通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

这些分离与分化方案的总体目标是从血管周围脂肪组织中获取脂肪细胞前体细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞。该方法能够从血管周围脂肪组织中分离出特定且明确的脂肪细胞前体细胞群体，同时对其形态、活力以及增殖和分化潜能的影响最小。该技术的主要优势在于，与荧光激活细胞分选相比，其可显著提高每克脂肪组织中抗原呈递细胞的分离效率。

确认大鼠对脚趾夹捏无反应后，沿胸骨正中线向会阴部做一垂直切口，以进入腹腔。暴露肠系膜上动脉、小肠系膜阻力血管及胸主动脉，并切断肠系膜和主动脉的所有连接。收集性腺脂肪组织，将分离的脂肪垫转移至含有10毫摩尔HEPES的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBB溶液）的新容器中。

将血管转移至含有KRBB溶液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。去除小肠系膜阻力血管和主动脉周围的血管周围脂肪组织。在生物安全柜中，将约50毫克组织转移至含有1毫升I型胶原酶溶液的1.7毫升离心管中，并将组织剪切成1至3毫米大小的片段。

充分剪碎脂肪组织至关重要，以使胶原酶能够彻底渗透结缔组织。将组织碎片在37摄氏度条件下振荡孵育1小时。随后将消化后的材料依次通过100微米和40微米的单个细胞滤筛，滤入50毫升离心管中。

通过离心收集所得滤液，并将沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。将细胞悬液转移至新的1.7毫升微量离心管中，在室温下避光孵育5分钟。然后通过再次离心收集基质血管组分细胞，并将沉淀重悬于基质血管组分基础培养基中进行细胞计数。

通过磁激活细胞分选法分离脂肪细胞前体细胞时，先通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于磁激活细胞分选封闭缓冲液中，调整浓度至每毫升含1×10⁶个细胞，在4摄氏度下孵育20分钟。分离过程中的所有步骤均必须在4摄氏度下进行，不可在冰上操作。接着，加入5 µL FITC标记的小鼠抗CD34抗体，4摄氏度孵育30分钟。

通过离心收集细胞。然后在避光条件下，将细胞与4 µL抗FITC MicroBeads及96 µL磁性激活细胞分选缓冲液共同孵育5分钟。在细胞孵育的同时，将一个多选柱置于磁性分离器中，并在柱下方放置一个5 mL废液管。

用 500 微升磁性激活细胞分选缓冲液冲洗层析柱，弃去流出液和废液管。然后在层析柱下方放置一个新的收集管，将细胞加样至层析柱顶部，收集未标记的 CD34 阴性细胞于新的收集管中。当所有细胞均通过层析柱顶部后，用 500 微升脱气的磁性激活细胞分选缓冲液洗涤层析柱 3 次，持续将洗脱液收集至同一收集管中。

最后一次洗涤后，将柱子转移至新的收集管中，使用柱塞将1毫升磁性激活细胞分选缓冲液通过柱子冲洗到管中，以收集CD34阳性细胞。通过离心收集脂肪细胞前体细胞。然后将CD34阳性组分与10微升兔抗血小板衍生生长因子受体α抗体在30分钟内孵育。

孵育结束后，再次离心细胞，并将细胞沉淀重悬于96 µL磁珠分选缓冲液中的4 µL抗兔IgG MicroBeads中，用于磁珠分离血小板源性生长因子受体α阳性细胞，方法如前所述。为了培养CD34阳性且血小板源性生长因子受体α阳性的脂肪细胞前体细胞，将细胞接种至6孔组织培养板中，每孔加入基础培养基，随后将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中。经过连续3次传代后，将细胞以每孔1 × 10²个细胞的密度接种至黑色96孔组织培养板中，并在24孔检测板中按照标准增殖检测方案，在8、24、48和96小时时间点，以每孔5 × 10⁴个细胞的密度评估其增殖情况。

为诱导脂肪生成，当脂肪细胞前体细胞培养达到汇合时，使用脂肪细胞前体基础培养基喂养细胞48小时，随后用骨形态发生蛋白4处理培养物额外48小时。第三天，将培养基更换为不含IBMX和地塞米松的脂肪细胞前体细胞诱导培养基，继续培养14天。随后可根据标准脂肪生成检测方案，在48孔组织培养板中每孔接种1×10⁴个细胞的条件下评估培养物中脂肪生成的程度。

尽管两种方法在细胞群体分布和活力方面表现出相似的结果，但与荧光激活细胞分选相比，磁激活细胞分选分离获得的可用于培养的细胞数量更多。在此代表性实验中，通过定量DNA检测法，评估了从雄性大鼠胸主动脉、小肠系膜阻力血管以及性腺脂肪组织中分离得到的磁激活细胞分选的基质血管组分及脂肪细胞前体细胞在接种后8、24、48和96小时的体外增殖情况。在各个时间点均未观察到不同来源部位的基质血管组分在扩增速率上存在差异，但胸主动脉来源的脂肪细胞前体细胞在96小时时的增殖能力较同部位的基质血管细胞更低。

将融合的脂肪细胞前体细胞用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein 4）刺激48小时，可诱导脂肪细胞分化，表现为脂滴中脂质积累增多，可通过荧光脂质摄取检测和油红O染色进行评估。一旦掌握该技术，若操作正确，可在8小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住在分离步骤中始终保持4摄氏度的温度。

观看本视频后，您应能够充分理解如何分离和分化脂肪细胞前体细胞。