选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除
2017年6月16日
遗传操纵体细胞系的能力的最新进展对于基础和应用研究具有巨大的潜力。在这里，我们提出了CRISPR / Cas9在哺乳动物细胞系中产生敲除生产和筛选的两种方法，使用和不使用选择标记。
该程序的目标是分离和鉴定由两种类型的 CRIPSR/Cas9 介导的基因组编辑产生的克隆敲除细胞系。一种方法检测由非同源末端连接引起的蛋白质敲除，而另一种方法检测由同源定向修复产生的基因组扰动。这种方法在分子生物学领域特别有用，其中产生具有遗传扰动的细胞系是解剖基因功能的重要工具。
该技术的主要优点是它是一种快速且相对高通量的方法，可以使用基本的分子生物学技术轻松执行。非同源末端连接引入小缺失或插入，并通过斑点免疫印迹进行评估，而同源定向修复允许更大、更精确的扰动，并通过菌落 PCR 进行评估。本实验使用在 DMEM 培养基中培养的 T-REx-293 细胞，补充 10% FBS （37°C） 和 5% 二氧化碳。
在横流之前，将细胞接种到 6 个孔板上，并包括一个用于未横流对照的孔。将细胞生长至约 70% 汇合。使用商业 Transvection 方案用 2.5 μg 总质粒对细胞进行横切。
对于不进行选择的细胞横剖，使用 2.5 μg Cas9-sgRNA 质粒。对于筛选细胞的横剖，使用 0.75 μg Cas9-sgRNA1、0.75 μg Cas9-sgRNA2 和 1 μg 同源重组模板。将 transvecd 细胞和未 transvecd 的对照在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。
对于通过筛选进行转切的细胞，通过用适当的药物（在本例中为 Neomycin）处理细胞来开始药物筛选。将六孔板放回培养箱中。每天观察一次处理过的细胞，以检查细胞死亡率，直到未转运对照中的所有细胞都死亡。
为了分离克隆群，首先在选择后将细胞在原始孔中培养至 100% 汇合。接下来对细胞进行连续稀释并计数细胞。由于正确生成单克隆集落是获得完全敲除的关键，因此必须注意确定以所需密度放置细胞的正确稀释度。
确定正确的稀释度后，将细胞以每孔 0.33 个细胞的密度放入 96 孔板中。放置三个 96 = 孔板是确保分离多个正确克隆的良好起点。在两到四个星期的时间内，观察菌落，直到肉眼可以看到菌落。
这些代表性图像显示了处于不同生长阶段的菌落。坐姿时为单个细胞，第 5 天为细胞，第 10 天为成熟集落。使用无菌移液器吸头，小心、精确地挑选可见的菌落，并重新放置在新孔中以促进单层生长。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下继续培养细胞。通过斑点免疫印迹筛选未经选择的基因敲除候选者，以高通量方式评估蛋白质产物。在将单个克隆培养至 50% 至 100% 汇合后，通过在孔内移液来去除单层细胞。
将每个孔中 100 微升总体积中的 90 微升分装到干净的微量离心管中。在本视频中，将仅处理两个样本。以 6， 000 RPM 离心 5 分钟，去除培养基，并在 10 μL 1X SDS 上样缓冲液中裂解细胞托盘。
向孔中的其余细胞中加入 90 μL 新培养基，然后将板放回培养箱中以继续增殖细胞。将 1 微升细胞裂解物移液到干燥的硝酸纤维素膜上，形成一个点。在两个单独的膜上印迹每个样品两次，产生两种相同的样品模式。
在室温下，将膜封闭在 5% 牛奶中的 TBST 中，摇动 1 小时。1 小时后，用推荐一抗稀释度的一抗和 TBST 加 5% 牛奶吸干膜。在一个膜上使用针对靶蛋白的一抗，在本实验中为ELAVL1
。在另一层膜上，将一抗用于预计不会发生变化的对照蛋白，此处使用 PUM2。在室温下孵育 1 小时。从每个印迹中取出一抗溶液，加入 TBST，孵育 5 分钟。
以这种方式，用 TBST 洗涤印迹 3 次。接下来，向每个膜中加入适当的 HRP 偶联二抗，并在室温下印迹 1 小时。1 小时后，用 TBST 清洗膜 3 次，每次 5 分钟。
按照制造商的说明将化学发光底物溶液涂在印迹上，并在数字化学发光成像仪上对印迹膜进行成像。最后，使用适当的软件量化靶蛋白和对照蛋白的点强度，并按照文本方案中的说明分析结果。具有可选抗性标记物的候选物通过菌落 PCR 进行筛选。
通过在新的 96 孔板中复制单个集落，并将它们培养至 100% 汇合以制备细胞裂解物来开始此过程。从一组克隆中取出培养基，将每个孔中的细胞重悬于市售 DNA 制备试剂盒的 30 μL 提取缓冲液中，然后转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中。将溶液加热至 96 摄氏度 15 分钟，然后冷却至室温。
向每个微量离心管中加入 30 微升稳定缓冲液并充分混合。为了通过集落 PCR 鉴定野生型和单等位基因或双等位基因突变系，设计两组单独的 PCR 引物，以根据抗性盒的成功或失败整合来扩增同源臂周围的区域。在每一侧，使用在同源臂外退火的通用引物。
要测试野生型等位基因，请使用公共引物和相应的配对引物，该引物与跨越同源区域的内源序列互补。为了测试所需的突变，将共同引物与另一个配对引物一起使用，与插入的抗性盒互补。对于每个待测样品，制备含有以下物质的反应混合物：0.5 μL 细胞裂解物、1.25 μL 10X KOD 缓冲液、0.75 μL 25 毫摩尔硫酸镁、1.25 μL 2 毫摩尔 dNTP、0.375 μL 正向引物、0.375 μL 反向引物、0.25 μL KOD 聚合酶和 7.75 μL 水。
使用以下条件进行 PCR：95 摄氏度 2 分钟，然后 25 个 95 摄氏度循环 20 秒，引物熔解温度 10 秒，70 摄氏度 20 秒/KB。随后，通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物。使用非同源末端连接进行基因组编辑以生成 ELAVL1 敲除细胞系，然后进行点免疫印迹，探测 ELAVL1 和 PUM2。显示较少对照信号的克隆用 X 标记，并被排除在进一步分析之外。
通过 western blot 进一步检测具有低 ELAVL1 信号的克隆。已确认的候选项以绿色表示，无效的候选项以灰色表示。该图显示了 ELAVL1 与控制蛋白质信号的比率，按升序排列。
在大多数情况下，具有最低相对 ELAVL1 信号的克隆群体被正确识别为敲除。通过集落 PCR 筛选由同源定向修复方法生成的候选物，并通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物。显示了使用跨越上游整合液络部的引物、使用内源性引物和引物内部敲除的引物的示例结果。
引物首先在亲代细胞和批量选择细胞中进行了验证。显示了 24 个单独候选克隆的结果以及野生型、敲除和单等位基因缺失克隆的预期条带模式。黑色箭头表示正确的扩增产物，星号表示双等位基因敲除克隆。
双等位基因突变系通过 western blot 进一步验证。非同源末端连接使用单个 Cas9 切割和不依赖选择筛选，因此几乎不需要前期准备，并且通过斑点印迹筛选敲除克隆可以快速确定基因敲除生成是否成功。基于 PCR 的筛选可准确检测具有同源定向修复产生的大基因组扰动的正确候选基因。
这些技术使分子生物学研究人员能够轻松有效地识别敲除，使他们能够使用细胞系探索正常或功能失调的细胞过程。观看此视频后，您应该对如何分离和识别由 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑产生的克隆敲除细胞系有很好的了解。
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概述
n本文讨论了在哺乳动物细胞中产生和筛选CRISPR/Cas9介导的敲除细胞系的两种方法。这些方法主要集中于通过非同源末端连接和基因组重排检测蛋白质敲除。
nn关键研究组成部分
n科学领域
n- 分子生物学
- 基因工程
- 细胞系开发
背景
n- CRISPR/Cas9是一种强大的基因组编辑工具。
- 敲除细胞系对于研究基因功能至关重要。
- 本研究探索了基因组编辑的两种方法。
- 非同源末端连接和同源重组是关键机制。
研究目的
n- 分离克隆敲除细胞系。
- 比较两种CRISPR/Cas9编辑方法。
- 提高生成基因改造细胞系的效率。
使用的方法
n- n
- 通过点免疫印迹评估非同源末端连接。 n
- 通过菌落PCR评估同源重组。 n
- 使用在DMEM培养基中培养的T-REx-293细胞。 n
- 细胞在37摄氏度和5%二氧化碳环境下维持。 n
主要结果
n- n
- 成功使用两种方法生成敲除细胞系。 n
- 非同源末端连接导致了小的缺失或插入。 n
- 同源重组允许更大、更精确的基因变化。 n
- 两种方法都被证明是高效和高通量的。 n
结论
n- n
- CRISPR/Cas9技术在生成敲除细胞系方面是有效的。
- 两种方法在不同应用中有各自的优势。
- 本研究为未来的基因操作研究提供了一个框架。 n
常见问题
nExecutive Industry Relevance
Efficient generation and validation of CRISPR/Cas9-mediated knockout cell lines is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This dual approach—combining selection-independent and selection-dependent workflows—enables rapid, scalable interrogation of gene function and supports robust portfolio triage. High-throughput screening and precise genomic editing streamline the transition from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic disruption of candidate genes to clarify biological pathways and validate therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by confirming loss-of-function at the protein and genomic levels.
- Facilitates predictive confidence in target selection by distinguishing true knockouts from partial edits.
Screening & Assay Development
- Prepares validated knockout cell lines for downstream phenotypic or biochemical assays.
- Standardizes screening outputs via dot immunoblot and colony PCR, ensuring reproducibility and scalability.
- Enables high-throughput identification of clonal lines suitable for compound evaluation and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant knockout models for preclinical validation when aligned with translational biomarkers.
- Ensures continuity from gene editing in discovery to functional assessment in preclinical systems.
- Reduces biological risk by confirming genotype-phenotype relationships before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This dual CRISPR/Cas9 knockout workflow bridges early discovery and preclinical research, supporting both hypothesis testing and model generation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene disruption and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for rapid clone selection and validation.
- Analytics: Provides protein-level and genomic readouts for robust comparison of editing outcomes.
- Translational Research: Lays the groundwork for disease-relevant model development when integrated with biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for iterative gene editing across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of knockout generation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program model deployment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and immunoblot or PCR analysis.
- Demands access to standard cell culture, imaging, and molecular biology instrumentation.
- Benefits from cross-team standardization of screening and validation protocols.
- Adaptable to various mammalian cell lines with protocol optimization.
- Dependent on robust antibody and primer validation for accurate screening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:40
Conclusion
8:59
Results: Knockout Cell Lines Generated by Two CRISPER/Cas9 Methods
2:31
Isolation of Clonal Populations
0:57
Transfection of CRISPER Component into Cultured Cells and Drug Selection
3:53
Screening Candidates by Dot Blot
6:30
Screening Candidates by Colony PCR
