基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法 关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本实验的目的是分离并鉴定由两种CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法产生的克隆敲除细胞系。其中一种方法可检测由非同源末端连接导致的蛋白质敲除，另一种方法则可检测由同源定向修复产生的基因组扰动。该方法在分子生物学领域尤为有用，因为在该领域中，构建具有基因组扰动的细胞系是解析基因功能的重要工具。

该技术的主要优势在于，它是一种快速且通量相对较高的方法，可利用基本的分子生物学技术轻松实施。非同源末端连接会引入小片段的缺失或插入，并通过点免疫印迹法进行检测；而同源定向修复则能够实现更大且更精确的基因扰动，并通过菌落PCR进行评估。本实验采用在DMEM培养基中培养的T-REx-293细胞，培养基添加10% FBS，在37°C、5% CO₂条件下培养。

转染前，将细胞接种于6孔板中，并设置一个未转染的对照孔。将细胞培养至约70%汇合度。使用商业转染试剂盒，按照其操作流程，用2.5 µg总质粒对细胞进行转染。

对于无需筛选的细胞转染，使用2.5微克Cas9-sgRNA质粒。对于需要筛选的细胞转染，使用0.75微克Cas9-sgRNA1、0.75微克Cas9-sgRNA2以及1微克同源重组模板。将转染后的细胞与未转染的对照细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育48小时。

对于转染了筛选标记的细胞，使用相应的药物（本实验中为新霉素）开始药物筛选。将六孔板放回培养箱。每天观察一次经处理的细胞，检测细胞死亡情况，直至未转染的对照组细胞全部死亡。

为了分离单克隆群体，首先在筛选后的原始孔中将细胞培养至100%汇合度。接着对细胞进行连续稀释并计数。由于单克隆菌落的正确形成是获得完全敲除的关键，因此必须仔细确定合适的稀释比例，以使细胞以期望的密度接种。

确定正确的稀释度后，将细胞以每孔0.33个细胞的密度接种到96孔板中。为确保获得不止一个正确克隆，建议起始接种三块96孔板。在2至4周内观察细胞集落，直至肉眼可见集落形成。

这些代表性图像显示了处于不同生长阶段的克隆。分别是接种时的单个细胞、第5天的细胞以及第10天形成的结构完整的克隆。使用无菌的移液器吸头，仔细而精确地挑取可见的克隆，并将其重新接种至新的孔中，以促进单层细胞的生长。

将细胞继续在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。通过点免疫印迹法以高通量方式筛选无筛选压力的基因敲除候选克隆，以评估其蛋白产物。当单个克隆生长至50%至100%汇合度时，通过在孔内移液吹打使细胞单层脱落。

从每个孔的100微升总体积中分装出90微升至洁净的微量离心管中。本视频中仅处理两个样本。以6,000 RPM离心5分钟，移除上清液，并用10微升1× SDS上样缓冲液裂解细胞沉淀。

向孔中剩余的细胞加入90微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱继续培养细胞。用移液器取1微升细胞裂解液点加到干燥的硝酸纤维素膜上形成点样。每个样本在两张不同的膜上各点样两次，形成两组相同的样本排列。

在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭膜，摇床上孵育1小时。1小时后，将膜与一抗在推荐稀释比例下，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液进行孵育。在一张膜上使用针对目标蛋白ELAVL1的一抗。

在另一张膜上，使用对照蛋白的一抗进行孵育，该蛋白预期表达量不变，此处使用 PUM2。室温孵育一小时。移除每张膜上的抗体溶液，加入 TBST，孵育五分钟。

以该方法用 TBST 洗涤印迹膜三次。随后，向每张膜加入相应的 HRP 标记二抗，在室温下孵育一小时。一小时后，用 TBST 每次五分钟，共洗涤膜三次。

根据制造商说明书，将化学发光底物溶液加入印迹膜，然后在数字化学发光成像仪上对印迹膜进行成像。最后，使用适当的软件对目标蛋白和对照蛋白的斑点强度进行定量，并按照文本方案中所述分析结果。带有可筛选抗性标记的候选克隆通过菌落PCR进行筛选。

开始此操作时，先将单个菌落接种至新的96孔板中，并培养至100%汇合度，以制备细胞裂解液。移除其中一组克隆的培养基，将每孔中的细胞用30微升商品化DNA提取试剂盒中的提取缓冲液重悬，转移至洁净的1.5毫升微量离心管中。将溶液在96摄氏度加热15分钟，然后冷却至室温。

向每个微量离心管中加入 30 µL 稳定缓冲液，并充分混匀。通过菌落 PCR 鉴定野生型以及单等位或双等位突变株系时，应设计两组独立的 PCR 引物，分别用于扩增基于抗性盒成功或未成功整合情况下的同源臂区域。在每侧，使用一个结合于同源臂外侧的通用引物。

为了检测野生型等位基因，使用通用引物与相应的配对引物，后者应与跨越同源区域的内源序列互补。为了检测目标突变，使用通用引物与另一条配对引物，后者应与插入的抗性盒序列互补。针对每个待检测样本，配制如下反应体系：0.5 微升细胞裂解液、1.25 微升 10X KOD 缓冲液、0.75 微升 25 毫摩尔硫酸镁、1.25 微升 2 毫摩尔 dNTPs、0.375 微升正向引物、0.375 微升反向引物、0.25 微升 KOD 聚合酶以及 7.75 微升水。

使用以下条件进行PCR：95°C预变性2分钟，随后进行25个循环，每个循环包括95°C变性20秒、引物退火温度（熔解温度）10秒，以及70°C延伸（每千碱基20秒）。随后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用非同源末端连接介导的基因组编辑技术构建ELAVL1基因敲除细胞系，并进行点印迹免疫检测（dot immunoblot），分别使用ELAVL1和PUM2抗体进行探查。对于信号接近阴性对照的克隆，以“X”标记并排除于后续分析之外。

ELAVL1 信号较低的克隆进一步通过蛋白质印迹法进行检测。已确认的候选克隆以绿色表示，被排除的候选克隆以灰色表示。该图示按递增顺序显示了 ELAVL1 信号与对照蛋白信号的比值。

在大多数情况下，ELAVL1 相对信号最低的克隆群体被正确鉴定为敲除株。通过同源定向修复方法获得的候选克隆采用菌落 PCR 进行筛选，并通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物。图中显示的是使用跨越上游整合位点的引物（内源性内侧引物和敲除内侧引物）所得到的示例结果。

首先在亲本细胞和混合筛选细胞中对引物进行了验证。图中展示了24个独立候选克隆的结果，以及野生型、敲除型和单等位基因缺失克隆的预期条带模式。黑色箭头指示正确的扩增产物，星号标记双等位基因敲除克隆。

通过蛋白质印迹进一步验证了双等位基因突变株系。非同源末端连接利用单个Cas9切割和无需筛选标记的筛选方法，因此前期准备工作较少，通过点印迹筛选敲除克隆可快速判断基因敲除是否成功。基于PCR的筛选能够准确检测由同源定向修复产生的具有大片段基因组改变的正确候选克隆。

这些技术使分子生物学领域的研究人员能够简便高效地鉴定基因敲除，从而利用细胞系探索正常或异常的细胞过程。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离和鉴定由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑产生的单克隆基因敲除细胞系。