利用血管性血友病因子-血小板串形成流动腔模型研究血管性血友病因子病理生理学

本实验的总体目标是观察并量化血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）与血小板串状结构在分泌刺激剂作用下的形成情况。该方法有助于解答血管性血友病因子生物学及wavo-palliative body病理生理学中的关键问题，同时也有助于研究影响血管性血友病因子释放及其与血小板结合功能的突变。

该技术的主要优势在于，它能够在可视化且可定量的体外系统中重现内皮下胶原、内皮细胞、血管性血友病因子（VWF）与血小板之间的体内相互作用。我认为，对该方法进行可视化演示至关重要。仅通过文字描述难以掌握在实时条件下同时捕捉多种情况下VWF-血小板串状结构形成的显微成像步骤。

首先，将0.5毫升胶原蛋白包被缓冲液加入1毫升鲁尔锁式注射器中。将注射器末端拧接到流室载玻片的储液槽上，缓慢推动活塞，直至整个通道被均匀包被且每个储液槽均充满液体。补充储液槽中的液体，确保每个储液槽完全充满。

所有泳道加样完成后，在37摄氏度下孵育电泳槽24小时。次日，使用200微升移液器吸除各泳道中的胶原包被缓冲液，然后用HBSS清洗每个泳道，并用200微升移液器吸去盐溶液。

在弃去第三轮 HBSS 后，向每个流室通道中加入约每毫升 10 的 6 次方个血液来源的内皮祖细胞，接种体积为 100 微升生长培养基，并补充 10% FBS。然后将流室放回 37°C 培养箱中培养 24 小时，每 8 至 12 小时更换一次培养基。组装流体装置时，首先将一个雄性弯头鲁尔接头连接至三段无菌硅胶管（每段长 70 厘米）的一端。

并将一个雌性鲁尔锁接头连接到每根管子的另一端。将雌性鲁尔锁接头连接至各自的20毫升注射器，并对注射泵进行编程。将注射器装载到泵上，并用紧固支架牢牢固定注射器和柱塞。

然后，将单独的雄性弯头鲁尔接头连接到三段不同的20厘米无菌硅胶管的两端，并将钝化的18号针头连接到这三个弯头鲁尔接头中的每一个上。接下来，在配备全自动载物台的旋转盘显微镜上，选择20倍物镜并设置适当的通道参数。为了获得完整的动态数据范围，将电子倍增电荷耦合器件的电子倍增增益设置为150，曝光时间为200毫秒。

将491纳米激光功率调整至20%，并使用显微镜软件标记三条泳道的中心位置。将Z轴范围设置为1.0微米，步长设置为0.5微米。最后，设置持续时间和时间间隔，使每张载玻片在60个时间点上每隔10秒采集一次图像。

为诱导VWF-血小板串的形成，将流室三个通道中的培养基更换为仅含无血清培养基作为对照，然后将感兴趣的刺激物用100微升无血清培养基稀释后加入其余通道中。随后在室温下孵育15分钟。刺激结束后，用100至200微升PBS洗涤所有三个通道，并使用血管夹将流室固定于载玻片架上。

将一段70厘米长的管路末端的公卢尔接头连接到流室的每个储液器上。启动注射泵以去除PBS洗涤液。向相对的流室储液器中用移液器加入额外的PBS，以确保通道不会干涸。

确认流速等效后，暂停注射泵。将一个带有雌性鲁尔锁接头的5毫升注射器连接到第一个空闲的雄性鲁尔接头上，并将钝头针浸入含有荧光标记洗涤血小板溶液的1.5毫升微量离心管中。

缓慢地将血小板溶液通过管路吸入，确保系统内无气泡。将雄性鲁尔接头连接至流动室的开放储液端，并像之前演示的那样，将另外两个通道加载血小板溶液。检查流动系统设置，确保所有连接处均牢固。

重新启动注射泵，在避光条件下对血小板流动进行10分钟成像。然后断开流室储液器进液管路上的鲁尔接头，并用PBS填充储液器，以在内皮细胞单层上维持轻柔的生理盐水流动。

为定量分析VWF-血小板串形成，从每张载玻片各通道的中部区域无重叠地采集10张图像。所有图像采集完成后，打开图像处理软件，点击图像、调整、亮度对比度。通过拖动滚动条调整第一张图像的亮度，直至黏附的血小板能够清晰可见，便于定量分析。

然后，当观察到三个或更多排列成行的血小板时，记录一条VWF-血小板串，并统计图像中所有此类串的数量。在启动流动条件后，未处理细胞所形成的VWF-血小板串极少，相比之下，组胺或PMA处理的细胞则每视野平均形成两到三条VWF-血小板串。

此外，组蛋白能够激活血小板以及内皮细胞，诱导产生的VWF-血小板串列数量多于未经处理的对照组，也多于组胺或PMA刺激的对照组。在实施该实验过程中，为保持血小板处于静息状态直至流动实验开始，应弃去首次采血时收集的首管血液，所有试剂保持在室温，并采用轻柔的移液操作技术。本实验方案可进行多种改进，以评估在白细胞存在下、血小板激活剂作用下，或在裂解酶ADAMTS13作用导致串列解聚情况下的VWF-血小板串列形成过程。

观看本视频后，您应能够充分理解如何评估促分泌剂诱导的血管性血友病因子-血小板串形成以及体外流动腔模型。