使用靶向 Ca²⁺ 传感器 CatchER⁺ 监测内质网/肌浆网钙释放

本实验的总体目标是展示我们培养和转染HEK293及C2C12细胞的方案，使用CatchER plus并将其应用于NC2KD测量中监测ERSR受体介导的钙瞬变。该方法有助于回答钙信号传导及成像领域中的关键问题，例如特定细胞ERSR中基础钙浓度及其快速变化情况，以及如何应用生物传感器CatchER plus进行这些测量。该技术的主要优势在于能够以快速动力学实时记录单个细胞的荧光响应。

该技术的应用前景涉及ERSR钙相关疾病的诊断，因为CatchER plus能够监测这些细胞器中由钙信号传导元件功能障碍引起的异常钙瞬变。本方法的可视化演示至关重要，因为细胞转染和荧光成像步骤较难掌握，而细胞培养和显微镜操作均存在多个易出错环节。本次实验操作将由本实验室的博士后Florence Reddish进行演示。

实验开始时，将 HEK293 细胞接种到六厘米培养皿中的无菌玻璃盖玻片上，培养一至两天，直至转染当天细胞融合度达到约 70%。接着，吸出培养皿中的 DMEM 培养基，加入三毫升低血清培养基。然后，将 DNA 转染试剂混合物加入培养皿中，在 37 摄氏度下孵育四至六小时。

转染HEK293细胞通常比其他细胞系更容易，但这些细胞对严苛条件的耐受性较差。因此，必须严格控制其与转染试剂的接触时间在4至6小时以内，以避免发生细胞凋亡。转染4至6小时后，使用5至6毫升的HBSS缓冲液洗涤细胞。

弃去培养皿中的 HBSS，加入三毫升新鲜 DMEM。随后，将细胞在 37 摄氏度下孵育 48 小时，以诱导 GECI 的表达。对于 C2C12 成肌细胞，加入一至二毫升胰蛋白酶覆盖培养皿底部，进行胰酶消化处理。

接下来，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育2至6分钟，以使胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化松解。孵育完成后，移除胰蛋白酶，并用8毫升DMEM培养基重悬细胞。用DMEM充分吹打细胞，使其均匀分散并重新悬浮。

然后，将细胞接种到6厘米培养皿中的无菌盖玻片上，加入3毫升DMEM，使最终融合度达到60%。同一天进行细胞转染。在37摄氏度下孵育24小时。孵育结束后，用5至6毫升HBSS洗涤细胞。

弃去培养皿中的 HBSS，并加入三毫升新鲜 DMEM。然后在 37 摄氏度下孵育 48 小时，以允许 GECI 表达。在此步骤中，打开显微镜和光源，然后启动 simple PCI 程序。

使用棉签在低剖面开放式钻石浴成像室底部涂上一层薄薄的密封剂。然后，从培养箱中取出含有转染细胞的载玻片，用约一毫升预热至37摄氏度、含10毫摩尔葡萄糖和1.8毫摩尔钙的任氏缓冲液轻轻冲洗三次。在培养皿中保留约一毫升任氏缓冲液，以防止细胞干燥，并用镊子将载玻片从培养皿中取出。

用实验室纸巾轻触载玻片边缘以吸去多余溶液。然后将载玻片放入腔室侧面，使细胞面朝向油脂。随后，使用螺丝刀将腔室固定在载物台支架上。

在将样品室安装到显微镜载物台上并完成显微镜设置的过程中，向样品室中加入约一毫升林格氏液，以防止细胞干燥。将显微镜物镜切换至40倍油镜。在物镜上滴加一滴镜油。

随后，将装片置于显微镜载物台上。然后，将真空吸头放入腔室中，以保持溶液液面平稳，防止溢出。接下来，使用粗调旋钮升高物镜，直至物镜上的油接触到玻片底部。

使用明场模式，将增益调节至175，曝光时间调节至0.03秒，以聚焦细胞。待细胞聚焦清晰后，切换至荧光模式，采用488纳米激发光，并将曝光时间调整为0.07秒。选择一个视野，确保其中含有足够数量、状态健康且荧光信号充足的细胞用于成像。

然后，在荧光和明场模式下拍照。在细胞中圈定一个感兴趣区域，或圈选整个细胞，以记录所选区域的荧光强度。现在，将帧率设置为每五秒一帧，开始进行强度测量。

让基线强度稳定 20 到 30 帧。接下来，根据最终腔室体积 450 µL，计算需要从 20 毫摩尔的储备液中取用的 4-CMC 量，以配制终浓度为 200 微摩尔的溶液。然后，小心地从腔室中转移 60 µL 的林格氏液至微量离心管中。

将计算量的4-CMC用此溶液稀释后，重新加入腔室，以诱发成像细胞的预期反应。给予足够时间使药物与受体结合，并导致信号下降。随后，在同时添加事件标记的同时，用三到六毫升的林格氏缓冲液洗涤细胞。

对每种检测，使用转染细胞的新载玻片，分别重复上述步骤以进行 100 微摩尔 ATP 和 15 微摩尔 CPA 的实验。测量完成后，在 simple PCI 程序的强度测量窗口中结束数据采集。随后，采集细胞的荧光和明场图像。

然后，打开该实验的数据文件。如有必要，重新圈定细胞或感兴趣区域，以重新计算强度值。为确定NC2KD和C2C12成肌细胞，重复转染步骤，并在腔室中加入一毫升无钙的林格氏缓冲液。

用含 0.002% 至 0.005% 皂苷的细胞内缓冲液对细胞进行透化处理，持续 15 至 30 秒，以清除细胞质中可能存在的任何 CatchER 蛋白。随后，用三至六毫升含 EGTA 和 10 微摩尔离子霉素的 KCl 缓冲液洗涤细胞。待荧光强度下降并达到平台期为止。

随后，用 3 至 6 毫升含有 10 微摩尔离子霉素的 KCl 缓冲液冲洗细胞，并等待荧光强度稳定。之后，加入不同的钙溶液，使每次添加后荧光强度达到平台期。为校准传感器以定量基础钙浓度，使用 EGTA 和 100 毫摩尔钙缓冲液分别获取最小和最大荧光强度。

图中显示的是转染了 CatchER plus 的通透化 C2C12 成肌细胞所采集的归一化强度的代表性特征。细胞在胞内缓冲液中用 0.005% 皂苷处理 15 至 30 秒以实现通透化。EGTA 和钙溶液均用 KCL 缓冲液配制，N 表示成像细胞的数量。

这些插图中的荧光图像代表了细胞在处理前后的状态。在存在10 µM离子霉素的情况下，向透化的C2C12成肌细胞中分别添加0.2、0.6、2、5、10、20、50和100 mM的钙离子，获得的KD值为3.1 ± 1.4 mM。该图显示了在分别加入1 mM EGTA和100 mM钙离子（每种均含10 µM离子霉素）后，转染CatchER+的细胞在最小值和最大值时的代表性强度测量结果。

掌握该技术后，成像过程可在 30 至 60 分钟内完成，若包括转染步骤则需三天。在进行该操作时，务必始终在无菌环境中处理细胞，实验前准备好所有试剂，在腔室上均匀涂抹一层润滑脂，并在开始前连接好真空装置。在完成该操作后，还可采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如 CatchER plus 的表达水平。

该技术问世后，为钙信号传导与成像领域的研究人员探索哺乳动物细胞内质网-线粒体接触区（ERSR）的钙动力学提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用CatchER plus技术对细胞进行转染并进行成像。