Name: 选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学习CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除技术，通过非同源末端连接和同源定向修复两种方法分离克隆敲除细胞系。该方法利用点免疫印迹和菌落PCR进行高通量筛选，为分子生物学研究提供快速高效的基因功能分析工具。

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作者谨此感谢 Gissell Sanchez、Megan Lee 和 Jason Estep 提供实验协助，并感谢 Weifeng Gu 和 Xuemei Chen 分享试剂。

1. 确定目标缺失区域周围的同源区段
注意：仅在使用基于选择的编辑时需要。
<ol>
	<li>选择目标缺失位点两侧的两个区域，初始长度为1.5–2 kb，作为HDR模板中的同源臂（图1A）。应选择在任一链上均不含BsaI识别位点（GGTCTC）的区域，以方便克隆。若无法避免BsaI位点，可使用其他IIs型限制性内切酶（如BsmBI、SapI、BbsI），并相应修改受体质粒（pUC19-BsaI）、抗性标记供体质粒（pGolden-Neo或pGolden-Hygro）以及同源臂PCR产物突出端中的对应位点。</li>
</ol>
2. Cas9-sgRNA 表达质粒的构建
<ol>
	<li>确定用于诱变的靶向位点。对于单切口、无筛选标记的方法，应靶向靠近5'端的编码外显子，以提高产生非功能性突变的概率。对于双切口方法，应选择两个位点，使其跨越尽可能多的基因区域。 
	注意：根据我们的经验，可高效构建长达53 kb的缺失。</li>
	<li>将靶向区域约200至300 bp的序列输入crispr.mit.edu设计工具。对于基于筛选的克隆，使用位于缺失位点附近、已鉴定出的同源区域的200–300 bp序列（图1A）。针对每个靶向区域，选择2–3个评分最高的sgRNA，以兼顾不同sgRNA活性的差异，并获得不具有相同潜在脱靶效应的独立克隆。</li>
	<li>为设计适用于插入表达质粒且具有适当突出端的双链寡核苷酸，需从sgRNA序列中去除PAM序列（NGG），并在正义链寡核苷酸的5'端添加CACC突出端，并在其后加上一个G。对于反义链寡核苷酸，则将5'-AAAC突出端添加至靶序列的反向互补序列的5'端，随后在3'端加上一个C，如下图所示： 
	<img alt="基因编辑序列比对；sgRNA、TS、BS链；CRISPR过程示意图" src="/files/ftp_upload/55903/55903seq01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="序列1"></li>
	<li>按照Zhang实验室方案29所述，通过Golden Gate克隆方法28将对应sgRNA的合成寡核苷酸插入pSpCas9(BB)质粒中。</li>
</ol>
3. 同源定向修复模板质粒的构建
注意：仅在使用基于筛选的编辑时需要。同源定向修复模板质粒包含一个药物抗性表达盒，其两侧为两个与基因组上sgRNA靶位点外侧区域互补的序列（图1B）。
<ol>
	<li>从步骤1.1中确定的更广泛的同源区域中，选取800-1,000 bp26 距离设计的 Cas9 切割位点不超过 5-10 bp，用作同源臂（图1A）。务必确保同源臂中不包含sgRNA靶位点及其PAM序列，否则将导致CRISPR/Cas9对模板质粒自身的切割。如果同源臂内含有内源性BsaI位点，请选用其他sgRNA靶位点。</li>
	<li>使用高保真DNA聚合酶，按照制造商说明书，从基因组DNA中PCR扩增同源臂。上下游引物需在5'端额外添加序列，以引入BsaI酶切位点（GGTCTC）及位于同源区域两端的特异性突出末端。这些突出末端必须包含适当的序列，以确保后续正确组装顺序和方向，如下所述（图1B): 
	左侧同源臂FP突出端：5' GGGTCTCAGGCC 
	左侧同源臂RP突出端：5' GGGTCTCTCACG 
	右侧同源臂FP突出端：5' GGGTCTCAGTCC 
	右侧同源臂RP突出端：5' GGGTCTCT加拿大实验动物管理委员会</li>
	<li>通过凝胶电泳检测同源臂是否扩增正确，然后再继续后续操作。</li>
	<li>通过Golden Gate克隆将左右同源臂区域与抗性表达盒组装到HDR模板质粒中28使用 pGolden-Neo 或 pGolden-Hygro 质粒30 作为带有loxP位点侧翼的抗性盒（loxP-PGK-Neo-pA-loxP 或 loxP-PGK-Hyg-pA-loxP）的来源。使用pUC19-BsaI作为受体载体，该载体为经修饰的pUC19，其多克隆区域含有BsaI位点，其他位置的BsaI位点已被消除（可应要求提供）。三种插入片段与载体的使用比例为1:1:1:1。
	<ol>
		<li>配制以下反应混合物30:
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>右侧同源臂PCR产物</td>
					<td>0.06 pmol（30-40 ng）</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>左同源臂PCR产物</td>
					<td>0.06 pmol（30-40 ng）</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>pGolden-Neo 质粒（100 ng/µL)</td>
					<td>1 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>pUC19-BsaI 质粒（100 ng/μL）µL)</td>
					<td>1 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>2x T7 DNA连接酶缓冲液</td>
					<td>5 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>BsaI（10 U/μL）µL)</td>
					<td>0.75 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>T7 DNA连接酶（3000 U/μL）µL)</td>
					<td>0.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>水</td>
					<td>高达 10 µL</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>使用以下热循环仪参数： 37 °C 5 分钟， 20 °C 5分钟。重复30个循环。</li>
		<li>按照制造商说明书，用外切核酸酶处理克隆产物，以降解任何残留的线性化DNA。</li>
		<li>将反应混合物转化至感受态细胞中 E. coli 按照细胞附带的说明书进行菌株培养，并接种于含氨苄青霉素的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为鉴定含有正确模板组装的克隆，进行细菌菌落PCR以扩增组装插入片段的同源臂亚区（因为整个插入片段可能过大而难以可靠扩增）。使用一条与质粒侧翼序列退火的引物和另一条与抗性盒边缘互补的引物图1B，该序列在Neo和Hygro插入片段中均存在），产生一个依赖于组装的产物，其长度比包含的同源臂长约200 bp： 
	pUC19-Bsal-Left：5' GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG 
	抗性-左侧：5' AAAAGCGCCTCCCCTACCC 
	pUC19-BsaI-Right：5' GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA 
	抗性-右：5' AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
	<ol>
		<li>用无菌牙签挑取细菌菌落，并将细菌悬浮于 20 µL 水。加热至 95 °C 15分钟，然后在台式离心机中以最大速度离心5分钟。立即置于冰上。</li>
		<li>配制以下 PCR 混合液31:
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>稀释菌落模板</td>
					<td>1.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>10x Taq反应缓冲液</td>
					<td>1.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20 mM dNTPs</td>
					<td>0.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>10 µM 上游引物 </td>
					<td>0.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>10 µM 反向引物 </td>
					<td>0.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Taq 聚合酶</td>
					<td>0.25 µL</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>水 </td>
					<td>9 µL</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>使用以下热循环仪参数： 95 °C 30 秒，（95 °C 30 s 61 °C 30 秒 72 °C 1 分钟/千碱基），重复 25 个循环， 72 °C 2 分钟。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的扩增片段大小是否正确。</li>
		<li>可选地，从具有正确插入片段大小的单个菌落中提取质粒DNA小量制备物，并使用上述提及的扩增引物通过Sanger测序对同源臂区域进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将CRISPR组分转染至培养细胞
<ol>
	<li>转染前：将 T-REx293 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，置于 37 °C、5% CO2 条件下。</li>
	<li>将细胞接种至 6 孔板中，培养至约 70% 汇合度。设置一个未转染对照孔。</li>
	<li>使用商业转染试剂盒，按照其操作流程，用总共 2.5 µg 质粒转染细胞。同时平行培养未转染对照组。 
	注意：转染方法和效率因细胞类型而异。实验前应确定适用于该系统的最佳转染方法。
	<ol>
		<li>对于需要筛选的细胞转染，使用 0.75 µg Cas9-sgRNA 1（左侧切割）、0.75 µg Cas9-sgRNA 2（右侧切割）和 1.0 µg 同源重组模板。</li>
		<li>对于无需筛选的细胞转染，使用 2.5 µg Cas9-sgRNA 质粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 药物筛选
<ol>
	<li>转染后48小时，用适当的药物（新霉素/潮霉素）处理细胞。持续筛选，直至未转染的对照组细胞全部死亡（新霉素通常为3-5天，潮霉素为7-14天）。 
	注意：对于T-REx293细胞，建议新霉素和潮霉素的使用浓度分别为500 µg/mL和10 µg/mL。对于其他类型的细胞，建议先在未转染细胞上进行药物浓度梯度实验，以确定有效浓度。</li>
</ol>
6. 克隆群体的分离
<ol>
	<li>筛选后，在原始孔中将细胞培养至100%汇合度。以每孔0.33个细胞的密度将细胞接种至96孔板中。 
	注意：接种三块96孔板是确保获得多个正确克隆的良好起始点，但具体所需板数可能因sgRNA和HDR效率的不同而有所增减。</li>
	<li>在2至4周内观察细胞集落，直至肉眼可见集落形成。使用无菌移液器吸头挑取可见集落，并重新接种至新孔中以促进单层生长。当使用悬浮细胞时，可采用更低的接种密度，以确保更高比例的单克隆孔。</li>
</ol>
7. 候选样本筛选
<ol>
	<li>不使用筛选的压力筛选候选克隆：点印迹
	<ol>
		<li>将单个克隆培养至50-100%汇合度。通过在孔内吹打使细胞单层脱落。</li>
		<li>等分试样 90 µL 的 100 µL 总体积转移至洁净的微量离心管中。以6000 rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀在 10 µL 1×裂解缓冲液或1×SDS上样缓冲液（5×：250 mM Tris-Cl pH 6.8，8% SDS，0.1%溴酚蓝，40%甘油，100 mM DTT）。加入 90 µL 向孔中剩余细胞添加新鲜培养基以继续培养。</li>
		<li>移液器 1 µL 将细胞裂解液点样至干燥的硝酸纤维素膜上，形成斑点。每个样本在两张不同的膜上各点样两次，形成两组相同的样本排列。</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tris缓冲盐水 + 0.01% Tween 20：8 g NaCl，0.2 g KCl，3 g Tris碱，加蒸馏水至1 L，pH 7.4）封闭膜31 室温下孵育1小时（此处及后续步骤均需摇动）。</li>
		<li>使用针对目标蛋白的一抗对一张膜进行印迹，同时使用对照蛋白（如微管蛋白、GAPDH 或其他表达量预期不变的蛋白）的一抗对另一张膜进行印迹。采用推荐的一抗稀释比例（0.2 µg/mL ELAVL1 和 0.1 µg/mL 在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭Pum2（以Pum2为例），室温孵育1小时。</li>
		<li>用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释的相应HRP标记二抗孵育每张膜1小时。</li>
		<li>用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>按照制造商说明加入化学发光底物溶液（见材料表），并在数字化学发光成像仪上对印迹膜进行成像。</li>
		<li>使用适当的软件对目标蛋白和对照蛋白的点状信号强度进行定量分析。</li>
		<li>剔除对照蛋白信号较低的候选样本，对剩余候选样本计算目标蛋白与对照蛋白信号强度的背景校正后比值。选择比值最低的候选样本进行传代，并通过蛋白质印迹进一步验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用筛选：菌落PCR筛选候选克隆
	<ol>
		<li>使用DNA提取试剂盒收集细胞裂解液（参见 材料表).
		<ol>
			<li>在新的96孔板中重复接种单个菌落，并培养至100%汇合。</li>
			<li>从一组克隆中移除培养基，并将细胞重悬于 30 µL 从试剂盒中提取缓冲液，转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。</li>
			<li>将溶液加热至 96 °C 15 分钟，然后冷却至室温。</li>
			<li>添加 30 µL 来自试剂盒的稳定缓冲液。充分混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过菌落PCR鉴定野生型及单等位/双等位突变株系。
		<ol>
			<li>设计两套独立的PCR引物（分别对应目标位点的左侧和右侧），用于扩增抗性盒成功或未成功整合情况下同源臂周围的区域图2C）。在两侧使用一种通用引物（红色），该引物与同源臂外侧区域退火。将此通用引物与一对相应的特异性引物之一联合使用，其中该特异性引物互补于内源序列并跨越同源区域（蓝色），用于检测野生型等位基因。使用另一对互补于插入的抗性盒（见第2.3节中的引物）的配对引物，用于检测目标突变。</li>
			<li>（推荐）使用最初选定的bulk细胞群体的细胞裂解液来验证引物组，因为该裂解液将包含野生型和突变等位基因的混合物图2D).</li>
			<li>配制以下反应混合液：
			<table>
				<tbody>
					<tr>
						<td>细胞裂解液</td>
						<td>0.5 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10x KOD缓冲液</td>
						<td>1.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>25 mM MgSO₄</td>
						<td>0.75 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2 mM dNTPs </td>
						<td>1.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10 µM 上游引物 </td>
						<td>0.375 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>10 µM 反向引物</td>
						<td>0.375 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>KOD 聚合酶</td>
						<td>0.25 µL</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>水</td>
						<td>7.75 µL</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</li>
			<li>使用以下热循环仪程序条件： 95 °C 2 分钟，（95 °C 20 秒，引物 Tm 值 10 秒 70 °C 20 秒/千碱基）重复 25 个循环。</li>
			<li>通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对预测整合位点的两侧分别重复进行菌落PCR检测。筛选并扩增显示存在整合且在缺失区域无内源序列扩增产物的候选克隆。</li>
		<li>通过蛋白质印迹和/或逆转录定量聚合酶链式反应验证阳性候选样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 通过测序验证基因组突变
<ol>
	<li>通过苯酚-氯仿抽提法从突变细胞系中分离基因组DNA31。</li>
	<li>使用带有5'突出端的引物扩增sgRNA靶向区域，这些引物可在两端添加BsaI限制性酶切位点。 
	注意：对于通过HDR编辑的克隆，若两个等位基因可能相同，则可直接对PCR产物进行测序。</li>
	<li>通过Golden Gate克隆技术将扩增的片段插入pUC19-BsaI载体中。</li>
	<li>将反应混合物转化至感受态的E. coli菌株中。</li>
	<li>从6-10个单菌落中提取质粒DNA，并通过Sanger测序对克隆区域进行测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

CRISPR/Cas9 系统能够高效地实现稳定的基因组修饰，相较于其他瞬时操作方法，提供了更为一致的结果。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中快速鉴定 CRISPR/Cas9 基因敲除的方法。这两种方法所需细胞材料极少，因此可在克隆培养的早期阶段进行检测，节省时间和试剂。为提高两种方法的效率，我们建议同时测试多个 sgRNA，因为不同序列和基因组位置的编辑效率存在差异。此外，使用多个 sgRNA 有助于通过检测非靶向基因突变导致的异常表型，识别脱靶效应。高效的转染和 Cas9 切割将显著提高获得基因敲除的成功率。 alternatively，可直接将 commercially sourced sgRNA/Cas9 核糖核蛋白复合物转染入细胞32,33，该方法可能加快实验流程并降低脱靶效应。
点印迹法非常适合用于评估由NHEJ导致的小规模基因组改变所引起的蛋白敲除。由于仅需使用单一的sgRNA/Cas9构建体，该方法可能是获得无效细胞系的最快途径，且印迹步骤避免了额外操作...

稳定的遗传修饰相较于瞬时细胞扰动方法具有优势，因为后者在效率和持续时间上可能存在较大变异性。近年来，由于序列特异性核酸酶的开发，基因组编辑技术日益普及，例如锌指核酸酶1,2,3,4,5、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）6,7,8,9，以及源自成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统的RNA引导核酸酶10。
CRISPR/Cas9 基因编辑系统源自细菌和古菌用于抵御病毒感染的免疫系统11,12,13。在此过程中，入侵病毒序列的短片段（20–30 nt）被整合到基因组位点中，作为被重复单元侧翼包围的&#34;间隔序列&#34;14,15。随后的转录和RNA加工产生小的CRISPR相关RNA16（crRNA），其与反式激活crRNA17（tracrRNA）共同与效应蛋白Cas9内切酶结合形成复合物。crRNA由此赋予Cas9靶向特异性，引导该复合物切割互补的病毒DNA序列，从而防止进一步感染18,19。只要目标DNA中的任意&#34;前间隔序列&#34;直接位于短的前间隔序列邻近基序（PAM）的5'端，即可作为crRNA的来源；对于S. pyogenes Cas9而言，该PAM序列为NGG20。宿主CRISPR位点中间隔序列附近缺乏PAM序列，可区分自身与非自身DNA，从而避免对宿主基因组的错误靶向。由于其普适性和灵活性，该生物系统已被成功改造用于基因组编辑，几乎可以靶向任何邻近PAM的DNA位点。在此改造版本中，crRNA与tracrRNA进一步被融合为单个引导RNA（sgRNA）组分，并装载至Cas9蛋白中21。
在真核细胞中表达Cas9和一条sgRNA后，Cas9蛋白会在靶向位点切割DNA双链。在缺乏合适同源序列区域的情况下，细胞会通过非同源末端连接（NHEJ）22,23,24修复这一断裂，该过程通常引入小片段缺失，偶尔也会发生插入。当靶向开放阅读框时，这种修复很可能导致翻译移码，从而产生无功能的蛋白质产物。相反，若提供具有大片段同源区域的外源模板，细胞可能通过同源定向修复机制25,26来修复双链断裂。该途径可实现基因组中较大片段的精确删除、替换或插入，同时可引入可切除的选择标记27。
本文介绍了通过上述两种CRISPR/Cas9方法之一生成基因敲除细胞系的实验方案（图1A）。非同源末端连接（NHEJ）方法采用单个sgRNA切割位点，并进行无需筛选标记的独立筛选，因此前期准备工作较少。使用该方法时，需设计针对转录本5'端附近外显子区域的向导RNA，因为这些区域最有可能产生基因敲除效果。由于该方法对基因组的修饰较小，因此对敲除克隆的筛选依赖于点杂交（dot blot）方法，以高通量方式检测蛋白产物。本文以ELAV样1蛋白（ELAVL1）基因敲除细胞系的构建为例进行说明。第二种方法依赖同源定向修复（HDR），使用两个sgRNA切割位点，覆盖目标基因或区域，从而实现长达数十kb的片段删除。通过提供一个包含两个同源区域的质粒作为替换模板（图1B），这两个同源区位于切割位点两侧，可引入可筛选的抗性标记，从而提高基因敲除的效率。该方法也可通过合理设计同源臂，用于引入特定的基因修饰。在这种情况下，新DNA片段的整合使得基于PCR的筛选成为可能（图1C）。本文以Pumilio RNA结合家族成员2（PUM2）基因敲除细胞系的构建为例进行说明。

<table><tbody><tr><td>感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB) 质粒</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013，sgRNA 克隆</td></tr><tr><td>BbsI 酶</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013，sgRNA 克隆</td></tr><tr><td>T7 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013，sgRNA 克隆</td></tr><tr><td>Tango 缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>BY5</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013，sgRNA 克隆</td></tr><tr><td>PlasmidSafe 外切酶</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013，sgRNA 克隆</td></tr><tr><td>Q5 热启动高保真聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0494A</td><td>HA 扩增</td></tr><tr><td>pUC19-BsaI</td><td></td><td></td><td>经修饰的 pUC19 质粒，突变原有的 BsaI 位点，并在 BamHI/EcoRI 消化后插入两个方向相反的 BsaI 位点</td></tr><tr><td>pGolden-Neo</td><td>Addgene</td><td>51422</td><td>抗性筛选盒</td></tr><tr><td>pGolden-Hygro</td><td>Addgene</td><td>51423</td><td>抗性筛选盒</td></tr><tr><td>BsaI 酶</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>同源臂构建</td></tr><tr><td>T7 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe 外切酶</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td></td></tr><tr><td>牙签</td><td></td><td></td><td>细菌 PCR</td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td></td><td></td><td>细菌菌落 PCR</td></tr><tr><td>HEK293 人源细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（可选）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>BioLite</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI 转染试剂</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td>仅用于脂质体转染</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td>仅用于脂质体转染</td></tr><tr><td>G418（新霉素）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720-5G</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274-250MG</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>ThermoFisher</td><td>12556008</td><td></td></tr><tr><td>被动裂解缓冲液，5 倍浓度</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× SDS 上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>实验方案中描述的配方</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td></td><td></td><td>实验方案中描述的配方</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura 延长显色底物</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>用于 HRP 标记的二抗</td></tr><tr><td>PCR 用 Extracta DNA 提取试剂</td><td>Quantabio</td><td>95091-025</td><td></td></tr><tr><td>KOD 聚合酶</td><td>Novagen</td><td>71316</td><td></td></tr></tbody></table>

基于选择依赖性与非依赖性的crispr/cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：crispr/cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

CRISPR/Cas9 基因组编辑技术通过实现简便而精确的基因组修饰，彻底改变了生物学研究。Cas9 蛋白在单链向导 RNA（sgRNA）的引导下，可特异性地在目标基因位点切割双链 DNA。DNA 断裂可触发非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）两种修复机制。NHEJ 通常引入小片段的插入或缺失，导致移码突变；而 HDR 则可实现更大片段且更精确的基因修饰。本文介绍了两种结合经典 CRISPR/Cas9 方法并辅以下游筛选/选择策略的基因敲除细胞系构建方案。NHEJ 方法采用单个 sgRNA 切割位点，结合无需筛选标记的高通量点印迹免疫杂交法检测蛋白表达水平进行筛选。HDR 方法则利用两个 sgRNA 切割位点，覆盖目标基因区域，并结合提供的 HDR 修复模板，可实现长达数十 kb 的基因片段删除，同时插入可筛选的抗性标记以提高效率。文中还讨论了两种方法各自的适用场景与优势。

为建立ELAVL1基因敲除细胞系，由于存在可靠的抗体，因此采用单个sgRNA进行编辑（图1A，左侧）完成后，进行点印迹免疫检测。三个sgRNA分别独立转染，以比较编辑效率并排除所获克隆中的脱靶效应。收集单克隆细胞群体的裂解液，将其点样至两张硝酸纤维素膜上，随后分别用ELAVL1和PUM2（作为归一化对照）抗体进行杂交检测图2AELAVL1 与 PUM2 信号的定量比值显示出非常广泛的 &gt;104-倍范围，存在于分离的品系中（图2B）。以该比值作为筛选标准，我们通过ELAVL1的Western印迹验证了多条细胞系图3A）。在大多数情况下，ELAVL1 相对信号最低的克隆群体被正确鉴定为敲除样本（图2B），证实了该定量方法的预测能力（尽管对照信号存在较大变...

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

CRISPR/Cas9基因组编辑系统通过实现简便而精确的基因组编辑，彻底改变了生物学研究。该系统由单个向导……

本实验的目的是分离并鉴定通过两种CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方式产生的克隆敲除细胞系。其中一种方法用于检测由非同源末端连接引起的蛋白质敲除，另一种方法则用于检测由同源定向修复产生的基因组扰动。该方法在分子生物学领域尤为有用，因为在该领域中，构建具有基因组扰动的细胞系是解析基因功能的重要工具。该技术的主要优势在于它是一种快速且通量相对较高的方法，可利用基本的分子生物学技术轻松实施。非同源末端连接会引入小片段的缺失或插入，并通过点免疫印迹法进行检测；而同源定向修复则能够实现更大且更精确的基因修饰，并通过菌落PCR进行评估。本实验采用T-REx-293细胞，使用DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养，培养基中添加10% FBS。在转染之前，将细胞接种到6孔板中，并设置一个未转染的对照孔。将细胞培养至约70%汇合度。使用商业转染试剂盒，按照其转染方案，用2.5 µg总质粒对细胞进行转染。对于无需筛选的细胞转染，使用2.5微克Cas9-sgRNA质粒。对于需要筛选的细胞转染，使用0.75微克Cas9-sgRNA1、0.75微克Cas9-sgRNA2以及1微克同源重组模板。将转染后的细胞与未转染的对照细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育48小时。对于转染了筛选标记的细胞，使用适当的药物（本实验中为新霉素）处理细胞，开始药物筛选。将六孔板放回培养箱。每天观察一次经处理的细胞，检测细胞死亡速率，直至未转染的对照组中所有细胞死亡。为了分离单克隆群体，首先在筛选后将细胞在原始孔中培养至100%汇合度。接着对细胞进行连续稀释并计数。由于单克隆细胞集落的正确形成是获得完全敲除的关键，因此必须仔细确定合适的稀释比例，以使细胞以期望的密度接种。确定正确的稀释倍数后，将细胞以每孔0.33个细胞的密度接种到96孔板中。建议初始接种三块96孔板，以确保能够分离出不止一个正确的克隆。在2至4周内观察细胞克隆，直至克隆肉眼可见为止。这些代表性图像展示了不同生长阶段的克隆。分别为接种后的单个细胞、第5天的细胞以及第10天形成的良好克隆。使用无菌的移液器吸头，仔细而精确地挑取可见克隆，并将其重新接种至新的孔中，以促进单层细胞生长。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养细胞。通过点免疫印迹法对未经过筛选的敲除候选克隆进行高通量筛选，以评估其蛋白产物。当单个克隆生长至50%至100%汇合度时，通过在孔内吹打使细胞单层脱落。从每个孔的100微升总体积中分装出90微升至洁净的微量离心管中。本视频中仅处理两个样本。以6,000 RPM离心5分钟，弃去上清液，并在10微升1× SDS上样缓冲液中裂解细胞沉淀。向孔中剩余的细胞加入90微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱继续培养细胞。用移液器将1微升细胞裂解液点加到干燥的硝酸纤维素膜上形成点样。每个样本在两张独立的膜上各点样两次，形成两组相

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本方案描述了将多个单导向RNA克隆到一个导向RNA串联载体中的步骤，该方法特别适用于利用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。文中以肠道类器官中双基因敲除的构建为例，展示了该方法的一种可能应用。...

利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。...

利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。...

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

学习CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除技术，通过非同源末端连接和同源定向修复两种方法分离克隆敲除细胞系。该方法利用点免疫印迹和菌落PCR进行高通量筛选，为分子生物学研究提供快速高效的基因功能分析工具。

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

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