逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

本实验的总体目标是定位小鼠白血病病毒来源的逆转录病毒载体在基因组中的整合位点，以确定细胞特异性的调控区域。该方法有助于解答基因治疗和基因调控研究中的关键问题，例如：载体在人类基因组中的整合位置，以及特定亚型可利用哪些调控元件。我们最初是在观察基因治疗研究时发现，MLV 载体倾向于整合至具有活性的特定亚型启动子和增强子区域，由此提出了该方法。

首先，使用携带 EGFP 报告基因并以 VSV-G 或两性嗜性包膜糖蛋白假型化的 MLV 来源逆转录病毒载体转导靶细胞。以未转导的细胞作为阴性对照。转导后 48 小时，离心收集样品，然后将 100,000 个细胞重悬于 300 微升含 2% 胎牛血清的 PBS 中。

然后，通过流式细胞术分析检测EGFP的表达。收集另外0.5至500万个转导细胞，用于基因组DNA的制备及后续的限制性酶切。每个样本在1.5毫升离心管中设置四个限制性内切酶消化反应。

每管中加入0.1至1微克基因组DNA。每份样品加入10单位TRU91和1微升缓冲液M，终体积为10微升。将2微升混合液分装至消化管中。

然后在65摄氏度下孵育反应体系6小时或过夜。孵育结束后，向一个1.5毫升离心管中加入40微升水。在同一管中，每份样品加入10单位PST1和1微升缓冲液H。

在消化管中加入10微升消化反应混合液。在37摄氏度下孵育反应6小时或过夜。次日，在1.5毫升离心管中设置八个连接子连接反应。

每个反应中，将连接酶反应体系加入到10 µL的消化后基因组DNA中，在16 °C下孵育3至6小时。进行第一轮PCR时，在0.2 mL的PCR管中设置48个PCR反应。

每次PCR反应中，将含有接头引物和MLV3 prime LTR引物的反应混合物加入2 µL连接反应产物中。将样品置于带有加热盖的热循环仪中。设置循环参数并运行第一轮PCR反应。

进行第二轮 PCR 时，配制反应体系，其中包含连接子嵌套引物和 MLV3 prime LTR 嵌套引物。然后，加入 2 µL 第一轮 PCR 的产物作为模板。随后，运行第二轮 PCR 反应以生成最终的 LN PCR 产物。

第二轮 PCR 结束后，将 48 个嵌套的 LM PCR 反应产物收集至一个 15 毫升离心管中。然后向混合并沉淀后的 100 微升 LM PCR 产物中加入 20 微升上样缓冲液。将样品与 100 碱基对 DNA 标记物一同上样至含 1% 琼脂糖的凝胶中。

当条带分离后，以每厘米5伏的电压运行凝胶30至60分钟，切下含有500至150个碱基对长度扩增子的凝胶部分。使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒纯化连接介导的PCR产物后，在进行文库构建前，使用紫外分光光度计测定其浓度。同时，按照制造商说明书，使用生物分析仪检测LM PCR产物的长度。

通过建立加接头PCR来制备文库。每次PCR使用150至170纳克纯化的LM PCR产物，并为每个样本使用不同的接头组合。按照说明，在带有加热盖的热循环仪中进行PCR反应。

PCR结束后，用10毫摩尔Tris HCl将纯化的文库稀释至10纳摩尔。接着，在新的1.5毫升离心管中，加入5微升稀释后的文库混合液与5微升0.2当量的氢氧化钠。短暂涡旋振荡，离心后于室温孵育5分钟，以变性文库。

将变性文库的管置于冰上，并加入990微升预冷的HT1杂交缓冲液。然后将300微升变性文库分装至新的1.5毫升离心管中，再加入300微升预冷的HT1缓冲液，以获得终浓度为十皮摩尔的文库混合物。

同时，在一个1.5毫升离心管中，将10纳摩尔固定对照文库以2微升体积与3微升10毫摩尔Tris HCl混合。加入5微升0.2当量氢氧化钠，短暂涡旋振荡。离心后，在室温下孵育5分钟，以变性稀释后的固定剂。

孵育结束后，将离心管置于冰上，加入990 µL预冷的HT1。取100 µL变性后的固定液加入新的1.5 mL离心管中，再加入300 µL预冷的HT1，使固定液的终浓度为10 pm。最后，在另一个新的1.5 mL离心管中，将510 µL变性后的文库混合物与90 µL变性后的固定文库混合，得到终浓度为10 pm并含有15%固定对照的文库，用于测序。

该图像显示了对造血干细胞祖细胞、红系祖细胞和髓系祖细胞中分别存在的 3498、2989 和 4103 个逆转录病毒（MLV）重复整合位点簇的分析结果。在每种细胞群体中，超过 95% 的 MLV 位点簇与表观遗传学定义的增强子和启动子区域重叠。细胞特异性的 MLV 靶向区域呈现出高度乙酰化特征，并与靶向基因的细胞特异性表达密切相关。

例如，HSP特异的SPINK2基因的启动子；包含红系特异性β样珠蛋白基因强效增强子的基因座控制区；以及位于NPP特异的LYZ基因上游的增强子。

荧光素酶报告基因检测验证了在EPP和MPP中具有细胞特异性的MLV靶向增强子亚群。红系特异性MLV靶向区域在EPP中的活性高于MPP，反之亦然，证实MLV能够识别可能调控邻近基因表达的细胞特异性增强子。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记尽量提高转导细胞的频率，以实现最佳的整合位点回收。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过以下步骤绘制病毒整合位点：首先对基因组DNA进行调整，然后将基因组片段与DNA接头连接，接着通过LM-PCR扩增宿主基因组与病毒的连接区域，最后对扩增产物文库进行深度测序。