂肪库的代表。将分离的脂肪垫置于含10 mM HEPES（pH = 7.4）的KRBB溶液中并放在冰上。</li>
		<li>在生物安全柜中，将约50 mg组织转移至含有1 mL I型胶原酶溶液的1.7 mL离心管中，用组织剪将其剪碎（1–3 mm大小片段）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在37 °C条件下于旋转培养箱（或配备轨道摇床的培养箱）中孵育1小时进行消化。在生物安全柜中，依次通过100 µm和40 µm细胞筛网将消化后的材料过滤至50 mL离心管中。将滤液在4 °C下以300 × g离心10分钟。 
	注意：从本步骤起，本方案中的所有操作均需在生物安全柜中进行，以保持细胞无菌状态。</li>
	<li>倒去上清液，将含有SVF细胞的沉淀重悬于1 mL 1X红细胞裂解缓冲液中，并转移至1.7 mL微量离心管。室温避光孵育5分钟，随后在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>倒去上清液，将剩余的细胞沉淀重悬于SVF基础培养基中。取20 µL样品用于台盼蓝溶液计数活细胞。 
	注意：可分离得到的SVF细胞数量因组织来源而异。每毫克组织平均收获的SVF细胞数为：aPVAT = 5.0 ±2.0×103，mPVAT = 1.04 ±0.62×104，GON = 2.4 ±1.2×105。</li>
</ol>
3. 磁珠激活细胞分选
注意：通过在 4 °C 下进行所有步骤，根据 CD34 和 PDGFRα 细胞表面标志物从 SVF 中分离 APC。
<ol>
	<li>以 300 × g 离心细胞 5 分钟。倒去上清液，并将细胞沉淀重悬于 MCS 封闭缓冲液中，调整细胞密度至 1 × 106 个细胞/mL，孵育 20 分钟。 
	注意：细胞悬液浓度在 1 × 106 – 2 × 108 个细胞/mL 范围内均可有效分离。</li>
	<li>加入 5 µL FITC 标记的小鼠抗 CD34 抗体（每 1 × 106 个细胞使用 1 µg），4 °C 下孵育 30 分钟。随后以 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>避光条件下，加入 4 µL 抗 FITC 微珠和 96 µL MCS 缓冲液（总体积 100 µL），4 °C 孵育 5 分钟，以分离 CD34+ 和 CD34− 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将磁力分离器固定于支架上，将 MultiSort（MS）分选柱（柱翼朝前）插入分离器中。在上方试管架中放置一个 5 mL 收集管，置于分选柱下方用于收集流出液。</li>
	<li>用 MCS 缓冲液冲洗 MS 分选柱以进行预处理。向分选柱顶部加入 500 µL MCS 缓冲液，让缓冲液自然流下。弃去流出液，并更换新的收集管。</li>
	<li>将抗体标记的细胞悬液加至预处理好的 MS 分选柱中。收集流穿液，其中含有未标记的细胞。</li>
	<li>用 500 µL 脱气的 MCS 缓冲液洗涤 MS 分选柱 3 次。每次收集未标记的穿流细胞，并合并至前一步骤收集的流穿液中。</li>
	<li>将 MS 分选柱从磁力分离器上取下，置于一个新的收集管上。用移液器向分选柱中加入 1 mL MCS 缓冲液。立即用随柱附带的推杆用力但缓慢地冲洗分选柱，快速洗脱磁性标记的细胞，注意避免过多气体进入分选柱。 
	注意：不同实验位点分离得到的细胞数量可能存在差异。每毫克组织中从 SVF 细胞群分离得到的 CD34+ APC 平均数量为：aPVAT = 2.6 ± 0.43 × 102，mPVAT = 9.6 ± 1.4 × 102，GON = 1.3 ± 0.22 × 103。</li>
	<li>以 300 × g、4 °C 离心细胞 5 分钟。将分离得到的 CD34+ 细胞组分重悬于 10 µL 含 1:200 稀释度/1 × 106 个细胞的兔抗 PDGFRα 抗体溶液中，4 °C 孵育 30 分钟。
	<ol>
		<li>再次以 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。将标记后的细胞与 4 µL 抗兔 IgG 微珠和 96 µL MCS 缓冲液混合，重复步骤 3.3 至 3.7 的操作进行分离。 
		注意：不同实验位点分离得到的细胞数量可能存在差异。每毫克组织中从 CD34+ 细胞群分离得到的 PDGFRα+ APC 平均数量为：aPVAT = 2.4 ± 0.64，mPVAT = 8.4 ± 2.4，GON = 10.4 ± 1.9，约占此前分离细胞群的 0.5 – 10%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞培养与脂肪生成诱导
<ol>
	<li>将SVF和APC在6孔组织培养板中用基础培养基进行培养，每2天更换一次培养基。经过连续3次传代后，将细胞以每孔1×102个细胞的密度接种至黑色96孔组织培养板中用于增殖实验，分别在8、24、48和96小时进行检测；或以每孔50,000个细胞接种至24孔板，或以每孔10,000个细胞接种至48孔组织培养板中用于脂肪生成实验，该实验为定性和定量分析。</li>
	<li>在细胞达到融合后48小时及诱导分化前，向APC基础培养基中添加骨形态发生蛋白4（3.3 nmol/L），按文献指示操作10。在细胞达到100%融合后48小时（第0天），使用APC诱导培养基对细胞进行诱导培养。</li>
	<li>48小时后，更换为不含IBMX和地塞米松的APC诱导培养基，继续培养14天，每48小时更换一次培养基。</li>
	<li>通过FACS验证MCS的分离。
	<ol>
		<li>取50 µL（50,000个细胞）磁分离后的细胞样品，用FACS溶液洗涤。</li>
		<li>离心细胞后，重悬于100 µL稀释比例为1:1,000的驴抗兔IgG Dylight 405抗体溶液中，用于标记PDGFRα+细胞。在避光条件下4 °C孵育30分钟。</li>
		<li>洗涤细胞后，重悬于200 µL的2%甲醛溶液中，待用流式细胞仪分析，检测时使用488 nm（FITC）和405 nm（Dylight 405）滤光片。 
		注：通过微孔板读数仪使用亲脂性脂肪生成荧光检测试剂对培养细胞的脂质积累进行定量评估，以成脂前体细胞作为脂质积累的校准标准。同时，通过脂质染料染色并结合倒置显微镜成像进行定性检测，可观察含有或不含脂滴的细胞占总细胞的比例。任何能够检测激发波长485 nm、发射波长572 nm荧光的酶标仪，以及任何具备数字图像采集功能的显微镜均可用于分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Watts, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemerin+connects+fat+to+arterial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemerin connects fat to arterial contraction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).</li>
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<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验的核心目标是从血管周围脂肪组织（PVAT）储存库中分离、扩增并诱导脂肪前体细胞（APC）向脂肪细胞分化。本文介绍了一种基于鉴定表达表面标志物CD34和PDGFRα的细胞来分离APC的实验方案。先前研究已发现，这些表面蛋白存在于具有高增殖能力的APC中，并且这些细胞具有分化为白色或棕色脂肪细胞的潜能，广泛分布于多种脂肪组织储存库中14,15。通过选择表达上述特异性标志物的细胞，我们能够从多个脂肪组织储存库中分离出与所选PVAT中观察到的脂肪细胞表型一致的相似APC群体13。在本实验中，我们通过在培养体系中添加生长因子BMP4，优化了APC的分化效果。此前，Macotela及其同事的研究表明，内脏脂肪组织来源的特定APC群体在分化过程中，其BMP活性低于皮下脂肪组织来源的群体，除非在培养基中补充脂肪生成相关的生长因子BMP2或BMP412,16,...

由于血管周围脂肪组织（PVAT）紧邻血管，因此在血管功能中发挥重要的旁分泌信号作用1。该脂肪组织的扩展依赖于其中存在的脂肪细胞前体细胞（APC）的表型2,3。由于原代脂肪细胞脆弱、具有浮力且大小不一，从脂肪组织中分离细胞十分困难。某些分离技术还可能通过增加炎症蛋白的合成并减少脂肪生成相关基因的表达，从而改变细胞的表型和形态4，这凸显了建立一种能够维持细胞完整性的实验方案的重要性。
原代细胞及特定前脂肪细胞亚群的培养为研究提供了简化的实验方法 体内 生长并保持相同的细胞遗传组成5，尽管由于细胞老化或衰老导致其状态逐渐下降，对这些细胞的操作时间有限6不同脂肪储存部位（包括皮下和网膜部位）的前脂肪细胞在增殖能力上也表现出差异7，这强调了从特定解剖位点收集细胞的重要性。既往研究已对非PVAT白色脂肪库中的前体细胞进行了表征。7,8,9但对PVAT中APC表型的了解较少。
本文所述技术可对特定且明确的抗原呈递细胞（APC）群体进行分析，同时对其形态、活力以及增殖和分化潜能的影响降至最低。磁珠激活细胞分选（MCS）适用于后续实验操作（如细胞培养），因为磁珠在不改变细胞特性的前提下可自行降解。MCS 还具有成本效益，且一旦抗体浓度完成标准化，对流式细胞术检测的需求将大大减少。体外研究脂肪组织血管周围前体细胞（PVAT 前体细胞）也有助于了解这些原代细胞可能具备的潜能。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;组织解剖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>硅胶手工制作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养用培养皿</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 玻璃</td></tr><tr><td>硅橡胶弹性体</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 170</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>立体显微镜 MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>立体显微镜光纤光源</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>碎屑镊</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td>组织剪刀</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;KRBB 溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织消化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td>1X 工作液</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2876</td><td>往复式振荡水浴</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>旋转式培养箱</td><td>Daigger</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td>黄色</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>蓝色</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS 试剂盒</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM):F12 培养基</td><td>Corning</td><td>90-090</td><td>基础培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35016CV</td><td>美国来源</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD34 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7324</td><td>FITC 标记</td></tr><tr><td>抗 PDGFR&amp;alpha; 抗体</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 10X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>1X 工作液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 细胞培养箱</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>TC 处理</td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>TC 处理</td></tr><tr><td>96 孔板，黑色壁</td><td>Corning</td><td>353376</td><td>TC 处理</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>TC 处理</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FCS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td>美国来源</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>泛酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>骨形态发生蛋白 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子 (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>血小板源性生长因子 BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Corning</td><td>25-800-CR</td><td>ITS 溶液</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (三碘甲腺原氨酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT 增殖检测</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed 荧光检测试剂</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>油红 O 脂质染色试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>溶液形式</td></tr><tr><td>M1000 微孔板读数仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Sight DS-Qi1 相机</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

血管周围脂肪组织（PVAT）通过旁分泌信号通路调节血管功能，其扩张与肥胖期间高血压的发生直接相关。脂肪细胞肥大和增生的程度取决于脂肪库的位置、性别以及存在的脂肪细胞前体细胞（APC）表型类型。过去十年中，用于分离APC和前脂肪细胞的技术已显著提高了基于特定细胞表面标志物识别单个细胞的准确性。然而，由于细胞本身较为脆弱，特别是当需要保持细胞完整性以用于细胞培养应用时，APC和脂肪细胞的分离仍具有挑战性。
磁激活细胞分选（MCS）提供了一种每单位质量脂肪组织中分离出更多可存活APC的方法。通过MCS收获的APC可用于 体外 扩增前脂肪细胞并利用生长因子混合物将其诱导分化为脂肪细胞的方案，可用于分析细胞所保留的增殖能力及脂肪生成潜能。本实验重点关注主动脉和肠系膜周围血管脂肪组织（PVAT）脂肪库，这些脂肪库在组织扩张过程中对心血管疾病的发展具有关键作用。本方案描述了分离、扩增和分化特定脂肪前体细胞（APC）群体的方法。该多细胞悬液（MCS）方案可在仅需最少设备和培训的条件下实现细胞分离，适用于任何需要细胞分选的实验。这些技术有助于进一步开展基于细胞表面标志物表达来确定特定细胞群体功能的实验。

前脂肪细胞的增殖能力及脂肪细胞前体的成脂潜能是得以维持的特性 体外11. 体外 通过定量DNA检测法评估了从雄性大鼠aPVAT、mPVAT和GON中分离的SVF和APC在接种后8、24、48和96小时的增殖情况。除aPVAT来源的APC在96小时时增殖程度低于同一位点的SVF细胞外，其余各时间点均未观察到不同来源部位之间SVF扩增速率的差异。图1).
经骨形态发生蛋白4（BMP4）刺激48小时后的融合APC细胞，用于标准诱导12 表现出分化，这通过荧光脂质摄取实验评估可见更大的脂滴中脂质积累而得以证实（图2A）以及油红O染色（图2...

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。

血管周围脂肪组织（PVAT）的扩张作为一种通过旁分泌信号调节血管功能的主要调控因子，与……直接相关。

这些分离与分化方案的总体目标是从血管周围脂肪组织中获取脂肪细胞前体细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞。该方法能够从血管周围脂肪组织中分离出特定且明确的脂肪细胞前体细胞群体，同时对其形态、活力以及增殖和分化潜能的影响最小。该技术的主要优势在于，与荧光激活细胞分选相比，其可显著提高每克脂肪组织中抗原呈递细胞的分离效率。在确认大鼠对脚趾夹捏无反应后，沿胸骨正中垂直切开至会阴区域，以进入腹腔。暴露肠系膜上动脉、小肠系膜阻力血管和胸主动脉，并切断与肠系膜和主动脉相连的所有组织。收集性腺脂肪组织，将分离的脂肪垫转移至含有10毫摩尔HEPES补充的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBB溶液）的新容器中。将血管转移至含有 KRBB 溶液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。去除小肠系膜阻力血管和主动脉周围的血管周围脂肪组织。在生物安全柜中，将约 50 毫克组织转移至含有 1 毫升 I 型胶原酶溶液的 1.7 毫升离心管中，并将组织剪切成 1 至 3 毫米大小的片段。充分切碎脂肪组织至关重要，以确保胶原酶能够彻底渗透结缔组织。将组织碎片在37摄氏度条件下振荡孵育1小时。随后依次通过100微米和40微米的细胞滤筛，将消化后的材料过滤至50毫升离心管中。通过离心收集所得滤液，并将沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。将细胞悬液转移至新的1.7毫升微量离心管中，在室温下避光孵育5分钟。然后通过再次离心收集基质血管组分细胞，并将沉淀重悬于基质血管组分基础培养基中进行细胞计数。为了通过磁激活细胞分选法分离脂肪细胞前体细胞，首先通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于磁激活细胞分选封闭缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞，在4°C下孵育20分钟。分离过程中的所有步骤必须在4°C下进行，而不是在冰上。接下来，将细胞与5 µL FITC标记的小鼠抗CD34抗体在4°C下孵育30分钟。通过离心收集细胞。然后在避光条件下，将细胞与4 µL抗FITC微珠在96 µL磁性激活细胞分选缓冲液中孵育5分钟。细胞孵育期间，将一个多分选柱置于磁性分离器上，并在柱下方放置一个5 mL废液管。用 500 微升磁性激活细胞分选缓冲液冲洗层析柱，弃去流出液和废液管。然后在层析柱下方放置一支新离心管，将细胞加样至层析柱顶部，收集未标记的 CD34 阴性细胞于新的收集管中。当所有细胞均通过层析柱顶部后，用 500 微升脱气的磁性激活细胞分选缓冲液洗涤层析柱 3 次，持续将洗脱液收集至同一收集管中。最后一次洗涤后，将柱子转移至新的收集管中，使用柱塞将1毫升磁性激活细胞分选缓冲液推过柱子，流入管中，以收集CD34阳性细胞。通过离心收集脂肪细胞前体细胞。随后，将CD34阳性组分与10微升兔抗血小板衍生生长因子受体α抗体在30分钟内孵育。孵育结束后，再次离心细胞，并将细胞沉淀重悬于96 µL磁珠分选缓冲液中的4 µL抗兔IgG MicroBeads中，用于磁珠分离血小板源性生长因子受体α阳性细胞，操作方法如前所述。为了培养CD34阳性且血小板源性生长因子受体α阳性的脂肪细胞前体细胞，将细胞接种至6孔组织培养板中，每孔加入基础培养基，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。经过连续3次传代后，将细胞以每孔1 × 10²个细胞的密度接种至黑色96孔组织培养板中，并在24孔检测板中按照标准增殖检测方案，在8、24、48和96小时时间点，以每孔5 × 10⁴个细胞的密度评估其增殖情况。为诱导脂肪生成，当脂肪细胞前体细胞培养达到汇合时，使用脂肪细胞前体基础培养基喂养细胞48小时，随后用骨形态发生蛋白4处理培养物额外48小时。第三天，更换为不含IBMX和地塞米松的脂肪细胞前体细胞诱导培养基，继续培养14天。随后可根据标准脂肪生成检测方案，在48孔组织培养板中每孔1×10⁴个细胞的密度下评估培养物中脂肪生成的程度。尽管两种方法在细胞群体分布和活力方面表现出相似的结果，但与荧光激活细胞分选相比，磁激活细胞分选分离获得的可用于培养的细胞数量更多。在此项代表性实验中，通过定量DNA检测法，评估了从雄性大鼠胸主动脉、小肠系膜阻力血管以及性腺脂肪组织中分离得到的磁激活细胞分选的基质血管组分及脂肪细胞前体细胞在接种后8、24、48和96小时的体外增殖情况。在各个时间点均未观察到不同来源的基质血管组分在扩增速率上存在显著差异，但来源于胸主动脉的脂肪细胞前体细胞在96小时时的增殖程度低于同一来源的基质血管细胞。用骨形态发生蛋白4刺激汇合的脂肪细胞前体细胞48小时可诱导脂肪细胞分化，表现为脂滴中脂质积累增多，可通过荧光脂质摄取检测和油红O染色进行评估。一旦掌握该技术，若操作正确，可在8小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住在分离步骤中保持4摄氏度的温度。观看本视频后，您应能较好地掌握如何分离和鉴定脂肪细胞前体细胞。

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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棘鼠模型中纤维脂肪生成祖细胞的分离、扩增与分化

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