Name: 逆转录病毒扫描:映射MLV集成站点以定义细胞特异性监管区域 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习利用逆转录病毒载体在人类细胞中绘制MLV整合位点的方法，以识别细胞特异性调控区域。该技术有助于优化基因治疗策略并深入理解基因调控机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了欧洲研究理事会（ERC-2010-AdG，GT-SKIN）、意大利教育、大学和研究部（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003、EPIGEN 表观基因组旗舰项目）、意大利卫生部（2011年青年研究人员项目 GR-2011-02352026）以及巴黎伊马金研究所基金会（法国巴黎）的资助。

1. 人类细胞的MLV转导
<ol>
	<li>分离目标细胞，并使用携带 eGFP 报告基因且伪型化为水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）或兼嗜性包膜糖蛋白的mLV来源逆转录病毒载体进行转导16.
	<ol>
		<li>将未转导的细胞作为后续分析的阴性对照。由于基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导正在分裂的细胞，因此需将靶细胞群体培养在能够刺激细胞分裂的条件下。每种研究细胞类型的转导条件均需单独优化。有关人造血祖细胞、T细胞和表皮细胞的细胞生长与转导条件详见参考文献7、14、15和17。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转导48小时后，将100,000个细胞重悬于 300 μL 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过流式细胞术分析（488 nm激发激光）检测eGFP表达。以未转导细胞作为阴性对照。为获得最佳整合位点回收效果，分选GFP阳性细胞+ 通过荧光激活细胞分选（FACS）对细胞进行分选。</li>
	<li>收集0.5至500万个细胞用于基因组DNA制备。延长培养时间（&gt;7 天）更有利于稀释未整合的前病毒，在分析长期子代时尤为必要 真正有效的 干细胞（参见 讨论部分 和参考文献15). 细胞沉淀可进行速冻，并于 -80 °C 直至使用。</li>
</ol>
2. 通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV整合位点
<ol>
	<li>基因组DNA（gDNA）的制备
	<ol>
		<li>使用基于柱的DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书中的培养细胞操作步骤提取gDNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>限制性内切酶消化
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中为每个样本设置4个限制性内切酶消化反应。在每个反应管中加入0.1至1 μg gDNA、1 µL Tru9I（10U）和1 µL Buffer M，最终体积为10 µL。在65 °C孵育6小时或过夜。</li>
		<li>向每个反应中加入1 µL PstI（10U）、1 µL Buffer H和8 µL水。在37 °C孵育6小时或过夜。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接头连接
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中通过混合正链与负链寡核苷酸制备100 μM Tru9I接头储备液，使两种寡核苷酸终浓度均为100 μM。将离心管置于100 °C水浴中，随后在室温下自然冷却。Tru9I接头储备液可于-20 °C保存至后续使用。</li>
		<li>在1.5 mL离心管中设置8个接头连接反应。每个反应中向10 µL限制性内切酶消化产物加入以下组分：1.4 µL 10X T4 DNA连接酶反应缓冲液、1 µL 10 μM Tru9I接头、1 µL（2,000U）T4 DNA连接酶和0.6 µL水。在16 °C孵育3至6小时。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一轮PCR
	<ol>
		<li>在0.2 mL离心管中设置48个PCR反应（每个连接反应管取6个反应）。每个PCR反应中向2 µL连接产物加入以下试剂：5 µL 10X PCR缓冲液、2 µL 50 mM硫酸镁、1 µL 10 mM脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物、1 µL 10 μM接头引物、1 µL 10 μM mLV-3' LTR引物、0.3 µL（1.5U）Taq DNA聚合酶和37.7 µL水。引物序列见表1。</li>
		<li>在带加热盖的PCR仪中进行PCR扩增，程序如下：95 °C预变性2分钟；25个循环（95 °C变性15秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟）；72 °C最终延伸5分钟；4 °C保存。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二轮PCR
	<ol>
		<li>在0.2 mL离心管中设置48个PCR反应（每个“第一轮PCR”管取1个反应）。每个PCR反应中向2 µL第一轮PCR产物加入以下组分：5 µL 10X PCR缓冲液、2 µL 50 mM硫酸镁、1 µL 10 mM dNTP混合物、1 µL 10 μM嵌套接头引物、1 µL 10 μM mLV-3' LTR嵌套引物、0.3 µL Taq DNA聚合酶（1.5 U）和37.7 µL水。使用针对所选高通量测序平台设计的嵌套引物：（i）适用于Illumina平台的嵌套接头引物和mLV-3' LTR嵌套引物；（ii）适用于Roche平台的嵌套接头引物和mLV-3' LTR嵌套引物。引物序列列于表1中。</li>
		<li>在带加热盖的PCR仪中进行PCR扩增，程序如下：95 °C预变性2分钟；25个循环（95 °C变性15秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟）；72 °C最终延伸5分钟；4 °C保存。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
		<li>将48个嵌套PCR反应产物汇集至一个15 mL离心管中（最终体积约2.4 mL）。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测LM-PCR产物的存在及其大小。
	<ol>
		<li>向20 µL LM-PCR产物中加入4 µL上样缓冲液，与100 bp DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶。以5 V/cm电压电泳30至60分钟，通过溴化乙锭染色观察PCR产物。</li>
		<li>以未转导样本的LM-PCR反应作为阴性对照进行电泳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向扩增产物中加入0.1倍体积的醋酸钠溶液（3 M；pH 5.2）和2.5倍体积的100%乙醇进行沉淀。混匀后于-80 °C冷冻20分钟。
	<ol>
		<li>在4 °C下以标准微量离心机最大转速离心20分钟。弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。在4 °C下再次以最大转速离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀在空气中干燥。加入200 µL PCR级水重悬DNA。样品可于-20 °C保存至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向100 µL LM-PCR产物中加入20 μL上样缓冲液，与100 bp DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶。
	<ol>
		<li>以5 V/cm电压电泳30至60分钟，切下含有150至500 bp扩增片段的凝胶区域。</li>
		<li>使用基于柱的凝胶回收试剂盒纯化LM-PCR产物，并用紫外分光光度计测定浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取1 µL文库，按照制造商说明书使用生物分析仪检测LM-PCR产物的长度。</li>
	<li>扩增片段的鸟枪法克隆
	<ol>
		<li>取20 ng纯化的LM-PCR产物，按照制造商说明书将其克隆至pCR2.1-TOPO载体中。</li>
		<li>使用M13通用引物进行测序反应，随后对所得序列进行基因组定位分析，以检测>50%克隆中是否存在病毒-基因组连接区（包括mLV-3' LTR嵌套引物），从而筛选适合进行高通量测序的样本。病毒-基因组连接区示例如下： 
		<img alt="彩色编码的遗传序列DNA序列分析，文本表示。" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Junction"> 
		MLV-3' LTR嵌套引物454和接头嵌套引物454（表1）以粗体标出，病毒LTR的3'端以斜体标出。人类基因组序列以红色文本高亮（chr10:6439408-6439509, hg19）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. mLV整合位点的大规模测序
注意：LM-PCR 产物可通过商业测序平台进行测序（在第二次 PCR 反应中选择合适的巢式引物对，参见第 2.5.1 小节）。若使用 Roche GS-FLX 焦磷酸测序平台进行测序，请参考先前的研究文献7,14,15。本节将介绍一种新优化的适用于 Illumina 测序平台的实验方案。
<ol>
	<li>文库制备
	<ol>
		<li>为每个样本在 0.2 mL 管中设置 1 个加接头 PCR 反应。在每管中，向 5 µL（150–170 ng）纯化的 LM-PCR 产物中加入以下试剂：5 µL Index Primer 1、5 µL Index Primer 2、25 µL 2X Master Mix 和 10 µL PCR 级水。每个样本使用不同的接头组合。</li>
		<li>在带有加热盖的 PCR 仪中进行 PCR 反应，程序如下：95 °C 预变性 3 min；8 个循环：95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s；72 °C 延伸 5 min；4 °C 保存。</li>
		<li>使用固相可逆固定（SPRI）磁珠法纯化 PCR 产物：在新的 1.5 mL 管中，向每个样本加入 56 µL 磁珠，按生产商说明书操作。用 25 µL 10 mM Tris-HCl 洗脱。文库可在 -20 °C 保存，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库检测
	<ol>
		<li>取 1 µL 样本，使用生物分析仪检测文库片段大小。</li>
		<li>取 1 µL 样本，根据生产商说明书，使用基于荧光的实时 PCR 方法定量文库的摩尔浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库稀释与测序
	<ol>
		<li>使用 10 mM Tris-HCl 将文库稀释至 10 nM。若需混合多个文库，取每种稀释后文库各 5 µL 加入新的 1.5 mL 管中，再用 10 mM Tris-HCl 将混合文库稀释至 4 nM。</li>
		<li>在新的 1.5 mL 管中，将 5 µL 稀释后的混合文库与 5 µL 0.2 N NaOH 混合，短暂涡旋，离心，室温孵育 5 min 以变性文库。</li>
		<li>将管置于冰上，加入 990 µL 预冷的杂交缓冲液（HT1）。取 300 µL 变性后的混合文库转移至新的 1.5 mL 管，加入 300 µL 预冷的 HT1，得到终浓度为 10 pM 的文库混合液。</li>
		<li>同时，在 1.5 mL 管中将 2 µL PhiX 控制文库（10 nM）与 3 µL 10 mM Tris-HCl 混合。加入 5 µL 0.2 N NaOH，短暂涡旋，离心，室温孵育 5 min 以变性稀释后的 PhiX。将管置于冰上，加入 990 µL 预冷的 HT1。</li>
		<li>取 300 µL 变性后的 PhiX 文库转移至新的 1.5 mL 管，加入 300 µL 预冷的 HT1，得到终浓度为 10 pM 的 PhiX 溶液。</li>
		<li>在新的 1.5 mL 管中，将 510 µL 变性后的文库混合液与 90 µL 变性后的 PhiX 文库混合，最终获得含 15% PhiX 控制的 10 pM 混合文库。</li>
		<li>将上述 600 µL 样品加入已解冻的测序试剂盒的“加载样品”储液槽中，立即启动单端 150 个循环的测序运行。 
		注：本实验方案所需的关键试剂与引物序列见表 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li>
<li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li>
<li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li>
<li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li>
<li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li>
<li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li>
<li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional%2C+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724(2016).</li>
<li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li>
<li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting%2C+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li>
<li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688(2010).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158(2013).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li>
<li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种用于全基因组范围内定位小鼠白血病病毒（mLV）整合位点的实验方案，mLV 是一种靶向染色质区域的逆转录病毒，倾向于整合至表观遗传标记为活性启动子和增强子的区域。该方案的关键步骤和/或局限性包括：（i）mLV 对靶细胞群体的转导；（ii）通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增病毒-宿主连接区域；（iii）高效回收大量整合位点。基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导分裂期细胞。然而，其对非分裂细胞（例如有丝分裂后的神经元细胞）转导效率较低，是本技术的一个潜在局限。不过，可通过根据报告基因（例如 eGFP）的表达情况对转导细胞进行分选来克服这一问题。LM-PCR 产生的扩增子长度相对较短（150 至 500 bp），这是必要的，以构建适用于当前高通量测序策略的文库，并实现对 mLV 整合位点的全基因组范围的全面分析。例如，若 LM-PCR 扩增出长度 &#62;500 bp 的产物，可能源于基因组 DNA 的不完全消化，或 Tru9I 酶切后基因组片段的分子内连接，这一点已通过 LM-PCR 扩增子的鸟枪法克隆分析得到验证（数据未显示）。在前一种情况下，可通过进一步优化基因组 DNA 的消化条件来解决；而在后一...

细胞身份由特定基因集合的表达决定。顺式调控元件（如启动子和增强子）在激活细胞类型特异性转录程序中起着关键作用。这些调控区域具有特定的染色质特征，例如特殊的组蛋白修饰、转录因子及其共因子的结合以及染色质可及性，这些特征已被广泛用于在多种细胞类型中全基因组水平地鉴定调控元件1,2,3。特别是，组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的全基因组分布常被用于界定活性启动子、增强子以及超级增强子4,5,6。
莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）是一种γ-逆转录病毒，广泛用于哺乳动物细胞的基因转移。感染靶细胞后，该逆转录病毒的RNA基因组被逆转录为双链DNA分子，并结合病毒和细胞蛋白，组装成前整合复合物（PIC）。PIC进入细胞核并与宿主细胞染色质结合。在此过程中，作为PIC关键组分的病毒整合酶介导前病毒DNA插入宿主细胞基因组。mLV在基因组DNA中的整合并非随机，而是以细胞类型特异性的方式，偏好发生在启动子和增强子等活跃的顺式调控元件区域7,8,9,10。这种特殊的整合模式由mLV整合酶与细胞内的含溴结构域和额外末端结构域（BET）蛋白之间的直接相互作用所介导11,12,13。BET蛋白（BRD2、BRD3和BRD4）在宿主染色质与mLV前整合复合物之间起桥梁作用：其溴结构域可识别高度乙酰化的顺式调控区域，而额外末端结构域则与mLV整合酶发生相互作用11,12,13。
本文介绍了逆转录病毒扫描技术，这是一种基于小鼠白血病病毒（mLV）整合特性来绘制活性顺式调控区域的新工具。简言之，利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的mLV来源逆转录病毒载体对细胞进行转导。在提取基因组DNA后，通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV载体3'长末端重复序列（LTR）与基因组DNA之间的连接区域，并进行大规模测序。将mLV整合位点比对至人类基因组，整合位点高度富集的基因组区域被定义为mLV整合位点簇。
逆转录病毒扫描技术被用于定义多种人类原代细胞中的细胞特异性活性调控元件14,15。mLV簇与表观遗传学定义的启动子和增强子共定位，其中大多数含有活性组蛋白标记（如H3K27ac），并具有细胞特异性。逆转录病毒扫描能够在前瞻性分离的细胞群体中实现全基因组范围的DNA调控元件鉴定7,14，同时也适用于缺乏有效标记物进行前瞻性分离的回顾性定义细胞群体（如角质形成细胞干细胞）15。

<table><tbody><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>0.2 ml 离心管</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>连接子正链寡核苷酸</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>连接子负链寡核苷酸</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3&amp;rsquo;（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&amp;nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 高保真聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔热循环仪（带加热盖）</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接子引物</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3&amp;rsquo;（纯化级别：PCR 级）</td></tr><tr><td>MLV-3&amp;rsquo; LTR 引物</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3&amp;rsquo;（纯化级别：PCR 级）</td></tr><tr><td>连接子嵌套引物 454</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>MLV-3&amp;rsquo; LTR 嵌套引物 454</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>连接子嵌套引物 Illumina</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>MLV-3&amp;rsquo; LTR 嵌套引物 Illumina</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE）</td></tr><tr><td>乙酸钠溶液（3 M），pH 5.2</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Topo TA 克隆试剂盒（含 pCR2.1-TOPO 载体）</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>溴化乙锭&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>100 bp DNA Marker</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>6x 上样缓冲液</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 或 FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&amp;nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>适用于 2 ml 管的 Dynal 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml 试剂盒</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM，pH 8.5</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation 系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>D1000 试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>KAPA 文库定量试剂盒（适用于 Illumina 平台，ABI Prism）</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N NaOH，分子生物学级</td><td>通用实验室供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT1（杂交缓冲液）</td><td>Illumina&amp;nbsp;</td><td>包含于 MiSeq 试剂盒中</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v3（150 个循环）</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 系统</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

逆转录病毒扫描：绘制mlv整合位点以界定细胞特异性调控区域

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

基于莫洛尼鼠白血病（MLV）病毒的逆转录病毒载体主要整合到乙酰化的增强子和启动子区域。因此，mLV整合位点可作为活性调控元件的功能性标记。本文介绍了一种逆转录病毒扫描工具，可用于全基因组范围内鉴定细胞特异性的增强子和启动子。简言之，用mLV衍生的载体转导目标细胞群体，随后用一种高频切割的限制性内切酶消化基因组DNA。在将基因组片段与相容的DNA接头连接后，通过接头介导的聚合酶链式反应（LM-PCR）扩增病毒与宿主基因组的连接区域。对扩增产物进行高通量测序，以确定mLV全基因组范围的整合图谱。最后，通过定义反复出现的整合簇，识别负责激活细胞类型特异性转录程序的细胞特异性调控区域。
逆转录病毒扫描技术可实现对前瞻性分离的目标细胞群体中细胞特异性启动子和增强子的全基因组范围鉴定。值得注意的是，逆转录病毒扫描是一种关键的技术手段，可用于回溯性鉴定那些缺乏可靠标记物、难以通过前瞻性方法分离的稀有细胞群体（例如 体细胞干细胞）。

逆转录病毒扫描程序的工作流程
逆转录病毒扫描流程的工作示意图见图1。首先纯化目标细胞群体，并用表达eGFP报告基因的基于mLV的逆转录病毒载体进行转导。该转基因两侧为两个相同的长末端重复序列（5'和3' LTR），可确保病毒基因组的合成、逆转录及其整合到宿主DNA中。通过FACS分析eGFP的表达水平来评估转导效率。选择mLV转导细胞比例较高（>30%）的细胞群体进行扩增，随后裂解细胞以提取包含整合的mLV病毒序列的基因组DNA。基因组DNA经酶切消化后，连接兼容性接头，并通过LM-PCR扩增病毒3' LTR与宿主基因组之间的连接区域。随后，利用Roche或Illumina测序平台对病毒与宿主基因组的连接位点进行高通量测序。最后，将mLV整合位点比对至人类基因组，以确定反复插入位点的基因组簇。
<p class="jove_step" fo:keep-together.within-page...

本文介绍一种在人类细胞中对基于莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录病毒载体整合位点进行全基因组定位的实验方案。

逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

基于莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）的逆转录病毒载体主要整合至乙酰化的增强子和启动子区域。因此，mLV……

本实验的总体目标是定位小鼠白血病病毒来源的逆转录病毒载体在基因组中的整合位点，以确定细胞特异性的调控区域。该方法有助于解答基因治疗和基因调控研究中的关键问题，例如：载体在人类基因组中的整合位置，以及特定亚型可利用哪些调控元件。我们最初是在观察基因治疗研究时发现，MLV 载体倾向于整合至具有活性的特定亚型启动子和增强子区域，由此提出了该方法。首先，使用携带 EGFP 报告基因并以 VSV-G 或两性嗜性包膜糖蛋白假型化的 MLV 来源逆转录病毒载体转导靶细胞。以未转导的细胞作为阴性对照。转导后 48 小时，离心收集样品，然后将 100,000 个细胞重悬于 300 微升含 2% 胎牛血清的 PBS 中。然后，通过流式细胞术分析检测EGFP的表达。收集另外0.5至500万个转导细胞，用于基因组DNA的制备及后续的限制性酶切。每个样本在1.5毫升离心管中设置四个限制性内切酶消化反应。每管中加入0.1至1微克基因组DNA。每份样品加入10单位TRU91和1微升缓冲液M，终体积为10微升。将2微升混合液分装至消化管中。然后在65摄氏度下孵育反应体系6小时或过夜。孵育结束后，向一个1.5毫升离心管中加入40微升水。在同一管中，每份样品加入10单位PST1和1微升缓冲液H。在消化管中加入10微升消化反应混合液。在37摄氏度下孵育反应6小时或过夜。次日，在1.5毫升离心管中设置八个连接子连接反应。每个反应中，将连接酶反应体系加入到10 µL的消化后基因组DNA中，在16 °C下孵育3至6小时。进行第一轮PCR时，在0.2 mL的PCR管中设置48个PCR反应。每次PCR反应中，将含有接头引物和MLV3 prime LTR引物的反应混合物加入2 µL连接反应产物中。将样品置于带有加热盖的热循环仪中。设置循环参数并运行第一轮PCR反应。进行第二轮 PCR 时，配制反应体系，其中包含连接子嵌套引物和 MLV3 prime LTR 嵌套引物。然后，加入 2 µL 第一轮 PCR 的产物作为模板。随后，运行第二轮 PCR 反应以生成最终的 LN PCR 产物。第二轮 PCR 结束后，将 48 个嵌套的 LM PCR 反应产物收集至一个 15 毫升离心管中。然后向混合并沉淀后的 100 微升 LM PCR 产物中加入 20 微升上样缓冲液。将样品与 100 碱基对 DNA 标记物一同上样至含 1% 琼脂糖的凝胶中。当条带分离后，以每厘米5伏的电压运行凝胶30至60分钟，切下含有500至150个碱基对长度扩增子的凝胶部分。使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒纯化连接介导的PCR产物后，在进行文库构建前，使用紫外分光光度计测定其浓度。同时，按照制造商说明书，使用生物分析仪检测LM PCR产物的长度。通过建立加接头PCR来制备文库。每次PCR使用150至170纳克纯化的LM PCR产物，并为每个样本使用不同的接头组合。按照说明，在带有加热盖的热循环仪中进行PCR反应。PCR结束后，用10毫摩尔Tris HCl将纯化的文库稀释至10纳摩尔。接着，在新的1.5毫升离心管中，加入5微升稀释后的文库混合液与5微升0.2当量的氢氧化钠。短暂涡旋振荡，离心后于室温孵育5分钟，以变性文库。将变性文库的管置于冰上，并加入990微升预冷的HT1杂交缓冲液。然后将300微升变性文库分装至新的1.5毫升离心管中，再加入300微升预冷的HT1缓冲液，以获得终浓度为十皮摩尔的文库混合物。同时，在一个1.5毫升离心管中，将10纳摩尔固定对照文库以2微升体积与3微升10毫摩尔Tris HCl混合。加入5微升0.2当量氢氧化钠，短暂涡旋振荡。离心后，在室温下孵育5分钟，以变性稀释后的固定剂。孵育结束后，将离心管置于冰上，加入990 µL预冷的HT1。取100 µL变性后的固定液加入新的1.5 mL离心管中，再加入300 µL预冷的HT1，使固定液的终浓度为10 pm。最后，在另一个新的1.5 mL离心管中，将510 µL变性后的文库混合物与90 µL变性后的固定文库混合，得到终浓度为10 pm并含有15%固定对照的文库，用于测序。该图像显示了对造血干细胞祖细胞、红系祖细胞和髓系祖细胞中分别存在的 3498、2989 和 4103 个逆转录病毒（MLV）重复整合位点簇的分析结果。在每种细胞群体中，超过 95% 的 MLV 位点簇与表观遗传学定义的增强子和启动子区域重叠。细胞特异性的 MLV 靶向区域呈现出高度乙酰化特征，并与靶向基因的细胞特异性表达密切相关。例如，HSP特异的SPINK2基因的启动子；包含红系特异性β样珠蛋白基因强效增强子的基因座控制区；以及位于NPP特异的LYZ基因上游的增强子。荧光素酶报告基因检测验证了在EPP和MPP中具有细胞特异性的MLV靶向增强子亚群。红系特异性MLV靶向区域在EPP中的活性高于MPP，反之亦然，证实MLV能够识别可能调控邻近基因表达的细胞特异性增强子。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周内完成。在进行该实验操作时，重要的是要牢记尽量提高转导细胞的频率，以实现最佳的整合位点回收。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过以下步骤绘制病毒整合位点：首先对基因组DNA进行调整，然后将基因组片段与DNA接头连接，接着通过LM-PCR扩增宿主基因组与病毒的连接区域，最后对扩增产物文库进行深度测序。

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

逆转录病毒扫描：映射MLV集成站点以定义细胞特异性监管区域

人类内源性逆转录病毒（HERV）占据了人类基因组的8%，虽然其编码能力极为有限，但却含有约十万个长末端重复序列（LTRs）。为此，研究人员设计了一种定制的Affymetrix微阵列，用于鉴定单个HERV位点的表达情况，并以前列腺癌组织作为概念验证，为未来的临床研究奠定基础。...

基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

全长单个前病毒测序（FLIPS）是一种高效、高通量的方法，可用于扩增和测序单个接近全长的（完整和有缺陷的）HIV-1前病毒，并可评估其潜在的复制能力。FLIPS克服了以往用于测序潜伏HIV-1储存库的检测方法的局限性。...

用于下一代测序的近全长HIV-1前病毒扩增

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。...

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

我们介绍一种基因组工程工作流程，用于构建可模拟前病毒在特定基因组位点整合的新一代体外HIV-1感染模型。通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性基因组编辑，可实现对HIV来源报告基因的靶向整合。本文提供了单细胞克隆生成、筛选及正确靶向验证的详细实验方案。...

基于CRISPR-Cas9的基因组工程构建整合位点特异的HIV-1感染Jurkat报告模型

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。...

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

插入突变是正向遗传学中用于鉴定功能性基因组元件的重要工具。本文中，我们描述了一种基于插入的功能元件与转录本筛选方法（InSET），该方法可用于检测基于慢病毒的插入突变细胞文库中的慢病毒整合位点。...

插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

学习利用逆转录病毒载体在人类细胞中绘制MLV整合位点的方法，以识别细胞特异性调控区域。该技术有助于优化基因治疗策略并深入理解基因调控机制。

逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

探索更多视频