Name: 染色质免疫沉淀（ChIP）在小鼠T细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学习染色质免疫沉淀技术在小鼠T细胞系中的应用，通过聚焦超声破碎染色质并免疫沉淀特定抗体，研究组蛋白修饰在基因调控中的作用。该方法高效可重复，适用于免疫学和染色质生物学研究。

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我们感谢 P. Käse 和 T. Schmidt-Wöll 提供出色的技术支持。本工作得到了德国研究基金会（DFG）合作研究基金 TRR81 和海森堡计划（BO 1639/5-1）、马克斯·普朗克学会、弗莱堡 EXC 294 项目以及吉森心肺系统卓越集群（ECCPS）对 T.B. 的资助。

注意：本方案中使用的所有缓冲液和培养基均列于表1中。
第1天和第2天
1. 细胞交联
<ol>
	<li>将小鼠T细胞从6孔板转移至50 mL离心管中，在4 °C条件下以约271 × g离心5分钟。用IMDM细胞培养基重悬细胞沉淀，总体积为30 mL，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将20 × 106个细胞分装至新的50 mL离心管中。</li>
	<li>直接向细胞培养基中加入甲醛（FMA），使其终浓度为1%，室温孵育10分钟。 
	注意：甲醛若被吸入具有毒性，操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。此外，请按照所在机构的规定妥善处理甲醛废弃物。</li>
	<li>加入1/8体积的1 M甘氨酸（pH 7.0），室温孵育5分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以约271 × g离心5分钟收集细胞沉淀，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤细胞沉淀，转移至1.5 mL离心管中。</li>
</ol>
2. 细胞裂解与染色质剪切
<ol>
	<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL SDS 裂解缓冲液中，冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>将每个样品转移至超声破碎管中，按照表 2所示设置，使用聚焦式超声仪进行剪切。</li>
	<li>剪切完成后，将样品转移至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C、约 18,000 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>取 50 µL 用于根据步骤 3 测定剪切效率，并将剪切后的裂解液在液氮中速冻。将裂解液分装成单次使用量，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 剪切效率的测定
<ol>
	<li>向每份剪切后的裂解液（50 µL）中加入 50 µL 洗脱缓冲液，于 65 °C 摇床孵育过夜。</li>
	<li>向每个样品中加入 100 µL TE 缓冲液和 4 µL 的 10 mg/mL RNase A（终浓度为 0.2 µg/µL）。混匀后于 37 °C 摇床孵育 2 小时。</li>
	<li>向每个样品中加入 2 µL 的 20 mg/mL 蛋白酶 K（终浓度为 0.2 µg/µL），于 55 °C 摇床孵育 2 小时。</li>
	<li>将每个样品转移至适合苯酚/氯仿/异戊醇抽提的凝胶管中；按照制造商说明书操作。</li>
	<li>向每个样品中加入 200 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀。于 24 °C、约 16,000 × g 离心 5 分钟，将上层水相转移至新管中。 
	注意：苯酚、氯仿和异戊醇若被吸入具有毒性，且具有腐蚀性；操作时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。同时，苯酚、氯仿和异戊醇废液应按照所在机构的规定进行处理。
	<ol>
		<li>重复一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用纯化柱纯化 DNA，具体操作按照制造商说明书进行，但需进行以下修改：
	<ol>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤膜两次。最后一次洗涤后，将离心管敞口置于室温下 2 分钟，以挥发残留的乙醇。</li>
		<li>洗脱时，加入 50 µL H2O，室温孵育 1 分钟，短暂离心 1 秒使膜充分润湿，再于室温孵育 1 分钟，随后在 24 °C、约 17,900 × g 条件下离心 1 分钟以洗脱 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用高灵敏度试剂盒，按照制造商说明书在荧光计上定量纯化的 DNA。</li>
	<li>取约 500 ng 纯化后的 DNA 在 1.8% 琼脂糖凝胶上进行分析，另取约 1 ng 使用高灵敏度试剂盒在毛细管电泳系统上进行分析。 
	注：预期 DNA 片段大小应在 200 至 500 bp 之间。</li>
</ol>
第3天和第4天
4. 免疫沉淀
<ol>
	<li>将1体积的剪切裂解液与5体积的稀释缓冲液混合稀释。</li>
	<li>每毫升裂解液中加入30 µL蛋白A琼脂糖珠（按附录A方法制备），在4°C旋转孵育30分钟进行预清除。</li>
	<li>在4°C、约750 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>取10%的输入样品，置于4°C保存。</li>
	<li>将所需量的裂解液分装至新的离心管中（详见表3），向每管中加入相应的抗体（详见表3），4°C旋转孵育过夜。</li>
	<li>每管加入40 µL蛋白A琼脂糖珠，4°C旋转孵育1小时。</li>
	<li>依次用1 mL低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl缓冲液和TE缓冲液洗涤珠子（每次洗涤均在4°C旋转孵育5分钟，然后在4°C、约950 × g条件下离心3分钟）。具体操作详见表3。</li>
	<li>加入110 µL洗脱缓冲液，室温孵育15分钟，每2分钟涡旋振荡一次。</li>
	<li>在4°C、约950 × g条件下离心3分钟，将100 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>用100 µL洗脱缓冲液重复步骤4.7–4.8，合并洗脱液。向样品中补加洗脱缓冲液至总体积为200 µL。</li>
	<li>所有样品在65°C振荡孵育过夜。</li>
</ol>
第5天
5. DNA 纯化
<ol>
	<li>向每个洗脱液中加入 200 µL TE 缓冲液和 8 µL 10 mg/mL 的 RNase A（终浓度为 0.2 µg/µL）。混匀后在 37 °C 下振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>向每个洗脱液中加入 4 µL 20 mg/mL 的蛋白酶 K（终浓度为 0.2 µg/µL），在 55 °C 下振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>将每个样品转移至适合进行苯酚/氯仿/异戊醇抽提的凝胶管中；按照制造商说明书操作。</li>
	<li>向每个管中加入 400 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀。在 24 °C 下以约 16,000 × g 离心 5 分钟，将上层液体转移至新管中。 
	注意：苯酚、氯仿和异戊醇若被吸入具有毒性，且具有腐蚀性；操作时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。同时，苯酚、氯仿和异戊醇废液应按照所在机构的规定进行处理。
	<ol>
		<li>重复一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书使用纯化柱纯化 DNA，但需进行以下修改：</li>
	<li>用洗涤缓冲液清洗膜两次。最后一次洗涤后，在室温下将管子开盖放置 2 分钟，以挥发残留的乙醇。</li>
	<li>洗脱时，加入 50 µL H2O，在室温下孵育 1 分钟，短暂离心 1 秒使膜充分润湿，再于室温孵育 1 分钟，然后在 24 °C 下以约 17,900 × g 离心 1 分钟以洗脱 DNA。</li>
</ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li>
<li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li>
<li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li>
<li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li>
<li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905(2015).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li>
<li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li>
<li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li>
<li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li>
<li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li>
<li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+chromatin+research%3A+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).</li>
<li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li>
<li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li>
<li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
<li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li>
<li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有效的技术，用于研究蛋白质或其翻译后修饰（PTMs）是否在特定基因组区域富集。由于生物学或技术原因，ChIP实验结果通常难以解释。生物学原因多种多样，包括蛋白质与DNA的结合较弱或为间接结合。技术上的局限性也存在，例如抗体特异性不足、细胞裂解不充分或染色质剪切效率低下。一份故障排除指南（表5）可帮助读者解决ChIP实验中可能遇到的问题。
本方案利用冷却型聚焦超声波破碎仪，可高效剪切成熟小鼠T细胞系的染色质。方案中的主要关键步骤是染色质的剪切，该步骤必须针对每种细胞类型进行优化。建议调整细胞数量和超声循环次数。此外，样品中十二烷基硫酸钠（SDS）沉淀物的存在会负面影响剪切效率，这些沉淀物可能在冰上使用SDS裂解缓冲液裂解细胞时形成。在此情况下，最佳做法是在裂解后将样品于室温孵育数分钟，以减少SDS沉淀物的产生。建议优化实验条件，使剪切后的片段长度在200至500 bp之间，并在进行免疫沉淀之前始终评估样品的剪切质量。此外，交联时间、抗体用量和/或细胞数量以及洗涤条件均需针对每种抗体进行优化。
在成功进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的过程中，另一个关键步骤是抗体的选择，因为特异性较低的抗体会显著降低免疫沉淀的效率。此前，一种统一的质量检测流程已被用于评估市场上多种抗体的特异性19。该筛选流程基于点印迹（dot blot）、蛋白质印迹（Western blot）和ChIP实验，从而提供了一份适用于ChIP实验的高质量试剂清单19。最近，研究人员利用高密度组蛋白肽段微阵列平台评估了多种市售抗体的特异性，建立了抗体特异性数据库20。读者可利用这一实用工具，筛选出最适合用于ChIP实验的高特异性抗体。
本方案尚未在原代T细胞中进行测试，因此，读者应参考其他已成功用于原代T细胞ChIP的已发表方案3,4,21。值得注意的是，本方案已成功应用于小鼠前体T细胞系以及小鼠内皮细胞系的ChIP实验。
每项组蛋白修饰分析的染色质免疫沉淀实验应使用 5 × 106 个细胞。由于本实验方案经过适当优化后也可适用于转录因子或共调节因子的 ChIP 实验，因此在这些情况下最好增加免疫沉淀所用的细胞数量。为了达到每次实验所需的细胞数量，可在将染色质稀释于稀释缓冲液之前，将多个剪切后裂解液的等分试样合并在一起。
该方案也可经修改后用于对不直接与DNA结合的内源性蛋白质进行ChIP实验。在此情况下，可能需要使用蛋白质-蛋白质交联剂（例如，己二酰亚胺二甲酯，DMA）进行预固定（更多信息请参见附录B）。此前已有通过过表达与生物素标签融合的蛋白质，成功对辅因子进行ChIP的报道。在此类实验中，使用链霉亲和素偶联的磁珠纯化目标蛋白，并进行DMA预固定22。

发育、分化和稳态依赖于特定的基因表达程序，这些程序由信号事件建立，信号事件可调节染色质结构，从而以细胞类型和时间特异性的方式决定特定基因的激活或抑制。在T细胞发育过程中，必须建立特定的基因表达程序，以精确调控T细胞前体从双阴性（DN）阶段向单阳性（SP）阶段的成熟，其间经历多个中间阶段1。近年来，多个实验室已广泛研究了T细胞发育过程中基因表达程序的动态调控机制2,3,4,5,6。
通过组蛋白的翻译后修饰（PTMs）、经典组蛋白与组蛋白变体的置换、核小体的移除以及DNA甲基化，可调控基因的开启与关闭。多个研究团队已探究了PTMs和组蛋白变体在全基因组范围内的分布，以确定在近端和远端调控区域与不同染色质状态相关的标记7,8,9,10。信号级联通过在特定增强子元件上交换激活性和抑制性染色质修饰酶（也称为染色质修饰因子），协调动态的染色质调控。这些染色质修饰因子通过例如动态的组蛋白甲基化和乙酰化等机制，调控染色质结构，从而影响转录输出。Notch信号通路即是一个典型例子11,12,13,14。
通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，可以研究组蛋白动态翻译后修饰、组蛋白变体的交换，以及组蛋白、转录因子和共调节因子的动态占据情况。该方法利用高特异性抗体纯化特定的DNA-蛋白质复合物，随后通过定量PCR（qPCR）、深度测序（ChIP-Seq）或（如今较少使用的）与微阵列杂交（ChIP-ChIP）来分析所纯化的DNA。
由于细胞裂解、染色质剪切和/或抗体特异性较低等方面的问题，染色质免疫沉淀（ChIP）实验有时具有挑战性。已有多种策略被采用以优化该实验流程，NEXSON15 即为一例。使用冷水浴超声仪可避免样品过热，从而防止目标蛋白上表位的破坏，但超声能量会分散到水中，导致效率降低。另一项改进是开发了聚焦式超声破碎装置，可防止能量分散。因此，聚焦式超声设备能够改善细胞裂解和染色质剪切效果，消除操作者带来的变异，并显著提高实验的可重复性。
本研究描述了一种高效对一种名为 E2-10HA 的成熟小鼠 T 细胞系进行组蛋白染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案（示意图见图 1）16,17。T 细胞通常难以裂解，且其染色质剪切效率较低。本方案采用带冷却功能的聚焦超声破碎仪，针对 E2-10HA 小鼠 T 细胞系优化了细胞数量、裂解缓冲液及染色质剪切参数。该方案可实现高重复性的 ChIP 实验，并在合理的时间内完成。具体而言，染色质剪切及剪切质量评估约需两天时间，而免疫沉淀、逆转交联及 DNA 纯化则需三天时间。

<table><tbody><tr><td>Agilent 高灵敏度 D5000 试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA 系统</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>二甲基己二酰亚胺 (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基非必需氨基酸 (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 快速流</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨 primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>相锁凝胶 Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K 溶液 (20 mg/mL)，RNA 级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A，无 DNase 和蛋白酶 (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠t细胞系中的染色质免疫沉淀（chip）

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

信号通路通过在不同层次上调控染色质结构来调节基因表达程序，例如组蛋白尾部的翻译后修饰（PTMs）、经典组蛋白与组蛋白变体的交换以及核小体的移除。此类调控需要信号敏感型转录因子（TFs）结合到被称为增强子的调控元件上，并招募染色质修饰酶。要理解信号级联如何调控增强子活性，就需要全面分析转录因子、染色质修饰酶的结合情况，以及特定组蛋白修饰标记和组蛋白变体的占据状态。染色质免疫沉淀（ChIP）实验利用高度特异性的抗体来免疫沉淀特定的蛋白质/DNA复合物。随后对纯化的DNA进行分析，可鉴定出被抗体所识别蛋白占据的基因组区域。本文描述了一种在成熟小鼠T细胞系中高效进行组蛋白ChIP实验的方案。该方案可在合理的时间范围内完成ChIP实验，并具有高度的可重复性。

对成熟的小鼠T细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，以检测组蛋白3上赖氨酸4的单甲基化（H3K4me1）、组蛋白3上赖氨酸4的三甲基化（H3K4me3）以及组蛋白3上赖氨酸27的乙酰化（H3K27ac）的富集情况，同时通过panH3 ChIP检测核小体占位情况。图2A中的1.8%琼脂糖凝胶电泳和图2B中的电泳系统用于评估染色质剪切质量。H3K4me1和H3K4me3通常分别用于识别增强子区域和启动子区域（图3A）。事实上，H3K4me3在启动子区域显著富集，但并非仅限于启动子5,8,14。活性增强子的特征是H3K4me1和H3K27ac高度富集，而H3K4me3富集程度较低（图3A，上图）；相比之下，非活性增强子表现为H3K4me3和H3K27ac水平较低，而H3K4me1水平较高（图3A，下图）。如图3B所示，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（Gapdh）基因是活性基因启动子分析的代表性例子（Gapdh promoter），其表现出高水平的H3K4me3和H3K27ac，而H3K4me1水平较低。在图3B中，Deltex1（Dtx1）代表非活性增强子（Dtx1 enhancer），因其H3K4me1高度富集，而H3K4me3和H3K27ac富集程度较低。Gene desert代表缺乏编码基因的区域，通常作为活性染色质标记的阴性对照。观察到被广泛认可的增强子标记H3K4me14,5,7,14,18在Gene desert区域无富集，表明该区域缺乏增强子。
<img alt="染色质免疫沉淀流程图、DNA纯化、qPCR、琼脂糖凝胶分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：本文所述染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案的示意图概览。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳及强度图；DNA片段大小分离与分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：成熟小鼠T细胞系剪切质量控制。（A）对两份不同的成熟小鼠T细胞系E2-10HA样品进行剪切，取约500 ng纯化DNA在1.8%琼脂糖凝胶上进行分析，以评估其剪切质量。（B）对样品2中的1 ng纯化DNA进行电泳分析，以评估其剪切质量。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色质修饰示意图；H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac 水平；柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：表征增强子和启动子的染色质标记。（A）活性增强子（上图）的特征是 H3K4me1 水平高、H3K4me3 水平低、H3K27ac 水平高，而非活性增强子（下图）则表现为 H3K4me1 水平高、H3K4me3 水平低、H3K27ac 水平低。（B）将 图 2A 中所示样本合并后，用于针对组蛋白标记 H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac 以及组蛋白占位（通过 panH3 ChIP 检测）的 ChIP 分析。该分析显示，看家基因 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （Gapdh 启动子）的启动子区域富含 H3K4me3 和 H3K27ac，但 H3K4me1 富集程度较低。相反，非活性基因 Deltex1（Dtx1 增强子）的增强子区域 H3K4me1 富集程度高，而 H3K4me3 和 H3K27ac 富集程度低。使用 panH3 抗体进行 ChIP 实验以检测核小体占位情况。基因沙漠（gene desert）作为阴性对照。展示的是一个代表性实验结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液名称</td>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">稀释缓冲液</td>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>0.01% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>1.1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.1</td>
			<td>16.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>167 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DMA 溶液</td>
			<td>Dimethyl adipimidate (DMA)</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">洗脱缓冲液</td>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">高盐缓冲液</td>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.1</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">IMDM 培养基</td>
			<td>Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>2% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone primatone</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution human </td>
			<td>4.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">LiCl 盐缓冲液</td>
			<td>Lithium chloride (LiCl)</td>
			<td>0.25 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL-CA630</td>
			<td>1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.1</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">低盐缓冲液</td>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.1</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Protein A Sepharose 微珠洗涤缓冲液</td>
			<td>Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL-CA630</td>
			<td>1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">SDS 裂解缓冲液</td>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.1</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TE 缓冲液</td>
			<td>Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 8.0</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用缓冲液与培养基列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>开启</td>
			<td>关闭</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>峰值功率</td>
			<td>150.0</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>占空比</td>
			<td>15.0</td>
			<td>15.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每脉冲周期数</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>周期数</td>
			<td colspan="2">28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：本方案中使用的剪切参数。这些条件已针对成熟的小鼠T细胞系进行了优化。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>供应商</td>
			<td>每次免疫沉淀所用抗体的量</td>
			<td>每次免疫沉淀所用细胞数量</td>
			<td>洗涤条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3</td>
			<td>Abcam (ab1791)</td>
			<td>2.5 mg</td>
			<td>5 x 106</td>
			<td>低盐缓冲液中洗涤一次，高盐缓冲液中洗涤两次，LiCl 盐缓冲液中洗涤两次，TE 缓冲液中洗涤三次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me1</td>
			<td>Abcam (ab8895)</td>
			<td>2.5 mg</td>
			<td>5 x 106</td>
			<td>低盐缓冲液中洗涤一次，高盐缓冲液中洗涤两次，LiCl 盐缓冲液中洗涤两次，TE 缓冲液中洗涤三次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3</td>
			<td>Diagenode (pAb-003-050)</td>
			<td>2.5 mg</td>
			<td>5 x 106</td>
			<td>低盐缓冲液中洗涤一次，高盐缓冲液中洗涤两次，LiCl 盐缓冲液中洗涤两次，TE 缓冲液中洗涤三次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac</td>
			<td>Diagenode (pAb-174-050)</td>
			<td>2.5 mg</td>
			<td>5 x 106</td>
			<td>低盐缓冲液中洗涤一次，高盐缓冲液中洗涤两次，LiCl 盐缓冲液中洗涤两次，TE 缓冲液中洗涤三次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>Diagenode (C15410206)</td>
			<td>可变*</td>
			<td>可变*</td>
			<td>可变*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 对于 IgG 对照，抗体和细胞的用量以及洗涤步骤必须与其他免疫沉淀实验条件保持一致。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：本研究中使用的抗体及洗涤条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因</td>
			<td>上游引物</td>
			<td>下游引物</td>
			<td>探针</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gapdh 启动子 (0 kb)</td>
			<td>5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3'</td>
			<td>5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3'</td>
			<td>68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dtx1 增强子 (+26 kb)</td>
			<td>5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3'</td>
			<td>5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3'</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基因沙漠</td>
			<td>5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3'</td>
			<td>5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3'</td>
			<td>94</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：本研究中用于qPCR的引物和探针。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">染色质剪切不足，片段过大。</td>
			<td>使用的细胞数量过多。</td>
			<td>减少细胞数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">剪切强度过低。</td>
			<td>增加剪切循环次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>提高剪切峰值功率、占空比和/或每脉冲循环数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">染色质过度剪切，片段过小。</td>
			<td>使用的细胞数量过少。</td>
			<td>增加细胞数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">剪切强度过高。</td>
			<td>减少剪切循环次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>降低剪切峰值功率、占空比和/或每脉冲循环数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="11">IgG对照和/或阴性对照的回收率过低（背景过高）。</td>
			<td>实验中使用的染色质量不足。</td>
			<td>增加染色质用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体用量过低。</td>
			<td>增加抗体用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体用量过高。</td>
			<td>减少抗体用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体特异性较低。</td>
			<td>更换抗体。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">洗涤条件过于严格。</td>
			<td>减少洗涤次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>降低洗涤缓冲液的严格性。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">洗涤条件不够严格。</td>
			<td>增加洗涤次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>提高洗涤缓冲液的严格性。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR中加入的DNA量过多。</td>
			<td>减少qPCR中加入的DNA量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">qPCR条件未优化。</td>
			<td>优化qPCR条件。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>减少循环次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Input样本的qPCR反应中无产物或产物量过低。</td>
			<td>qPCR中加入的DNA量不足。</td>
			<td>增加qPCR中加入的DNA量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">qPCR条件未优化。</td>
			<td>优化qPCR条件。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>增加循环次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>实验中使用的染色质量不足。</td>
			<td>增加染色质用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">阳性对照和/或panH3 ChIP中无信号。</td>
			<td>实验中使用的染色质量不足。</td>
			<td>增加染色质用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体用量过低。</td>
			<td>增加抗体用量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体特异性较低。</td>
			<td>更换抗体。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱效果不佳。</td>
			<td>确保频繁涡旋样品，以保持磁珠处于悬浮状态。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：故障排除。

本研究介绍了一种利用成熟小鼠T细胞系进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。该方案适用于研究特定组蛋白修饰在特定启动子区域或全基因组范围内的分布情况。

小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

信号通路通过在不同层次上调控染色质结构（例如通过翻译后修饰）来调节基因表达程序

本方案的总体目标是高效地在小鼠T细胞系中进行染色质免疫沉淀实验，以在合理的时间内获得高度可重复的结果，用于研究特定基因组区域组蛋白修饰的分布情况。该方法有助于回答染色质生物学领域中的关键问题，特别是关于T细胞分裂或激活过程中染色质结构如何调控的问题。该技术的主要优势在于染色质剪切效率高且高度可重复。该方法的可视化演示至关重要，因为染色质剪切条件较难掌握，且苯酚-氯仿-异戊醇步骤可能具有挑战性。本次操作演示由本实验室的博士研究生 Francesca Ferrante 完成。第一天，将小鼠 T 细胞从六孔板转移至 50 毫升离心管中。随后在24摄氏度下以约271 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于30毫升IMDM细胞培养基中，使用血细胞计数板（Neubauer chamber）进行细胞计数。取2000万细胞分装至新的50毫升离心管中。然后直接向细胞培养基中加入甲醛，使其终浓度为1%，室温孵育10分钟。接着加入1/8体积的1摩尔pH 7.5甘氨酸溶液，室温孵育5分钟。在24摄氏度、约271 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞。用10毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，再次离心，洗涤细胞。再用1毫升PBS洗涤细胞一次。将重悬的细胞转移至 1.5 毫升离心管中，随后进行离心。染色质剪切是最关键的步骤，其效果取决于细胞数量、剪切管、设备、裂解缓冲液以及剪切参数。洗涤后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升 SGS 裂解缓冲液中，并在冰上孵育。10 分钟后，将每个样品转移至超声处理管中。随后根据文本方案中指示的设置，使用聚焦超声仪进行片段化处理。片段化完成后，将样品转移至 1.5 毫升离心管中。在4摄氏度、约18,000 ×g条件下离心10分钟，然后将上清液转移至新管中。取50 µL用于检测剪切效率，并将剪切后的裂解液在液氮中速冻。将裂解液分装成单次使用量，于-80摄氏度保存。为了确定剪切效率，首先向每份剪切后的裂解液各50微升中加入50微升洗脱缓冲液。将混合物在65°C下振荡孵育过夜。第二天，向样品中加入100微升TE缓冲液和4微升浓度为10毫克/毫升的Rnase A。将样品混合，并在37摄氏度下振荡孵育两小时。然后向每个样品中加入2 µL 20 mg/mL的蛋白酶K，再在55摄氏度下振荡孵育两小时。随后将每个样品转移至适合苯酚-氯仿-异戊醇抽提的凝胶管中。按照制造商说明书操作试管。加入 200 µL 苯酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀试管。离心后，将上层液体转移至新的试管中。重复此步骤一次。使用纯化柱纯化DNA，具体操作按照制造商说明书进行，但膜洗涤步骤需重复两次。最后一次洗涤后，将离心管敞口放置于室温下两分钟，以挥发残留的乙醇。洗脱时，向柱中加入 50 微升水，在室温下孵育 1 分钟。然后将离心管离心 1 秒，以充分润湿膜。在室温下孵育膜 1 分钟，然后通过离心洗脱 DNA。使用高灵敏度试剂盒，按照制造商说明书在荧光计上定量纯化的DNA。最后，取约500纳克纯化DNA在1.8%琼脂糖凝胶上进行分析，另取约1纳克纯化DNA使用高灵敏度试剂盒在电泳系统上进行分析。第三天，将一份体积的剪切裂解液用五份体积的稀释缓冲液稀释。在4°C旋转孵育条件下，每毫升稀释裂解液中加入30微升蛋白A琼脂糖珠进行预清除，孵育30分钟。在4°C、约750 × g条件下离心样品5分钟。取澄清裂解液的10%作为输入样品，置于4°C保存。接下来，将所需量的澄清裂解液分装至新的离心管中。然后向每管中加入选定的抗体，并在4摄氏度下旋转孵育过夜。第四天，每管中加入40微升蛋白A磁珠。将混合物在4 °C下旋转孵育一小时。用一毫升低盐缓冲液在4 °C下旋转孵育五分钟，洗涤珠子。然后在4 °C下以约950 × g离心三分钟。依次用高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和TE缓冲液重复洗涤。然后向样品中加入110 µL洗脱缓冲液。在室温下孵育15分钟，每隔2分钟涡旋振荡一次样品。再次离心后，将100 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中。用 100 微升洗脱缓冲液重复洗脱步骤，并合并洗脱液。同时，向先前收集的输入样品中加入洗脱缓冲液，使最终体积达到 200 微升。将所有样品在 65 摄氏度下振荡孵育过夜。第五天，向每个洗脱液中加入 200 微升 TE 缓冲液和 8 微升 10 毫克/毫升的 Rnase A。混匀样品后，在 37 摄氏度下振荡孵育 2 小时。然后向每个洗脱液中加入 4 微升 20 毫克/毫升的蛋白酶 K，在 55 摄氏度下振荡孵育 2 小时。随后将每个样品转移至适合酚-氯仿-异戊醇抽提的凝胶管中。加入400微升苯酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀试管。离心后，将上层液体转移至新试管中，并重复此步骤一次。最后，按照之前方法使用纯化柱对DNA进行纯化。该代表性结果展示了小鼠T细胞系染色质剪切的效果，显示染色质被有效片段化。此处展示的是在小鼠T细胞系中进行的代表性染色质免疫沉淀实验。看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子区域富含组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰。以及组蛋白三上赖氨酸27的乙酰化，但不包括组蛋白三上赖氨酸4的单甲基化。相反，失活基因deltex-1的增强子区域则高度富集组蛋白三上赖氨酸4的单甲基化。但对组蛋白三上赖氨酸4的三甲基化以及组蛋白三上赖氨酸27的乙酰化富集效果较差。在进行此操作时，重要的是要记住在剪切样品之前先溶解SGS沉淀。我们在研究T细胞基因调控时首次提出了该方法。选择T细胞是因为它们在医学应用中具有重要意义，并且是研究高等真核生物基因表达最完善的模型系统之一。该技术建立后，为染色质生物学领域的研究人员探索哺乳动物系统中的染色质调控机制铺平了道路。该技术的应用前景涉及T细胞相关疾病的治疗，因为它能够解析T细胞基因表达程序的建立与调控机制。请注意，甲醛、酚氯仿和异戊醇的使用具有极高危险性，在操作本实验时，必须在通风橱中进行，并始终采取适当防护措施。尽管该方法可用于研究小鼠T细胞染色质的调控机制，也可拓展应用于其他体系，例如内皮细胞和肺细胞系。

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Research

科研

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Genetics

遗传学

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学习染色质免疫沉淀技术在小鼠T细胞系中的应用，通过聚焦超声破碎染色质并免疫沉淀特定抗体，研究组蛋白修饰在基因调控中的作用。该方法高效可重复，适用于免疫学和染色质生物学研究。

小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

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