Name: 从孤立的大鼠心脏的间质渗出物收集的倒置心脏模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习使用Langendorff灌流和倒置心脏模型从大鼠心脏收集心脏间质液的方法。该技术可分离间质渗出液与冠状静脉回流液，用于研究心脏细胞通讯、炎症反应和心肌再生过程中的旁分泌信号。

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本研究由国家自然科学基金 81570244、FoKo 23/2013、SFB 1116/B01 以及杜塞尔多夫心血管研究所（CARID）资助。

所有实验均经德国北莱茵-威斯特法伦州地方监管机构（LANUV）批准，并依照动物使用指南进行。动物饲喂标准维持饲料，并可自由饮用自来水。ad libitum。实验各步骤所需的全部设备与化学品详见材料表。
1. 乳胶帽和脑室内球囊的制备
<ol>
	<li>使用铣床制作一个与大鼠心脏平均大小相匹配的铝制模具（体重为300-350 g）。用超细（10/0）砂纸对模具进行抛光。 
	注意：模具的详细尺寸见图1A。</li>
	<li>将铝制模具的颈部垂直固定在铣床上，以制备乳胶帽。 
	注意：铣床使模具缓慢旋转。也可使用电动机替代。</li>
	<li>将20 mL液态乳胶（ commercially purchased，参见材料表）倒入50 mL玻璃烧杯中。</li>
	<li>将模具下放，直至模具整体浸入乳胶溶液中。</li>
	<li>在旋转的同时缓慢提起模具（5 cm/min）。</li>
	<li>继续旋转模具额外15分钟，直至模具表面的乳胶完全固化。</li>
	<li>向模具表面（已覆盖一层薄乳胶膜）加入约1 g滑石粉，以防止脱模时损坏。</li>
	<li>用手指轻轻将已干燥的乳胶帽从模具表面剥离；乳胶帽现已可使用（图1B）。</li>
	<li>将乳胶帽的出口连接至一段15 cm长的硅胶管（内径 = 0.2 mm），用于后续收集CT。</li>
	<li>用水填充心室乳胶气囊，并将其牢固固定在L形金属套管上，该套管连接一个装满水的1 mL注射器（图1C）。 
	注意：此装置将用于确保心脏的直立位置（见下文）。</li>
	<li>使用连接的1 mL注射器进行多次充气/放气测试，确保气囊密封不漏气。</li>
	<li>通过三通阀将套管连接至压力传感器，用于后续测量心室内发展压（图1C）。</li>
</ol>
2. 克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）和朗根多夫灌流系统的准备
<ol>
	<li>使用恒流模式（由滚压泵驱动）或恒压模式（由玻璃柱中的静水压产生）建立 Langendorff 灌流系统。 
	注意：Langendorff 心脏制备的详细步骤此前已有描述12。</li>
	<li>配制 2 L 改良 KHB 溶液（单位：mM：116.02 NaCl、4.63 KCl、1.10 MgSO4·7H2O、1.21 K2HPO4、2.52 CaCl2·2H2O、24.88 NaHCO3、8.30 D-葡萄糖和 2.0 丙酮酸钠）。
	<ol>
		<li>称取除 CaCl2 外的所有化学试剂，加入 1.8 L 双蒸水中，在 2 L 烧瓶中溶解。</li>
		<li>在磁力搅拌下，用碳氧混合气（95% O2/5% CO2）通气至少 5 分钟，使溶液平衡至 pH 7.4。</li>
		<li>加入 0.74 g CaCl2·2H2O，并用双蒸水定容至 2 L。</li>
		<li>继续磁力搅拌并用碳氧混合气通气 5 分钟。</li>
		<li>用 0.2 µm 滤膜过滤 KHB 溶液，以去除可能阻塞心脏微循环的小颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Langendorff 灌流系统的准备。
	<ol>
		<li>将过滤后的 KHB 溶液置于预热的水浴中（38 °C），持续用碳氧混合气通气，使 KHB 储液瓶内压力达到 100 cmH2O。</li>
		<li>将储液瓶连接至玻璃柱，建立 100 cmH2O 的静水压，用于 KHB 的 Langendorff 灌流；同时继续在玻璃柱内用碳氧混合气对 KHB 通气。</li>
		<li>调节加热系统温度，使主动脉插管出口处的液体温度为 37 °C。</li>
		<li>确保管路系统中无气泡。</li>
		<li>继续用碳氧混合气对 KHB 氧合 5 分钟，直至 KHB 中的 PO2 达到 500–600 mmHg（通过血气分析仪测定）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置灌流系统，通过手动切换实现 100 cmH2O 的恒压灌流或约 10–20 mL/min 的恒流灌流。或者，使用可互换的 STH 泵控制器，实现灌流模式的即时切换。</li>
</ol>
3. 心脏的分离与插管
注意：使用体重为 300–350 g 的雄性 Wistar 大鼠，以确保心脏大小与预制成型的乳胶帽相匹配。大鼠接受左前降支冠状动脉（LAD）结扎 50 分钟，随后进行再灌注，或仅进行假手术。心肌梗死（MI）诱导方法的详细步骤已在其他文献中报道13。在梗死动物中，倒置心脏实验于手术后第 5 天进行。
<ol>
	<li>使用连接动物固定室（20 L）的异氟烷蒸发器（2% V/V）对大鼠进行麻醉。</li>
	<li>待大鼠达到深度麻醉后，将其转移至手术台（无温度控制）。</li>
	<li>用镊子提起胸骨下方的皮肤和肌肉，用粗剪刀沿肋骨下缘剪开。</li>
	<li>使用精细剪刀在肋缘处的膈肌上做一小切口，然后向尾侧剪开肋骨，形成整个腹侧胸壁的皮瓣。</li>
	<li>用拇指、食指和中指轻轻抓住心脏，缓慢向上提起，使心脏血管轻微拉伸。</li>
	<li>切除心脏直至主动脉完全暴露。</li>
	<li>将心脏放入含有50 mL冰冻KHB溶液（4 °C）的100 mL烧杯中，并转移至灌流装置。</li>
	<li>立即通过主动脉将心脏套入滴注套管，并用缝线（4-0）牢固结扎。避免气泡进入心脏。</li>
	<li>维持恒定灌流压力（100 cmH2O）。或者，也可采用恒定流速模式（起始流速为20 mL/min）。 
	注意：对于经验丰富的操作者，从打开胸腔到将心脏连接至灌流套管的时间应约为3分钟。</li>
</ol>
4. 逆转心脏模型
<ol>
	<li>轻轻旋转主动脉插管，直至心脏后壁呈正面观（en face view）。</li>
	<li>用剪刀去除结缔组织，暴露左心房开口，为心室腔内插管做好准备。</li>
	<li>通过左心房将连接于刚性导管的未充气乳胶球囊插入左心室。</li>
	<li>向球囊充气，直至其完全充满心室腔（充气体积已在注射器上预先标记）。</li>
	<li>将心脏翻转，使其倒置，并通过心室内的球囊导管支撑心脏。</li>
	<li>如图1C所示，使用带有刚性金属导管的心室内球囊将倒置的心脏机械固定于直立位置。</li>
	<li>调整心脏位置，避免主动脉根部过度扭转。</li>
	<li>调节舒张压至3–5 mmHg（由心室内球囊测量；见图1C）。</li>
	<li>观察心脏心外膜表面，确保有小液滴形成。</li>
	<li>用手指轻轻按压乳胶帽，将其覆盖在整个心脏表面。</li>
	<li>确保乳胶帽覆盖大部分心室表面。</li>
	<li>如有气泡，用1 mL注射器轻轻抽吸，去除帽内及导管中的气泡。</li>
	<li>将CT引流导管的远端开口调节至低于心脏水平10 cm处。 
	注意：此操作可通过负静水压实现轻微抽吸。</li>
	<li>将CT液滴收集于置于冰盐混合物（冰与NaCl按1:1混合）中的1.5 mL收集管中，共收集约0.15–1.5 mL CT。 
	注意：冰盐混合物可使收集管内温度稳定在零度以下（约-4 °C）。 
	注意：采样时间取决于实验目的。假手术动物（n = 3）的CT流速约为27 ± 20 µL/min，冠状动脉结扎动物（n = 11）约为100 ± 47 µL/min。</li>
	<li>称重后将CT样本在液氮中速冻，并储存于-80 °C，以备后续检测。</li>
</ol>
5. CT 分析
<ol>
	<li>根据科学问题，使用CT液体进行代谢物分析。 
	注意：图 2 和图 3 中所示数据来自恒压灌注（100 cmH2O），在10分钟内收集到约0.15–1.5 mL的CT液体。该时间和体积足以用于蛋白质组学分析（最低需50 µL；图 2）14 和多种嘌呤的高效液相色谱分析（最低需20 µL；图 3）15。</li>
</ol>

<ol><li>Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+heart+failure%3A+a+community+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Death in heart failure: a community perspective.</a> Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).</li>
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<li>Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sixteen+nucleotides%2C+nucleosides+and+bases+using+high-performance+liquid+chromatography+and+its+application+to+the+study+of+purine+metabolism+in+hearts+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation.</a> J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).</li>
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<li>Heller, L. J., Mohrman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+interstitial+adenosine+from+surface+exudates+of+isolated+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

逆转心脏模型基于成熟的朗根多夫心脏灌流技术12，通过将心脏倒置并使用刚性心室内球囊导管固定于倒置位置来实现。通过这种方法，心脏间质渗出液可在重力作用下从心脏基底部滴落，从而与冠状静脉流出的灌流液实现物理分离9。通过在心脏表面放置一个薄而柔韧的乳胶帽，可连续收集渗出液（CT）。
该方法操作简便，除兰格多夫装置外成本极低。然而，某些步骤在技术上对于获得可重复且稳定的结果至关重要。这些步骤包括确保乳胶帽与心脏形状完全贴合，并覆盖心室表面约90%，而非心房。从动物体内取出心脏至实施逆行灌注的时间应少于3分钟，因为长时间缺血可能改变心脏代谢并促进心源性渗出液的形成。通过心室内球囊测量的左心室舒张末期压力应设定为3–5 mmHg，以适当充盈心室腔。球囊过度充气可能因血管受压而影响冠状动脉血流。样品收集管（1.5 mL离心管）应置于冰上，以防止目标代谢物和蛋白质发生潜在降解。
此外，实验的成功在很大程度上依赖于心脏制备、分离和插管过程中良好的手工...

心力衰竭（HF）是全球人类死亡的主要原因1心力衰竭常由心肌炎、心肌缺血性损伤及左心室重构引起，导致心脏收缩功能进行性恶化以及患者生活质量下降。尽管心脏病学和心脏外科领域的进展已显著降低了心力衰竭的死亡率，但这些治疗手段仅能起到暂时缓解作用 &#34;延迟剂&#34; 一种不可避免的进行性疾病过程，具有显著的发病率。因此，目前缺乏有效治疗手段凸显了识别能够预防甚至逆转心力衰竭的新型分子靶点的必要性。这包括细胞外基质的改变、失控的心脏免疫反应以及心肌细胞与非心肌细胞之间的相互作用2.
必须认识到，心肌细胞所处的微环境会直接影响受损心脏的免疫反应和再生能力。在用生理盐水灌注的离体心脏中，心包液（CT）以微小液滴的形式出现在心脏表面，这些液滴来源于间质液腔隙即， 微环境），在生理和病理生理条件下3,4,5因此，对CT的分析（即， 组织间液可能有助于识别调控心肌代谢和收缩功能的因素6 或在迁移至受损心脏后影响免疫细胞功能。这可能有助于开发治疗心力衰竭的新型治疗策略。
从小鼠心脏收集心肌组织液（CT）在技术上具有挑战性。在常规的Langendorff灌注心脏模型中，由于CT与冠状静脉流出液混合，导致从间质空间释放的代谢物或酶浓度被不可预测地稀释，因此难以单独收集纯净的CT。一种可能的解决方案是通过插管肺动脉并同时结扎肺静脉来排除静脉流出液7。然而，该方法在实施肺动脉和肺静脉插管与结扎时存在操作困难，可能导致静脉流出液渗漏进入心肌组织液。采用反向心脏模型的概念最早由Kammermeier团队提出，他们将离体灌注的心脏倒置，并在心外膜表面放置一个薄的乳胶帽，从而实现连续采集不受静脉流出液污染的CT8,9。利用该方法，研究已证实CT可灵敏地反映心脏释放的代谢物9、脂肪酸通过毛细血管的转运过程8以及病毒颗粒的分布情况10。
最近，旁分泌因子可能调节局部免疫反应并促进心脏血管生成11 已被证实参与干细胞治疗心脏病的有益作用。对逆转心脏中的CT进行分析可能有助于从化学角度鉴定这些特定的旁分泌因子。此外，CT还可能有助于鉴定参与其中的其他因子 体内 心脏中免疫细胞的活化
本文提供的从心脏表面采集CT的详细描述，对于研究免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和心肌细胞之间相互作用及其与整体心脏功能关系的研究人员具有实验上的实用价值。如上所述，组织间液携带了心脏内细胞间通讯的信息，而通过采集CT可方便地评估这些信息。包括如何从反向心脏采集CT的视频方案在内的详细技术说明，将有助于推动这一独特技术的未来应用。

<table><tbody><tr><td>乳胶溶液</td><td>ProChemie</td><td>Z-Latex LA-TZ</td><td>http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz</td></tr><tr><td>铝制模具</td><td>自制</td><td>-</td><td>反向心脏模型</td></tr><tr><td>通用烘箱</td><td>Memmert</td><td>UNB 400</td><td>反向心脏模型</td></tr><tr><td>乳胶气球</td><td>Hugo Sachs</td><td>4号尺寸</td><td>反向心脏模型</td></tr><tr><td>铣床</td><td>Proxxon</td><td>MF70</td><td>反向心脏模型</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>SZBD0810V</td><td>化学品</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Roth</td><td>68852</td><td>化学品</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>49361</td><td>化学品</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Merck</td><td>58861</td><td>化学品</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Merck</td><td>48731</td><td>化学品</td></tr><tr><td>无水D(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>83371</td><td>化学品</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fluka</td><td>21097</td><td>化学品</td></tr><tr><td>天平</td><td>VWR</td><td>SE 1202</td><td>称量化学品</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>Millpore</td><td>-</td><td>溶解化学品</td></tr><tr><td>医用压力传感器</td><td>Gold</td><td>-</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>医用流量探头</td><td>Transonic</td><td>3PXN</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>加热循环水浴</td><td>Haake&amp;nbsp;</td><td>B3 ; DC1</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>实验室及真空管路</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>动物研究用流量计</td><td>Transonic</td><td>T206</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>PowerLab 数据采集设备</td><td>AD Instruments</td><td>Chart 7.1</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>LabChart 数据采集软件</td><td>AD Instruments</td><td>Chart 7.1</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Glison</td><td>MINIPULS 3</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>玻璃水柱</td><td>自制</td><td>-</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>水浴防护剂</td><td>VWR</td><td>462-7000</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>无菌一次性滤器（0.2 &amp;micro;m）</td><td>Thermo Scientific</td><td>595-4520</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>血气分析仪</td><td>Radiometer</td><td>ABL90 FLEX PLUS</td><td>气体分析仪</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>UN1170</td><td>清洗&amp;nbsp;管路</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td>清洗管路</td></tr><tr><td>Wistar 大鼠</td><td>Janvier</td><td>-</td><td>实验动物</td></tr><tr><td>不锈钢剪刀</td><td>AESCULAP</td><td>BC702R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>不锈钢剪刀</td><td>AESCULAP</td><td>BC257R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>大型镊子</td><td>AESCULAP</td><td>-</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>8 mm 不锈钢镊子</td><td>F.S.T</td><td>11052-10</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>超细（10/0）砂纸</td><td>3M</td><td>051111-11694</td><td>反向心脏模型</td></tr></tbody></table>

用于从离体大鼠心脏收集间质渗出液的倒置心脏模型

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

本方案描述了一种独特的方法，可从分离的、经生理盐水灌注的大鼠心脏中收集心源性渗出液（CT）。在采用Langendorff技术进行心脏分离并逆行灌注后，将心脏翻转至倒置位置，并通过插入左心室的球囊导管进行机械固定。随后，将一个预先塑形、与大鼠心脏平均尺寸相匹配的薄乳胶帽覆盖于心外膜表面。乳胶帽的出口连接硅胶管，其远端开口位于心脏基底水平下方10 cm处，从而产生轻微负压吸引。持续在心外膜表面生成的CT被收集于冰浴冷却的小瓶中，以供后续分析。在对照组和梗死心脏中，CT的生成速率介于17至147 µL/min之间（n = 14），约占冠状静脉回流灌注液的0.1%-1%。蛋白质组学分析和高效液相色谱法（HPLC）结果显示，所收集的CT中含有多种蛋白质和嘌呤能代谢物。

反向心脏模型可用于在离体、逆向灌注的大鼠心脏中收集心肌间质渗出液（图1A-C）。当以100 cmH2O的恒定压力进行灌注时，间质液的生成速率在17至147 µL/min之间，约占离体心脏冠状静脉流出液的0.1-1%。
通过二辛可宁酸（BCA）法测定，CT 中的蛋白质含量为 1.08 ± 0.40 mg/mL（n = 6）。一维凝胶电泳分析（SDS-PAGE）显示，心脏渗出液中存在多种蛋白质（图 2A）。对经历 50 分钟缺血/再灌注的心脏所获取的 CT 进行二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）分析。如 图 2B 所示，缺血心脏 CT 中有多种蛋白质表达上调。在鉴定出的蛋白质中，70.1% 为细胞外基质蛋白，4.6% 为...

本方案描述了一种从离体灌注大鼠心脏中收集心肌间质液的方法。为了将间质渗出液与冠状静脉流出的灌注液在物理上分离，将兰格多夫（Langendorff）灌注的心脏倒置，并使用柔软的乳胶帽收集心脏表面形成的渗出液（间质液）。

本方案描述了一种独特的方法，可从经生理盐水灌注的离体大鼠心脏收集心脏渗出液（CT）。

该倒置心脏模型的总体目标是从离体大鼠心脏收集心肌间质渗出液。在跳动的心脏中，心肌细胞会向周围的间质液空间释放旁分泌因子。这一点非常重要，因为间质液空间承载着心肌细胞之间相互通讯的信息。在心肌梗死后心肌的炎症和再生条件下，这一点尤为重要。在本视频中，我的合作者丁博士和谭博士将向您展示我们在此处使用的一种技术，即从离体灌注的大鼠心脏表面收集间质液。制作乳胶心脏套（或称帽）时，需使用一个与大鼠心脏平均大小相匹配的铝制模具，并用超细砂纸进行抛光处理。将模具的颈部垂直固定在铣床上，并开始缓慢旋转模具。然后，将20毫升液态乳胶倒入50毫升的玻璃烧杯中，将旋转的模具浸入乳胶中。随后，缓慢将其提起，并继续旋转模具15分钟，直至乳胶完全固化。旋转对于制作这种乳胶泡沫以及使液态乳胶均匀分布在模具表面至关重要。因此，务必确保模具从乳胶中提起时仍保持旋转。待乳胶干燥后，用滑石粉涂抹乳胶表面，以防止乳胶受损。停止旋转，然后轻轻地将模具从机器上拆下。小心地将乳胶从模具上取下。现在，将一段25厘米长的硅胶管连接到乳胶帽的出口上。该试管用于收集心肌间质渗出液，即CT。接下来，将适用于大鼠的心室球囊牢固地安装在L形金属插管上，该插管连接一个装有1毫升水的注射器。然后用水填充适用于大鼠的心室球囊。使用注射器多次充气和放气，确保球囊完全密闭不漏气。然后，通过三通阀将套管连接至压力传感器。最后，在注射器上标记气球充盈心室腔时的位置，用于测量心室内压。在进行心脏制备之前，按照文本方案准备好朗根多夫灌流系统。现在，将一只体重300至350克的雄性Wistar大鼠完全麻醉后，转移至室温手术台。熟练操作时，以下建立心脏插管的步骤应仅需约三分钟。使用镊子提起胸骨下方的皮肤和肌肉，用粗剪刀沿肋骨下缘进行剪开。接下来，使用精细剪刀在肋缘处的膈肌上做一个小切口。然后，沿肋骨向尾侧剪开，形成一个完整的腹侧胸壁瓣。现在，轻轻抓住心脏，缓慢将其提起，直至心脏血管开始被拉伸。然后，切除心脏直至主动脉完全暴露，并将心脏转移至含有50毫升冰冷KHB溶液的100毫升烧杯中。立即取心脏置于灌流装置上，将主动脉套入滴注套管，用4-0缝线牢固结扎，确保无空气气泡进入心脏。然后，施加恒定的灌注压力或灌注流量。为建立逆向心脏装置，首先轻轻旋转主动脉套管，直至心脏后壁正对视野。接着剪除结缔组织，暴露左心房的开口。接下来，轻轻抓住心脏并将其倒置。将心脏安装到已准备好的心室球囊上（此时球囊处于未充气状态），并将球囊送入左心室。此时利用球囊导管组件作为支撑，使心脏在直立位置上得到机械固定。将注射器活塞推进至填充刻度，使球囊充气直至完全充满整个心室腔。固定心脏，以尽量减少主动脉根部的应力。该步骤需要练习掌握。现在，观察球囊上的压力计，并将舒张压调整至3到5毫米汞柱。如果压力设置正确，心外膜上应形成小液滴。接下来，轻轻地将乳胶帽覆盖在心脏上。即使是最凸出的心室表面也应被完全覆盖。继续操作前，检查帽内是否有气泡。若存在气泡，可用注射器轻轻抽吸以去除。现在，将引流管末端置于低于心脏10厘米的位置。将滴出的CT收集到1.5毫升离心管中，并通过将其嵌入冰与氯化钠1:1混合物中，使离心管保持在4摄氏度以下。收集0.15至1.5毫升的CT，随后称重样本并用液氮速冻。将其保存在零下80摄氏度，直至可进行处理。当以100厘米水柱的恒定压力对逆向灌注心脏模型进行 retroperfusing 时，可收集到冠状静脉流出液的1/10至1%。使用BCA法测定CT的蛋白含量，平均为1.1毫克/毫升。简单的凝胶电泳揭示了广泛的蛋白质谱。利用二维差异凝胶电泳（2D DIGE）将正常样本与经历50分钟缺血再灌注的心脏样本进行比较，发现缺血心脏的传导组织（CT）中多种蛋白质表达上调。对上调的蛋白质进行了蛋白质组学分析。嘌呤也引起了极大关注。嘌呤是关键的信号分子，可调节心脏免疫反应、血管运动张力和心脏功能，尤其是在缺血性损伤后。CT 的 HPLC 分析显示，受损心脏中多种嘌呤的浓度升高。在进行该操作时，需要注意的是，离体心脏中形成的转心肌内日期并不能完全模拟体内条件的真实组成。

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