小鼠小脑颗粒神经元神经元死亡和变性的模型研究

本协议描述了一种简单的方法, 分离和培养的小鼠脑颗粒神经元 (CGNs) 从6-7 天的老幼崽, 有效的转导 CGNs 的损失和增益的功能研究, 并建模 NMDA 诱导神经元兴奋,低诱导的细胞死亡, DNA 损伤, 和氧化应激使用相同的培养模式。

该程序的总体目标是产生健康的小脑颗粒神经元纯种群，并对其进行基因作，并在体外原代培养中模拟神经元损伤的不同机制。这种方法可以帮助回答神经元损伤领域的关键问题。我们使用此协议来研究急性脑损伤和神经退行性疾病后神经损伤的潜在分子机制。

该方案的主要优点是我们可以使用培养系统模拟不同的细胞死亡机制，例如兴奋性毒性、氧化应激、DNA 损伤和发育事件。虽然这种方法可以提供对神经元损伤的见解，但它也可以与大鼠的小脑神经元一起使用，以研究响应生长因子和副作用的神经元活动和形态发生。要提取 6 到 7 天大的小鼠的大脑，用一把镊子抓住头部，然后用显微解剖剪刀将皮肤向前切向头部。

向后推皮肤，露出头骨。接下来，用剪刀的尖端穿透头骨，前后切开。注意不要损伤小脑，便于识别和去除脑膜，然后用镊子剥开颅骨，露出大脑。

用一把镊子或抹刀，轻轻地将大脑梳理成凉爽的解剖液。为了分离小脑，将大脑放入补充有硫酸镁的解剖溶液中，并将溶液和大脑保持在冰上。在解剖显微镜下，用细镊子去除脑膜，然后在补充硫酸镁的解剖液中从脑中解剖出小脑。

这有助于剥离剩余的脑膜，并允许一个人在层之间进入以清洁小脑褶皱。脑膜的存在是神经元培养导致不健康的细胞并最终导致细胞死亡。因此，在进行培养之前确保完全去除脑膜非常重要。

之后，将小脑转向腹侧并确保去除脉络丛。接下来，将小脑拉入含有 1 毫升硫酸镁补充解剖液的 35 毫米培养皿中。将组织切成小块，然后转移到含有 30 毫升硫酸镁缓冲解剖液的 50 毫升管中。

在此步骤中，将含有切碎脑组织的 15 毫升试管以 644 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。之后去除上清液，加入 10 毫升胰蛋白酶解剖液。然后在 37 摄氏度下高速摇动桌子 15 分钟。

向试管中加入 2 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液 1 mL，轻轻摇动 2 分钟。随后，将试管以 644 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。5 分钟后，去除上清液，加入 2 毫升胰蛋白酶抑制剂溶液 2，然后将其转移到 15 mL 试管中。

然后研磨 15 毫升试管中的组织，直到溶液变得浑浊。静置 5 分钟。然后去除澄清的上清液，将其转移到含有 1 毫升补充氯化钙的解剖液的新试管中。

在含有沉淀的试管底部再加入 2 毫升胰蛋白酶抑制剂溶液 2。再次研磨，静置 5 分钟。去除上清液，将其添加到含有上一步中上清液的试管中。

重复此过程，直到大部分组织机械解离。对于每毫升上清液，向上清液集合中加入 0.3 毫升补充氯化钙的解剖溶液。混合试管内容物，然后在室温下以 644 x G 离心 5 分钟。

之后，去除上清液。向沉淀中加入 10 毫升新鲜培养基并混合。然后对活细胞进行计数，并将其稀释至每毫升 6 个细胞的 1.5 倍 10 的浓度。

将细胞接种在先前制备的多聚 D-赖氨酸板上。对于四个孔板，将 0.5 mil 限制剂的样品板板为每孔 7.5 乘以 10 的样品。对于 35 毫米培养皿，将 4 毫升样品铺板，每板给第六个细胞 6 乘以 10。

对于盖玻片，将 0.5 毫升板，每孔给第五个细胞的 7.5 乘以 10。24 小时后，将 AraC 添加到板中以减少神经胶质细胞污染。如果要将细胞维持 7 到 8 天，请在第 3 天重复此处理，并将培养物维持在 37 摄氏度的 5% CO 2 培养箱中。

对于维持超过 5 天的培养物，从第 5 天开始，每两天用葡萄糖喂养培养物。为了用 NMDA 诱导神经元兴奋性毒性，在体外 7 天后，用 100 微摩尔 NMDA 和 10 微摩尔甘氨酸处理小脑颗粒神经元 1 小时。然后，用来自平行培养物的条件培养基替换培养基，无需处理。

该浓度导致处理后 24 小时有 50% 的细胞死亡。对于 ROS 诱导的细胞死亡，用 75 至 100 微摩尔的过氧化氢处理神经元 5 分钟。5 分钟后，将其切换到来自平行培养物的条件培养基中。

由于过氧化氢的不稳定性，必须将浓度优化到在 24 小时后诱导 50% 至 70% 细胞死亡的水平。该浓度通常在 75 到 100 微摩尔之间。为了通过 DNA 损伤诱导细胞死亡，用 10 微摩尔喜树碱处理小脑颗粒神经元，以在 24 小时内诱导超过 50% 的细胞死亡。

对于小脑颗粒神经元中低钾诱导的神经元凋亡，在体外 7 天后将含有 25 毫摩尔钾的培养基更换为含有 5 毫摩尔钾的低钾培养基。用慢病毒转导神经元，RFP 在铺板时为 3。在体外 7 天固定和染色。

RFP 信号 MAP2 和 Hoechst 的共定位表明健康神经元被慢病毒完全转导。此处显示的图像代表了感染不同腺病毒 MOI 的神经元的活死测定分析，以测量毒性。感染了表达 LacZ 且 MOI 在 25 到 50 之间的腺病毒的小脑颗粒神经元可实现最高效率，同时保持最低毒性。

当以这种 MOI 感染时，与对照相比，细胞存活率的差异小于 1%。这些图显示了对照小脑颗粒神经元和用 NMDA 处理的小脑颗粒神经元的 Hoechst 染色以诱导细胞死亡。注意 NMDA 处理后 pyknotic 核的形成。

这是细胞死亡的迹象，在用 100 微摩尔 NMDA 和 10 微摩尔甘氨酸处理后 24 小时，可以在大约 50% 的培养物中看到。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个半小时内完成，并伴有六次鼠标弹出。在进行这种技术时，重要的是要根据需要使用无菌技术和链式手术器械，以最大限度地降低培养物污染的风险。

开发后，这项技术为神经科学领域的研究人员研究原代小鼠神经元的神经元发育和神经元损伤铺平了道路。观看此视频后，您应该能够培养小脑颗粒神经元，使用病毒对其进行基因作并诱导不同的神经损伤机制。在此程序之后，可以执行其他方法，如免疫荧光或细胞活力测定，以回答诸如目标基因是否能增强细胞存活以应对兴奋性毒性、氧化应激或 DNA 损伤等问题。