嗅球的四次免疫染色用于嗅觉感觉轴突分子识别码的可视化
June 5th, 2017
嗅觉神经元表达各种各样的轴突分选分子，建立适当的神经电路。该方案描述了一种免疫组织化学染色方法来观察嗅觉神经元轴突末端的轴突分选分子的组合表达。
这种免疫组织化学染色方法的总体目标是可视化嗅觉感觉神经元轴突末端轴突分选分子的组合表达。这种方法可以帮助表征嗅觉发育领域的关键过程，例如轴突导向、突触形成和嗅觉感觉神经元的再生。这项技术的主要优点是它允许科学家比较和分析嗅球中轴突分选分子的表达模式，而无需维持切片之间的差异。
这种方法的视觉演示至关重要，因为包埋步骤很难学习，因为嗅觉组织样本在模具中的位置和角度很难用语言描述。从 1 到 2 周龄的小鼠的头部开始，这些小鼠通过心内灌注 4% 多聚甲醛固定。将剪刀刀片插入上下牙齿之间的空间，水平切割以去除下颌骨。
然后用镊子和剪刀修剪掉多余的组织，留下嗅组织，包括嗅球和嗅上皮。将嗅组织浸入 PBS 中以去除鼻腔中的空气，然后垂直切割以去除大脑的后部，并将嗅觉组织放在包埋模具的底部，切割端朝下。在模具中填充最佳切割温度化合物，然后浸入液氮中。
组织和 OCT 完全冷冻后，在 20 摄氏度的低温恒温器中平衡组织 1 小时。现在用低温恒温器制作嗅球的连续旁下垂部分，并通过粘附在 MAS 涂层的载玻片上来收集它们。粘贴后，立即用吹风机吹干载玻片。
在室温下用 PBS 洗涤干燥的玻片 5 分钟，开始免疫染色。通过在室温下将载玻片与 5% 封闭溶液孵育 1 小时来封闭非特异性结合位点。然后向每张载玻片中加入 400 微升用 1% 封闭溶液稀释的一抗混合物。
将载玻片在室温下孵育过夜。第二天，弃去一抗溶液，在室温下用 PBST 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。然后向每张玻片中加入 400 微升二抗和 PBS 混合物。
避光并在室温下孵育 1 小时。孵育后，弃去溶液，再次在室温下用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。最后，将两滴封固剂滴到每张载玻片上，放置盖玻片，并去除气泡，将盖玻片安装在载玻片上。
使用荧光显微镜使用适用于每个荧光团的滤光片获得荧光图像。调整曝光时间以获得图像的荧光信号，而不会产生饱和度。通过 GLUT2 的免疫荧光信号定义肾小球结构。
使用图像 J 测量肾小球内轴突分选分子的染色强度。该图像显示了用 VGLUT2 抗体进行免疫染色的两周龄小鼠的副嗅球切片，红色显示 Kirrel2，绿色显示信号素 7A，蓝色显示 OLPC。合并图像表明，参与肾小球分离的轴突分选分子以与位置无关的马赛克模式表达。
每个肾小球由突触前标志物 VGLUT2 的荧光信号定义。肾小球结构被虚线包围。在每个肾小球中测量轴突分选分子的信号强度。
如图所示，轴突分选分子在每个肾小球中差异表达。例如，肾小球 3 具有高水平的 OLPC、中等水平的信号素 7A 和较低水平的 Kirrel2，这种差异可以通过测量染色强度来量化。而肾小球 4 的 OLPC 水平高，而 Kirrel2 和 Semaphorin 7A 水平较低。
同样，这种差异可以通过测量染色强度来量化。在尝试此程序时，重要的是要记住省略通常推荐的 PFA 固定后和蔗糖溶液处理。看完这个视频，你应该对如何在单个嗅球切片上放置更多的肾小球，以及如何用多种抗体进行高质量的免疫染色有了很好的了解，可以应用于其他大脑区域。
不要忘记希望，这种方法将帮助您在未来的实验中取得成功。
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概述
该协议概述了一种免疫组织化学染色方法，用于可视化嗅觉感受神经元轴突末端轴突分类分子的表达。该技术对于理解嗅觉发育过程（如轴突引导和突触形成）至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 嗅觉发育
- 免疫组织化学
背景
- 嗅觉感受神经元在嗅觉中起着关键作用。
- 轴突分类分子对于建立正确的神经回路至关重要。
- 理解它们的表达模式可以提供对嗅觉系统功能的见解。
- 可视化这些表达可以帮助研究嗅觉感受神经元的再生过程。
研究目的
- 可视化轴突分类分子的联合表达。
- 表征嗅觉发育中的关键过程。
- 促进嗅球中表达模式的比较。
使用的方法
- 免疫组织化学染色技术。
- 使用一至两周大的小鼠头部。
- 心脏灌注4% 甲醛固定。
- 嗅觉组织样本的嵌入和切片。
主要结果
- 成功可视化轴突分类分子表达。
- 展示了能够在不同切片之间分析表达模式的能力。
- 提供了嵌入嗅觉组织的明确方法。
- 强调了可视化演示对学习该技术的重要性。
结论
- 免疫组织化学方法对于研究嗅觉感受神经元是有效的。
- 理解轴突分类分子可以增进对嗅觉系统发育的认知。
- 该技术可以成为未来嗅觉再生研究的有价值工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
