一种快速高效解剖蛹期翅的方法 果蝇 适用于免疫检测或PCR实验

本实验的总体目标是建立一种快速高效的方法，用于解剖适用于免疫检测或PCR分析的黑腹果蝇（Drosophila）蛹翅。此处描述的方法源于对一种快速且高效获取适合进行PCR分析或免疫检测的蛹翅样本方法的需求。使用湿润的画笔轻轻将零小时羽化后（APF）的蛹从培养管中移出，并转移至新的培养管中，以完成其发育过程。

例如，如果使用的是羽化后24小时的蛹，则只需将其在小瓶中放置22小时。在22小时时，用毛笔将蛹转移至带有双面胶带的显微镜载玻片上，以避免损伤蛹体。

应将蛹摆放成一排，背面向上，头部朝向同一方向。此后，将显微镜载玻片放回恒温环境，使蛹完成相应的发育时间。在此情况下，发育时间为24小时。

带有双面胶带的显微镜载玻片将作为临时解剖平台，用于去除蛹壳。在显微镜载玻片上放置两小时后，蛹壳会变干，从而易于用镊子将其破碎。解剖的第一步是将蛹从尸体中取出。

然后将蛹转移到另一张载玻片上，载玻片上贴有双面胶带，蛹的尸体将被留在原处。将蛹腹面朝上固定在胶带中央。

在进行翅切割之前，必须按照免疫组织化学实验步骤，用固定液覆盖蛹体。该溶液将起到固定作用，并使翅从表皮中游离出来。使用镊子轻轻移除蛹壳上的气门盖。

用镊子将蛹壳打开，沿蛹体侧面至尾端撕开一条线。在适当的光照下，可观察到蛹的内部形态，在蛹翅铰合处上方会显现出一个明显的空隙。该空隙可作为打开蛹壳的引导，避免损伤蛹体。

当从侧面打开虫 case 时，可将部分虫 case 取下，通过其开口边缘将其提起并移至对侧，由双面胶固定。解剖结束后，蛹体几乎完全裸露，仅有一小块虫 case 覆盖在后端末端。

借助镊子，轻轻下压虫茧的剩余部分。此操作可抬高蛹的内部末端，使头部和胸部保持在有利位置，便于在后续步骤中固定。取一张带有双面胶的新载玻片，将其倒置在蛹上。

然后轻轻按压，使蛹粘附在胶带上，再缓慢滑动载玻片，以将蛹从其余组织中分离。将显微镜载玻片翻转，蛹将粘附在头部或胸部区域的背侧。

用于免疫组织化学时，用4%多聚甲醛覆盖整个裸露的蛹。在固定剂中放置10分钟后，借助剪刀，在翅的铰合区或其附近做一小切口，使固定剂能够渗透至翅上皮。

五分钟后，用镊子从角质层边缘撕开，扩大开口，使翅上皮从角质层囊中释放出来。一旦翅组织被释放，将其留在多聚甲醛溶液中，继续固定至满30分钟。本视频中描述的解剖方法可用于制备来自不同发育阶段的高质量黑腹果蝇蛹翅样本，适用于多种实验技术。

该方案可用于同时解剖一只或数只蛹。这有助于加快操作流程，更容易获得大量解剖好的翅膀。从打开的茧中取出裸蛹时，需确保其后端尖端足够小。

尽管可以同时移除一排四个或五个无蛹壳的蛹，但更关键的是能够使用单条双面胶带分步连续移除那些仍附着在蛹壳上的样本。这是一张24至30小时龄蛹后翅的共聚焦图像。染色显示了hedgehog通路的经典受体patched蛋白、细胞核以及肌动蛋白丝的表达情况。

类似的解剖方法可用于获取更大的翅组织样本以分离 mRNA。该 mRNA 可用于合成 cDNA，进而用于 PCR 反应。此处展示了用于检测 patched 和 actin 表达的扩增产物。

该方案提供了一种简便的方法，用于获取仍保持翅膀典型形态的蛹期翅样本。利用这些制备样品，可获得图像序列，进而投影为二维或三维图像，以研究蛋白质在翅分化过程中的分布和/或富集情况。类似的方案也可用于收集大量蛹期翅样本，以合成cDNA——PCR反应中必不可少的一种分子。

该方案为蛹期翅组织解剖提供了已发表方法之外的一种替代性且互补的技术途径。