基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法 关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本实验的目的是分离并鉴定通过两种CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方式产生的克隆敲除细胞系。其中一种方法用于检测由非同源末端连接引起的蛋白质敲除，另一种方法则用于检测由同源定向修复产生的基因组扰动。该方法在分子生物学领域尤为有用，因为在该领域中，构建具有基因组扰动的细胞系是解析基因功能的重要工具。

该技术的主要优势在于它是一种快速且通量相对较高的方法，可利用基本的分子生物学技术轻松实施。非同源末端连接会引入小片段的缺失或插入，并通过点免疫印迹法进行检测；而同源定向修复则能够实现更大且更精确的基因修饰，并通过菌落PCR进行评估。本实验采用T-REx-293细胞，使用DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养，培养基中添加10% FBS。

在转染之前，将细胞接种到6孔板中，并设置一个未转染的对照孔。将细胞培养至约70%汇合度。使用商业转染试剂盒，按照其转染方案，用2.5 µg总质粒对细胞进行转染。

对于无需筛选的细胞转染，使用2.5微克Cas9-sgRNA质粒。对于需要筛选的细胞转染，使用0.75微克Cas9-sgRNA1、0.75微克Cas9-sgRNA2以及1微克同源重组模板。将转染后的细胞与未转染的对照细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育48小时。

对于转染了筛选标记的细胞，使用适当的药物（本实验中为新霉素）处理细胞，开始药物筛选。将六孔板放回培养箱。每天观察一次经处理的细胞，检测细胞死亡速率，直至未转染的对照组中所有细胞死亡。

为了分离单克隆群体，首先在筛选后将细胞在原始孔中培养至100%汇合度。接着对细胞进行连续稀释并计数。由于单克隆细胞集落的正确形成是获得完全敲除的关键，因此必须仔细确定合适的稀释比例，以使细胞以期望的密度接种。

确定正确的稀释倍数后，将细胞以每孔0.33个细胞的密度接种到96孔板中。建议初始接种三块96孔板，以确保能够分离出不止一个正确的克隆。在2至4周内观察细胞克隆，直至克隆肉眼可见为止。

这些代表性图像展示了不同生长阶段的克隆。分别为接种后的单个细胞、第5天的细胞以及第10天形成的良好克隆。使用无菌的移液器吸头，仔细而精确地挑取可见克隆，并将其重新接种至新的孔中，以促进单层细胞生长。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养细胞。通过点免疫印迹法对未经过筛选的敲除候选克隆进行高通量筛选，以评估其蛋白产物。当单个克隆生长至50%至100%汇合度时，通过在孔内吹打使细胞单层脱落。

从每个孔的100微升总体积中分装出90微升至洁净的微量离心管中。本视频中仅处理两个样本。以6,000 RPM离心5分钟，弃去上清液，并在10微升1× SDS上样缓冲液中裂解细胞沉淀。

向孔中剩余的细胞加入90微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱继续培养细胞。用移液器将1微升细胞裂解液点加到干燥的硝酸纤维素膜上形成点样。每个样本在两张独立的膜上各点样两次，形成两组相同的样本排列。

在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液振荡孵育膜1小时以封闭非特异性结合位点。1小时后，将膜与一抗在推荐稀释比例下，使用含5%脱脂奶粉的TBST溶液进行孵育。在其中一张膜上使用针对目标蛋白的抗体，本实验中为ELAVL1抗体。

在另一张膜上，使用对照蛋白的一抗，该蛋白预期表达量不会发生变化，此处使用 PUM2。室温孵育一小时。移除每张膜上的抗体溶液，加入 TBST，孵育五分钟。

以该方式用 TBST 洗涤印迹膜三次。随后，向每张膜中加入相应的 HRP 标记二抗，在室温下孵育一小时。一小时后，用 TBST 每次五分钟，共洗涤膜三次。

根据制造商说明书，将化学发光底物溶液加入印迹膜，然后在数字化学发光成像仪上对印迹膜进行成像。最后，使用适当的软件对目标蛋白和对照蛋白的斑点强度进行定量，并按照文本方案中所述分析结果。带有可筛选抗性标记的候选克隆通过菌落PCR进行筛选。

开始此操作时，先将单个菌落接种至新的96孔板中，培养至100%汇合，以制备细胞裂解液。移除其中一组克隆的培养基，将每孔中的细胞用30 µL商业DNA提取试剂盒提供的裂解缓冲液重悬，转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。将溶液在96 °C加热15分钟，随后冷却至室温。

向每个微量离心管中加入30微升稳定缓冲液，充分混匀。通过菌落PCR鉴定野生型及单等位或双等位突变株系时，设计两组独立的PCR引物，分别针对抗性盒成功或未成功整合情况下同源臂两侧区域进行扩增。在每侧，使用一个结合于同源臂外侧的通用引物。

为了检测野生型等位基因，使用通用引物与相应的配对引物，该配对引物互补于跨越同源区域的内源性序列。为了检测目标突变，使用通用引物与另一条配对引物，该引物互补于插入的抗性筛选盒序列。针对每个待测样本，配制如下反应体系：0.5 µL 细胞裂解液、1.25 µL 10X KOD 缓冲液、0.75 µL 25 mmol/L 硫酸镁、1.25 µL 2 mmol/L dNTPs、0.375 µL 正向引物、0.375 µL 反向引物、0.25 µL KOD 聚合酶以及 7.75 µL 水。

使用以下条件进行PCR：95°C预变性2分钟，随后进行25个循环，每个循环包括95°C变性20秒、引物退火温度（熔解温度）10秒，以及70°C延伸（每千碱基20秒）。随后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用非同源末端连接介导的基因组编辑技术构建ELAVL1基因敲除细胞系，并进行点免疫印迹实验，检测ELAVL1和PUM2蛋白表达。对显示微弱对照信号的克隆标记“X”，并排除于后续分析之外。

ELAVL1 信号较弱的克隆进一步通过蛋白质印迹法进行检测。已验证的候选克隆以绿色标示，未通过验证的候选克隆以灰色标示。该图示按递增顺序显示了 ELAVL1 与对照蛋白信号的比值。

在大多数情况下，ELAVL1 相对信号最低的克隆群体被正确鉴定为敲除株。通过同源定向修复方法获得的候选克隆采用菌落 PCR 进行筛选，并通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物。图中显示的是使用跨越上游整合位点的引物（内源性内侧引物与敲除内侧引物）所获得的示例结果。

首先在亲本细胞和混合筛选的细胞中对引物进行了验证。图中展示了24个独立候选克隆的结果，以及野生型、敲除型和单等位基因缺失克隆预期的条带模式。黑色箭头指示正确的扩增产物，星号标记双等位基因敲除克隆。

双等位基因突变株系通过蛋白质印迹进一步验证。非同源末端连接利用单个Cas9切割位点并进行无需筛选标记的筛选，因此前期准备工作较少，通过点印迹筛选敲除克隆可快速判断基因敲除是否成功。基于PCR的筛选能够准确检测由同源定向修复介导产生的具有较大基因组改变的正确候选克隆。

这些技术使分子生物学领域的研究人员能够简便高效地鉴定基因敲除，从而利用细胞系探索正常或异常的细胞过程。观看本视频后，您将充分了解如何分离和鉴定由CRISPR/Cas9介导的基因组编辑产生的单克隆基因敲除细胞系。