Name: 监测ER / SR钙释放与目标Ca 2+传感器捕捉器 + (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 了解使用CatchER+生物传感器在HEK293和C2C12细胞中实时监测内质网/肌浆网钙瞬变的方法。该技术通过荧光显微镜成像实现快速动力学记录，有助于研究钙信号传导机制及相关疾病诊断。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）GM62999、NIH EB007268、NIH AG15820、B&amp;B 种子基金、NIH 补充资助项目资助给 FR，BB 奖学金资助给 CM，CDT 奖学金资助给 RG。

1. 载玻片制备
<ol>
	<li>将 22 mm × 40 mm 的玻璃载玻片放入 6 cm 的细胞培养皿中，每皿放置一片。</li>
	<li>在无菌操作台中，将每片载玻片的两面以及 6 cm 培养皿整体暴露于紫外（UV）光下照射 15–20 分钟，以进行消毒灭菌。</li>
	<li>用封口膜覆盖装有载玻片的培养皿，并于 4 °C 保存，直至使用前。</li>
</ol>
2. 培养基、缓冲液、溶液和试剂的制备
<ol>
	<li>配制1 L Hank's平衡盐溶液（HBSS），溶于去离子水中，并加入10 mM HEPES、5 mM NaHCO₃3，以及1 mM EGTA。用NaOH调节pH至7.2–7.3。使用0.22 µm滤器过滤缓冲液，收集至已灭菌的瓶中。</li>
	<li>在去离子水中配制900 mL高糖型Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。加入44 mM NaHCO₃3 用 HCl 调节 pH 至 7.2–7.3。使用 0.22 µm 滤器过滤培养基至已灭菌的瓶中。向培养基中加入 100 mL 胎牛血清（FBS），使 FBS 终浓度为 10%。4 °C 保存。</li>
	<li>配制1 L细胞内液缓冲液（125 mM KCl，25 mM NaCl，10 mM HEPES，0.2 mM CaCl₂）2，0.5 mM EGTA，0.2 mM MgCl2) 于去离子水中，并调节 pH 至 7.25。最终 [Ca2+] 的浓度约为 100 nM。使用前添加 0.5 mM ATP。室温保存。</li>
	<li>配制 1 L 林格氏缓冲液（121 mM NaCl，2.4 mM KCl，1.3 mM CaCl₂，0.5 mM MgCl₂，10 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，pH 7.4）2HPO4，0.4 mM KH2PO4，10 mM HEPES，和 1.2 mM MgCl2) 于去离子水中，调节 pH 至 7.2。室温保存。使用时，取 50 mL 分装至 50 mL 离心管中，并加入 1.8 mM Ca2+ 和 10 mM 葡萄糖。</li>
	<li>配制 1 L KCl 冲洗液（125 mM KCl，25 mM NaCl，10 mM HEPES，0.2 mM MgCl₂）2) 于去离子水中溶解，并调节 pH 至 7.25。</li>
	<li>将5 mg离子霉素溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中。分装30 µL至微量离心管中，于-20 °C保存。</li>
	<li>通过将环匹阿酸（CPA）溶解于DMSO中制备CPA储备液。确保加入细胞的CPA溶液中DMSO终浓度≤1%，以防止细胞凋亡。通过将4-氯-间甲酚（4-cmc）溶解于过滤后的H₂O中制备20 mM的4-cmc溶液。2O，并在37 °C下振荡过夜使其溶解。通过将ATP溶解于过滤的H20 到 100 mM</li>
	<li>确定 原位 Kd，分别准备 15 mL 的 1 mM EGTA 以及 0.2 mM、0.6 mM、2 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM 和 100 mM Ca2+ 在KCl缓冲液中，使用100 mM EGTA储备液和1 M CaCl₂2 溶于去离子水的储存液。</li>
</ol>
3. 细胞培养
<ol>
	<li>按照 ATCC 提供的各自培养方案，在无菌超净工作台中使用 10 cm 细胞培养皿培养 C2C12 成肌细胞和 HEK293 细胞。 
	注意：C2C12 细胞的融合度不应超过约 70%，因为成肌细胞在此之后会开始分化为肌管。HEK293 和 C2C12 细胞均易于生长，为保持细胞完整性，不应让其生长至 100% 以上的融合度。此外，为维持细胞健康，用于实验前细胞传代次数不应超过 10 代。</li>
</ol>
4. HEK293 细胞的转染
<ol>
	<li>将HEK293细胞接种于6 cm培养皿中的无菌22 mm × 40 mm玻璃载玻片上，使细胞在转染当天达到约70%融合度。</li>
	<li>次日，按照转染试剂生产商的说明书，使用2 µg CatchER+ cDNA和1:3（质量/体积）的DNA:转染试剂比例，在低血清培养基（例如 Opti-MEM）中进行细胞转染。</li>
	<li>吸去培养皿中的DMEM培养基，加入3 mL低血清培养基。将DNA:转染试剂混合物加入培养皿中，在37 °C孵育4–6小时。</li>
	<li>孵育结束后，用5–6 mL HBSS洗涤细胞。弃去HBSS，更换为3 mL新鲜DMEM，于37 °C继续孵育48小时，以允许GECI表达。</li>
	<li>C2C12成肌细胞的转染
	<ol>
		<li>对于C2C12成肌细胞，加入足量胰蛋白酶覆盖培养皿底部（1–2 mL）进行消化。将培养皿置于37 °C培养箱中孵育2–6分钟，使胰蛋白酶松动细胞与皿底的贴附。</li>
		<li>孵育完成后，吸去胰蛋白酶，并用8 mL DMEM重悬细胞。用移液器充分吹打细胞，使其均匀分散并重新悬浮，然后接种至含有3 mL DMEM的6 cm细胞培养皿中的无菌盖玻片上，使最终融合度为60%。</li>
		<li>于同日按照步骤4.2–4.3所述方法进行细胞转染。在37 °C孵育24小时。</li>
		<li>重复步骤4.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 载玻片的制备与荧光显微镜观察
<ol>
	<li>打开显微镜和光源，然后启动 Simple PCI 程序。让显微镜预热 15–20 分钟，或直至电荷耦合器件（CCD）相机冷却至 -65 °C。在此期间，准备含有细胞的灌流腔室和载玻片。</li>
	<li>使用棉签在低剖面开放式钻石浴成像腔室的底部涂上一层薄薄的密封剂。</li>
	<li>从培养箱中取出转染细胞的载玻片，用预热至 37 °C 的含 10 mM 葡萄糖和 1.8 mM Ca2+ 的 Ringer 缓冲液轻轻冲洗三次，每次 1 mL。</li>
	<li>在培养皿中保留 1 mL Ringer 缓冲液以防止细胞干燥，用镊子将载玻片从培养皿中取出。通过将载玻片边缘轻触实验室用纸巾，吸去多余的液体。然后将载玻片放入已涂有封固剂的腔室侧面，细胞面朝上对准封固剂，并用螺丝刀将腔室固定在显微镜载物台上。</li>
	<li>向腔室中加入 1 mL Ringer 缓冲液，以防止在将腔室安装到载物台及完成其余显微镜设置过程中细胞干燥。一旦真空吸管连接到腔室，腔室的最终持液体积约为 450 µL。</li>
	<li>将显微镜物镜切换至 40X 油镜。</li>
	<li>使用镜头纸和镜头清洁液清洁并擦干物镜。切勿用力擦拭物镜，应轻轻蘸拭直至表面洁净。</li>
	<li>在物镜上滴加一滴浸油。</li>
	<li>将载物装置放置于显微镜载物台上，并将真空吸头连接至腔室。一旦真空吸管连接并开启，腔室的最终持液体积约为 450 µL。此最终液面应与腔室侧壁齐平。实验过程中必须确保腔室液面水平，以避免因过度填充导致液体流入物镜。</li>
	<li>升高物镜，使用粗调旋钮，直至物镜上的浸油接触载玻片底部。</li>
	<li>使用明场模式，将增益调节至 175，曝光时间调节至 0.03 秒，以对细胞进行聚焦。</li>
	<li>细胞聚焦后，切换至荧光模式，使用 488 nm 激发光。将曝光时间调整为 0.07 秒。选择一个视野，其中包含足够数量、状态良好且荧光信号充足的细胞用于成像。</li>
	<li>选定视野后，分别在荧光和明场模式下拍摄图像。</li>
	<li>在细胞内圈定一个感兴趣区域（ROI），或圈选整个细胞，以记录所选区域的荧光强度。</li>
</ol>
6. 成像药物诱导的 Ca2+ 瞬变及原位 Kd 校准
<ol>
	<li>将帧率设置为每5秒一帧，开始进行强度测量。</li>
	<li>让基线强度稳定20-30帧（100-150秒）。如有需要，可在该步骤中降低每秒帧数，以防止光漂白。</li>
	<li>根据约450 µL的最终腔室体积，从20 mM的储备液中计算出配制200 µM终浓度所需的4-cmc用量。根据需要对储备液进行稀释。</li>
	<li>小心从腔室中取出60 µL林格氏液，置于微量离心管中。将计算量的4-cmc用此溶液稀释后，再加回腔室，以诱发成像细胞的预期反应。</li>
	<li>将计算量的4-cmc加入微量离心管中，并用移液器吹打混匀。</li>
	<li>在视野上方轻轻加入该溶液，同时在强度测量中添加事件标记。</li>
	<li>给予足够时间使药物与受体结合并引发信号下降，随后用含1.8 mM Ca2+和10 mM葡萄糖的3-6 mL林格氏液冲洗，同时添加事件标记。由于腔室体积为450 µL且连接真空系统，加入3-6 mL缓冲液可确保含药物的原溶液被完全洗去，并被新加入的溶液替代。</li>
	<li>对100 µM ATP和15 µM CPA重复步骤6.1-6.7，每次实验使用新的转染细胞载玻片。</li>
	<li>测量完成后，在Simple PCI程序的强度测量窗口中结束数据采集。</li>
	<li>拍摄细胞的荧光和明场图像。</li>
	<li>打开该实验的数据文件。如有需要，可重新圈定细胞或感兴趣区域，以重新计算强度值。</li>
	<li>为测定C2C12成肌细胞中in situ的Kd值，请按照第4.2节和第5节所述方案操作，并在腔室中加入1 mL含0 mM Ca2+的林格氏液。
	<ol>
		<li>用含0.002-0.005%皂苷的细胞内缓冲液对细胞进行15-30秒的透化处理，以清除细胞质中可能存在的CatchER+。用含10 µM离子霉素的3-6 mL KCl缓冲液（含1 mL EGTA）洗涤细胞。待荧光强度下降至平台期。</li>
		<li>用含10 µM离子霉素的3-6 mL KCl缓冲液冲洗，并让荧光强度稳定，然后依次加入步骤2.7中所述的各Ca2+溶液。每次加样后均需等待荧光强度达到平台期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为校准传感器以定量基础[Ca2+]，请执行步骤6.12。使用步骤2.7中的EGTA和100 mM Ca2+缓冲液，获取最小和最大荧光强度。</li>
</ol>
7. 数据处理
<ol>
	<li>下载强度测量数据的电子表格文件。</li>
	<li>将每个细胞的数据归一化至基线强度（F/F₀）0）。在任意绘图程序中，将归一化数据对时间作图。</li>
	<li>计算%变化时，用1减去归一化的峰值，再乘以100。若对多个细胞进行了成像，需计算平均值和标准差。</li>
	<li>为计算信噪比（SNR），在图像处理软件（如 ImageJ）中打开实验保存的图像文件，然后测量信号（转染细胞）和噪声（背景）。使用公式 SNR = 信号/噪声 计算信噪比。</li>
	<li>为了计算 原位 Kd 从采集的荧光成像数据中，对每次添加 Ca 后的平台期强度数据进行平均。2+ 浓度和 EGTA（0 mM Ca）2+）。使用 θ = (F – F分钟)/(F最大值- F分钟），其中 θ 为相对强度，F 为任意点的荧光值，F分钟 为最小荧光强度，且 F最大值 是最大荧光强度，用于观察随着Ca²⁺的加入探针荧光强度的变化2+ 与最小强度相比，将相对强度数据对[Ca2+] 在任何绘图和曲线拟合程序中。使用 1:1 结合方程 θ = [MT]/(Kd + [MT]) 可转换至任意作图与曲线拟合程序，用于计算 Kd. MT 是金属的总浓度。</li>
	<li>为了根据6.13节中所述校准方法定量基础钙水平，在加入1 mM EGTA后，对包含平台期的强度数据取平均值（F分钟）和 100 mM Ca2+ （F最大）。使用校准方程 [Ca2+] = Kd（[F – F分钟)/(F最大 – F)] 来计算基础钙水平。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对活体单细胞中荧光探针（如 CatchER+）进行成像，是一种有效分析每个细胞在受体激动剂或拮抗剂刺激下内质网/肌浆网（ER/SR）Ca2+ 信号转导复杂过程的技术。该技术还可用于多波长同步成像，例如同时使用 Fura-2，或共表达 CatchER+ 与 Rhod-2，分别监测内质网和胞质钙离子浓度的变化。本实验方案中有多个关键步骤：细胞转染对成像细胞的存活率具有显著影响。转染效率过低会导致基因编码钙指示剂（GECI）表达不足，从而无法有效监测钙响应。另一方面，CatchER+ 的过表达不会对内质网/肌浆网（ER/SR）中的 Ca2+ 产生缓冲效应，而这是传统合成钙染料所面临的问题。Ca2+ 探针的缓冲效应受细胞器内 [Ca2+] 浓度、探针的解离常数（Kd）以及检测所需探针浓度的影响。胞质 [Ca2+] 通常处于低纳摩尔范围，而所需探针浓度与此相近，因此染料浓度及其对胞质钙离子的缓冲能力一直是细胞成像中的主要关注点。相比之下，我们此前在多种...

细胞内钙离子（Ca2+）瞬变具有时空特性，可激活多种生物学功能1。这些Ca2+信号事件由细胞外的不同刺激触发，并在细胞内由主要的Ca2+储存细胞器以及多种Ca2+泵、通道和Ca2+结合蛋白进行调控。由于信号调节异常，Ca2+瞬变可能发生显著改变，从而导致多种疾病2。鉴于Ca2+信号系统的快速性和复杂性，且以内质网（ER）和肌浆网（SR）为核心，需要使用已针对哺乳动物表达优化、具有快速动力学特性的基因编码Ca2+探针，以观察不同细胞中的全局性和局部性Ca2+变化3。
内质网（ER）及其在肌细胞中的对应结构——肌浆网（SR），是细胞内主要的钙离子储存细胞器。2+ 储存细胞器并充当 Ca2+ 有助于放大 Ca 的信号接收区2+ 信号4内质网/肌浆网（ER/SR）是钙信号传导中的一个关键组成部分2+ 兼具信号传递与接收双重功能的信号传导5. 兰诺碱受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R) 是 Ca2+ 位于内质网/肌浆网膜上的钙调释放受体2+ 6其他试剂可直接或间接刺激这些受体的功能。4-氯-间甲酚（4-cmc）是兰尼碱受体（RyR）的强效激动剂，其诱导肌浆网钙释放的敏感性比咖啡因高10倍。2+ 释放，两者均常用于研究由RyR介导的Ca2+ 健康与病变细胞中的释放7ATP 增加 IP3介导的 Ca2+ 通过IP释放3R8ATP 结合到嘌呤能受体 P2YR（一种 G 蛋白偶联受体，GPCR），触发 IP 的生成3 与IP结合3R 释放 Ca2+ 从内质网9,10肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）泵是一种P型ATP酶泵，同样位于内质网/肌浆网膜上，可降低胞质中的Ca²⁺浓度2+ 并通过主动将离子泵入内质网/肌浆网腔内，使内质网/肌浆网重新充盈11SERCA泵的特异性抑制剂包括毒胡萝卜素（thapsigargin），来源于 Thapsia garganica，以及环匹阿尼酸（CPA） 曲霉属 和 PenicilliumCPA 对泵的亲和力较低，并可逆地阻断 Ca2+ 接入点12. 而毒胡萝卜素（thapsigargin）则不可逆地结合到Ca2+ M3 螺旋中 F256 残基处具有纳摩尔亲和力的游离泵11分析并量化Ca相关的变化2+ 刺激事件一直是并仍然是一个挑战。由于内质网/肌浆网（ER/SR）是细胞内主要的钙库2+ 具有中心功能的区室，参与Ca²⁺信号的传导2+ 信号，大量研究工作集中在理解内质网/肌浆网钙离子2+ 信号转导5.
合成Ca2+染料的开发推动了Ca2+成像领域的发展与实践。尽管诸如Mag-Fura-2等染料已被广泛用于测量不同细胞中的区室化Ca2+13,14,15，但其存在染料加载不均、光漂白以及无法靶向特定细胞器等局限性。绿色荧光蛋白（GFP）的发现以及基于荧光蛋白的Ca2+探针的发展进一步推动了Ca2+成像领域的进步16。目前已有的一些基因编码钙指示剂（GECI）是基于福斯特共振能量转移（FRET）的配对系统，包含黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、钙调蛋白及M13结合肽17,18。基于肌钙蛋白C的GECI也已开发成功，可作为CFP与Citrine的FRET配对，也可作为单荧光团探针使用19,20,21 。其他如GCaMP2和R-GECO则是基于钙调蛋白的单荧光团传感器22,23。为了克服传统Ca2+结合域中多个Ca2+结合位点所导致的Kd调节范围窄及协同结合等局限性24，研究人员通过在增强型绿色荧光蛋白（EGFP）发色团敏感位置的β桶状结构表面设计新的Ca2+结合位点，开发出一类新型钙传感器25,26。这一备受关注的传感器称为CatchER，其Kd约为0.18 mM，kon接近扩散极限，koff为700 s-1。CatchER已被用于监测HeLa、HEK293和C2C12等多种哺乳动物细胞系中受体介导的内质网/肌浆网（ER/SR）钙释放25。由于其快速的动力学特性，CatchER被应用于年轻和老年Friend Virus B NIH Jackson（FVB）小鼠的趾短屈肌（FDB）肌纤维，研究发现，在去极化2秒后，老年小鼠FDB肌纤维中残留于肌浆网（SR）的Ca2+多于年轻小鼠27。为克服其在37 °C时荧光信号较弱而限制其在哺乳动物细胞钙成像中应用的问题，我们开发了CatchER的改进版本——CatchER+。CatchER+在37 °C下表现出更强的荧光，更适用于哺乳动物细胞。通过在CatchER中引入额外的突变，进一步提升了其在37 °C下的热稳定性和荧光强度28,29，从而获得CatchER+。CatchER+的信噪比（SNR）较CatchER提高了六倍30。
此处为使用CatchER对HEK293和C2C12细胞进行培养和转染的实验方案+ 及其在监测内质网/肌质网受体介导的钙瞬变中的应用。展示了CatchER的代表性实验结果。+ 在经4-CMC、CPA和ATP处理的HEK293细胞中表达。我们还提供了一种测定的方案 原位 Kd 捕获剂+ 在C2C12成肌细胞中检测基础[Ca2+].

<table><tbody><tr><td>4-氯-3-甲基苯酚（4-CmC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR 二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>NC338059</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5&amp;prime;三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>康宁组织培养处理培养皿（100 mm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>康宁公司组织培养处理培养皿（60 mm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>环匹阿酸（CPA）</td><td>EMD Millipore</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>道康宁 111 号阀门润滑剂 &amp;& 密封剂</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s 小量（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(氧乙基亚硝基)&lt;br/&gt; 四乙酸（EGTA）</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 盖玻片 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸，分子生物学级</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>无自发荧光浸油</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素，游离酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>徕卡 DM6100B 倒置显微镜配备冷却式 EM-CCD 相机</td><td>滨松</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>低剖面开放式钻石浴成像室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI 图像分析软件</td><td>滨松</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0.22 &amp;micro;m 滤光片</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till 多色 V 氙灯</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5%），无酚红（10倍浓缩液）</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

使用靶向 ca2+ 传感器 catcher+ 监测内质网/肌浆网钙释放

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

细胞外刺激引发的细胞内钙离子（Ca2+）瞬变在生物体内启动多种生物学过程。细胞内钙释放的核心是主要的细胞内钙储存细胞器，即内质网（ER）以及在肌细胞中更为特化的肌浆网（SR）。钙离子从这些细胞器中的动态释放由兰诺定受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）介导，而钙的再填充则通过肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）泵完成。为了监测ER/SR中快速的钙释放，研究人员开发了一种名为CatchER的基因编码钙传感器（GECI）。本文详细描述了在HEK293和C2C12细胞中转染并表达经过优化、靶向ER/SR的GECI CatchER+的操作步骤，并介绍了利用荧光显微镜在HEK293细胞中监测IP3R、RyR和SERCA泵介导的钙瞬变的应用方法。所选的受体激动剂或抑制剂被加入灌流液中，荧光强度变化被实时记录。通过该方法可观察到，RyR被4-氯-间甲酚（4-cmc）激活、IP3R被三磷酸腺苷（ATP）间接激活以及SERCA泵被环匹阿酸（CPA）抑制时，ER内的钙水平均出现下降。我们还讨论了在C2C12细胞中测定in situ Kd值以及定量基础[Ca2+]的方法。总之，这些方法结合CatchER+的使用，可用于诱导受体介导的ER钙释放，未来可应用于研究与ER/SR钙相关的病理机制。

本部分将展示使用先前所述方法及优化后的靶向内质网/肌浆网（ER/SR）的GECI CatchER+，通过不同受体介导通路监测ER/SR Ca2+变化所获得的结果。
图1 通过兰尼碱受体（RyR）刺激展示内质网排空 200 µM 4-cmc。4-cmc 是兰尼碱受体（RyR）的激动剂。加入该药物后，内质网钙离子浓度降低，这可通过 CatchER 信号的减少来测定。+ 荧光强度。如标注所示，此处所述方案可实现受体介导的Ca2+ 使用 CatchER 检测瞬时表达产物+ 可提供有关内质网钙离子变化的信息2+.
如<strong class="xfig...

我们介绍了靶向基因编码钙离子指示剂（GECI）CatchER 的应用方案+ 用于通过实时荧光显微镜监测 HEK293 细胞和骨骼肌 C2C12 细胞内质网/肌浆网（ER/SR）中快速钙瞬变的方案。一种用于 原位 Kd 还讨论了测量与校准。

使用靶向 Ca2+ 传感器 CatchER+ 监测内质网/肌浆网钙释放

由细胞外刺激引发的细胞内钙离子（Ca2+）瞬变在生物体内启动多种生物学过程。处于……中心的

本实验的总体目标是展示我们使用CatchER plus对HEK293和C2C12细胞进行培养和转染的实验方案，及其在NC2KD测量中用于监测ERSR受体介导的钙瞬变的应用。该方法有助于回答钙信号传导和成像领域中的关键问题，例如特定细胞ERSR中的基础钙浓度及其快速变化，以及如何应用生物传感器CatchER plus进行此类测量。该技术的主要优势在于能够实时记录单个细胞的荧光响应，且具有快速的动力学特性。该技术的应用前景涉及ERSR钙相关疾病的诊断，因为CatchER plus能够监测这些细胞器中由钙信号传导元件功能障碍引起的异常钙瞬变。本方法的可视化演示至关重要，因为细胞转染和荧光成像步骤较难掌握，而细胞培养和显微镜操作均存在多个易出错环节。本次实验操作将由本实验室的博士后Florence Reddish进行演示。实验开始时，将 HEK293 细胞接种到六厘米培养皿中的无菌玻璃盖玻片上，培养一至两天，直至转染当天细胞融合度达到约 70%。接着，吸出培养皿中的 DMEM 培养基，加入三毫升低血清培养基。然后，将 DNA 转染试剂混合物加入培养皿中，在 37 摄氏度条件下孵育四至六小时。HEK293细胞的转染通常比其他细胞系更容易，但这些细胞对严苛条件的耐受性较差。因此，必须严格控制其与转染试剂的接触时间在4至6小时以内，以避免发生凋亡。转染4至6小时后，使用5至6毫升的HBSS洗涤细胞。弃去培养皿中的HBSS，加入3 mL新鲜DMEM。随后将细胞在37摄氏度孵育48小时，以诱导GECI表达。对于C2C12成肌细胞，加入1至2 mL胰蛋白酶覆盖培养皿底部，进行消化处理。接下来，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育2至6分钟，以使胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化松解。孵育完成后，吸除胰蛋白酶，并用8毫升DMEM培养基重悬细胞。用DMEM充分吹打细胞，使其均匀分散并重新悬浮。然后，将细胞接种到6厘米培养皿中的无菌盖玻片上，并加入3 mL DMEM，使最终汇合度达到60%。同一天进行细胞转染。在37°C下孵育24小时。孵育结束后，用5–6 mL HBSS洗涤细胞。弃去培养皿中的HBSS，加入三毫升新鲜DMEM。随后在37摄氏度孵育48小时，以允许GECI表达。在此步骤中，打开显微镜和光源，然后启动simple PCI程序。使用棉签在低剖面开放式钻石浴成像室底部涂上一层薄薄的密封剂。然后，从培养箱中取出含有转染细胞的载玻片，用约1毫升预热至37摄氏度、含10毫摩尔葡萄糖和1.8毫摩尔钙的林格缓冲液轻轻冲洗三次。在培养皿中保留约1毫升林格缓冲液，以防止细胞干燥，并用镊子将载玻片从培养皿中取出。用实验室纸巾轻触载玻片边缘以吸去多余溶液。然后将载玻片放入腔室侧面，使细胞面朝向油脂。随后，使用螺丝刀将腔室固定在载物台支架上。在将样品室安装到载物台上并完成显微镜设置的过程中，向样品室中加入约一毫升林格氏液，以防止细胞干燥。将显微镜物镜切换至40倍油镜物镜。在物镜上滴加一滴浸油。随后，将装片置于显微镜载物台上。然后，将真空吸头放入腔室中，以保持溶液液面平稳，防止溢出。接下来，使用粗调旋钮升高物镜，直至物镜上的油接触到玻片底部。使用明场模式，将增益调节至175，曝光时间调节至0.03秒，以聚焦细胞。待细胞聚焦清晰后，切换至荧光模式，使用488纳米激发光，并将曝光时间调整为0.07秒。选择一个视野，确保其中含有足够数量、状态健康且荧光信号充足的细胞用于成像。然后，在荧光和明场模式下拍照。在细胞内圈定一个感兴趣区域，或圈定整个细胞，以记录所选区域的荧光强度。接着，将帧率设置为每五秒一帧，开始进行强度测量。让基线强度稳定20到30帧。接下来，根据终体积为450微升的孵育 chamber，计算从20毫摩尔的储备液中需要加入的4-CMC量，以获得终浓度为200微摩尔。然后，小心地将60微升的任氏液从孵育 chamber 转移至微量离心管中。将计算量的4-CMC用此溶液稀释后，重新加入培养腔，以诱发正在成像的细胞产生预期反应。给予足够时间使药物与受体结合，并导致信号下降。随后，在同时添加事件标记的同时，用3至6毫升林格氏缓冲液洗涤细胞。针对每种检测，使用转染细胞的新载玻片，重复上述步骤，分别加入100 µM ATP和15 µM CPA。测量完成后，在simple PCI程序的强度测量窗口中结束数据采集。随后，采集细胞的荧光和明场图像。然后，打开该实验的数据文件。如有必要，重新圈选细胞或感兴趣区域，以重新计算强度值。为确定NC2KD和C2C12成肌细胞，重复转染步骤，并在腔室中加入一毫升无钙的林格氏缓冲液。使用含0.002%至0.005%皂苷的细胞内缓冲液对细胞进行透化处理，持续15至30秒，以清除细胞质中可能存在的任何CatchER plus。随后，用三至六毫升含有EGTA和10微摩尔离子霉素的KCl缓冲液洗涤细胞。继续观察，直至荧光强度下降并达到平台期。随后，用 3 至 6 毫升含有 10 微摩尔离子霉素的 KCl 缓冲液冲洗细胞，并等待荧光强度稳定。之后，加入不同的钙溶液，使每次添加后荧光强度达到平台期。为校准传感器以定量基础钙浓度，使用 EGTA 和 100 毫摩尔钙缓冲液分别获得最小和最大荧光强度。图中显示的是转染了 CatchER plus 的透化 C2C12 成肌细胞所采集的归一化强度的代表性特征。细胞在胞内缓冲液中用 0.005% 皂苷处理 15 至 30 秒以实现透化。EGTA 和钙溶液均用 KCL 缓冲液配制，N 表示成像细胞的数量。这些插图中的荧光图像代表了处理前后细胞的典型情况。在存在10 µM离子霉素的条件下，向透化的C2C12成肌细胞中分别添加0.2、0.6、2、5、10、20、50和100 mM的钙离子，获得的KD值为3.1 ± 1.4 mM。该图显示了在分别加入1 mM EGTA和100 mM钙离子（均含10 µM离子霉素）后，转染CatchER的细胞在最小值和最大值时的代表性强度测量结果。掌握该技术后，成像过程可在 30 至 60 分钟内完成，若包括转染步骤则需三天。在进行该操作时，务必始终在无菌环境中处理细胞，实验前准备好所有试剂，向腔室均匀涂抹一层润滑脂，并在开始前连接好真空装置。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如 CatchER plus 的表达水平。该技术开发后，为钙信号传导与成像领域的研究人员探索哺乳动物细胞内质网-线粒体接触区（ERSR）的钙动力学提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用CatchER plus技术进行细胞转染及成像操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

监测ER / SR钙释放与目标Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;传感器捕捉器<sup&gt; +</sup

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本文描述了同时记录膜电位或电流以及细胞内钙离子浓度变化的方法。通过全细胞膜片钳配置的膜片钳电极，将钙离子指示剂bis-fura-2导入视交叉上核神经元中。...

同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

内质网钙稳态在多种病理状态下受到破坏。一种分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMP）报告系统可用于检测内质网钙库的异常变化。本方案描述了使用该报告系统的具体方法。 高塞氏菌 利用荧光素酶SERCaMP检测内质网钙离子稳态 体外 和 体内.

利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca2+储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。...

离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

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局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

本方案描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析策略。...

利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

了解使用CatchER+生物传感器在HEK293和C2C12细胞中实时监测内质网/肌浆网钙瞬变的方法。该技术通过荧光显微镜成像实现快速动力学记录，有助于研究钙信号传导机制及相关疾病诊断。

使用靶向 Ca²⁺ 传感器 CatchER⁺ 监测内质网/肌浆网钙释放

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