Name: 一种简单、健壮且高通量的单分子流动拉伸试验研究分子沿 DNA 运移的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 学习单分子流动拉伸试验方法，利用生物素标记的lambda-DNA和PEG功能化盖玻片，结合TIRF成像技术，实现高通量追踪分子沿DNA的一维扩散轨迹，为分子运输机制研究提供可靠平台。

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感谢Tony Kulesa、Robin Kirkpatrick和Evangelos Gatzogiannis在初始仪器安装与测试过程中提供的帮助。我们进一步感谢Tony Kulesa在编写和评估定制单粒子追踪软件方面的大力支持。本工作得到了Burroughs Wellcome基金会提供的启动资金以及科学交叉领域职业奖（授予PCB）的资助。

1. 生物素化 λ-DNA 的制备
注意：生物素标记的λ-DNA分子是通过将生物素标记的寡核苷酸5'-AGGTCGCCGCCC(A)20-生物素-3'连接到λ-DNA分子上而制备的20。
<ol>
	<li>在TE缓冲液中配制0.1 mM的生物素标记寡核苷酸。</li>
	<li>将0.5 mg/mL的λ-DNA储备液在65 °C加热60秒，立即放入湿冰中快速冷却。 
	注意：快速淬灭冷却可减少λ-DNA的串联连接。</li>
	<li>用移液器将100 µL λ-DNA溶液加入微量离心管中。</li>
	<li>将1 µL的0.1 mM寡核苷酸加入9 µL的TE缓冲液中。</li>
	<li>将2 µL寡核苷酸溶液加入含有λ-DNA的微量离心管中，充分混匀。 
	注意：寡核苷酸相对于互补的λ-DNA末端大约有12倍的摩尔过量。</li>
	<li>将λ-DNA与寡核苷酸的混合物在65 °C加热60秒。</li>
	<li>缓慢冷却至室温。 
	注意：此步骤使寡核苷酸与互补的λ-DNA末端退火。</li>
	<li>将混合物置于冰上。加入11 µL T4 DNA连接酶反应缓冲液（终浓度为1×），轻轻混匀；然后加入2 µL（800单位）T4 DNA连接酶，再次轻轻混匀。</li>
	<li>在16 °C孵育2小时，或在4 °C过夜孵育。</li>
	<li>使用标称分子量截留值为100 kDa的离心过滤管纯化产物。具体操作为：将步骤1.9的混合物转移至离心过滤管中，在14,000 × g离心5分钟，用400 µL TE缓冲液洗涤两次，收集纯化后的产物。 
	注意：纯化后的生物素标记λ-DNA溶于TE缓冲液中，在-20 °C下可稳定保存长达一年。</li>
</ol>
2. 盖玻片功能化
注意：通过与硅烷-聚乙二醇-生物素（silane-PEG-biotin）反应来实现玻璃盖玻片的功能化。根据我们的经验，这种一步反应方案比标准的两步反应方案更简便且更可靠20。使用硅烷-聚乙二醇-生物素对盖玻片进行功能化处理，可形成链霉亲和素的结合位点，并最大限度减少DNA和蛋白质在盖玻片表面的非特异性吸附。
<ol>
	<li>将五片1号盖玻片放入染色缸中，用95%乙醇超声处理10分钟，然后用超纯水冲洗三次。 
	注意：第五片盖玻片作为备用，以防破损。</li>
	<li>用1 M KOH充满染色缸，超声处理10分钟，然后用超纯水冲洗三次。</li>
	<li>重复步骤2.1–2.2两次。</li>
	<li>在洁净干燥的N2气流下干燥盖玻片。</li>
	<li>在900 mTorr压力下进行空气等离子体处理5分钟，进一步清洁并干燥盖玻片。</li>
	<li>将盖玻片与25 mg/mL的silane-peg-biotin溶于95%乙醇的溶液在室温下孵育2小时。具体操作：取50 µL silane-peg-biotin溶液夹在两片洁净干燥的盖玻片之间形成“三明治”结构，并将这些&#34;三明治&#34;结构放入一个封闭的移液器吸头盒中，盒底加入约10 mL水（水不与盖玻片接触），以减少溶剂蒸发。</li>
	<li>用超纯水洗去多余的PEG分子，并在洁净干燥的N2气流下干燥PEG修饰的盖玻片。 
	注意：功能化后的盖玻片可在常温条件下保存最多三天。</li>
</ol>
3. 流通池构建
注意：流动池的构建方法是将带有预切微通道的双面胶带夹在PEG功能化的盖玻片与含有进样和出样孔的PDMS板之间。每个流动池集成有多条通道。
<ol>
	<li>在CAD软件中设计流道，并使用胶带切割机在双面胶带上切割流道（每个流道的宽度、深度和长度分别为1 mm、0.13 mm和12 mm），通常每个流动池集成八个流道。清除残留胶带以形成流道。</li>
	<li>制备PDMS板时，使用混合器将45 g PDMS与5 g交联剂充分混合（足以制备十二块5 mm厚的PDMS板，可在常温条件下长期保存），将混合物倒入两个10 cm的培养皿中，并将培养皿置于真空腔内，直至几乎所有气泡消失（若从真空腔取出后仍有气泡残留，需手动去除）。随后将培养皿转移至80 °C烘箱中，直至PDMS完全固化（约2小时）。</li>
	<li>裁剪出与已切割流道的双面胶带尺寸相匹配的PDMS板。剥离双面胶带的一层保护膜，并将其粘附到PDMS板的一个平整表面。使用23号针头的活检打孔器在PDMS板上打出出口和入口孔。</li>
	<li>剥离双面胶带的第二层保护膜，将PDMS-胶带组件粘附到盖玻片的功能化表面（确保盖玻片平整。完整的流动池组装示意图见图1a）。</li>
</ol>
4. 全内反射荧光成像
注意：生物素标记的λ-DNA被固定在流动通道表面，并通过层流拉伸DNA分子（图1b）。该 &#62; 80% 拉伸的 DNA 分子可作为空间延伸的模板，用于观察荧光标记分子的结合与转运活性。单个分子的运动轨迹通过延时全内反射荧光成像（TIRF）进行追踪。图1c &amp;#38; e).
<ol>
	<li>将流动池固定在显微镜载物台上，并将预先脱气的空白缓冲液（10 mM 磷酸钠，2 mM NaCl，50 µM EDTA，20 mM 乙醇，5% (v/v) 甘油，0.01% Tween-20，1% (v/v) β-巯基乙醇，pH 7.4）、0.2 mg/mL 链霉亲和素溶液、1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液和 100 pM 生物素标记的λ-DNA溶液分别加入四个储液槽中，每个储液槽连接一根Tygon管，该管再连接至电磁阀，另一端通过将Tygon管套在较细的PEEK管上来连接PEEK管（防止试剂回流）。通过长时间真空处理（过夜）或短时间搅拌下真空处理（直至无可见气泡）对少量缓冲液进行脱气。</li>
	<li>将空白缓冲液储液槽的PEEK管插入流动池的一个入口孔中。用空白缓冲液冲洗通道以进行预润，然后将另外三根PEEK管插入其余入口孔。每种试剂的气压驱动流动由电磁阀控制，并通过计算机脚本完全自动化。操作时需小心避免在通道内产生气泡。</li>
	<li>从出口孔连接一根带有短PEEK管的Tygon管至废液容器。出口处的短PEEK管有助于在灌注过程中维持通道内的正压，从而抑制气泡形成。</li>
	<li>将生物素化的λ-DNA分子固定于流动通道表面。
	<ol>
		<li>注入0.2 mg/mL链霉亲和素溶液，孵育5分钟，然后用空白缓冲液冲洗以去除未结合的链霉亲和素。</li>
		<li>注入1 mg/mL BSA溶液，孵育1分钟，然后用空白缓冲液冲洗以去除未结合的BSA。 
		注：BSA可进一步抑制DNA及样品在表面的非特异性吸附。</li>
		<li>注入100 pM 生物素-λ-DNA溶液，孵育10分钟，然后用空白缓冲液冲洗以去除未结合的DNA。 
		注：DNA与表面结合后，应避免快速流动，以防对固定化的DNA分子造成损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为检测功能化盖玻片的质量，在实验条件下（见下文4.6节）注入DNA染色染料（如Sytox Orange），并在532 nm激光照射下开始荧光成像。 
	注：功能化盖玻片的质量通常良好，拉伸DNA分子的密度较高。必须保证足够高的拉伸DNA分子密度，以便能够观察到DNA结合以及滑动/一维扩散事件。</li>
	<li>精细调节TIRF角度，以获得拉伸DNA分子图像的最佳信噪比（图1d）。</li>
	<li>为记录沿DNA移动的单个分子轨迹，在新通道中重复步骤4.2–4.4（不加DNA染色染料），然后使用注射泵以足够高的流速注入预先脱气的亚纳摩尔浓度荧光标记分子，并以100 Hz的帧率采集延时荧光图像。 
	注：建议在通道内采用相当于韦森伯格数（Wi：最长聚合物松弛时间——λ-DNA约为0.2 s——与剪切速率——即流速随距盖玻片表面距离的变化率——的无量纲乘积）为500的流速，用于100 Hz帧率下的单分子成像21。
	<ol>
		<li>在一个视野（FOV）中采集10,000帧图像以生成一段视频，并从每个样品的多个（通常为十个）不同视野采集类似的视频。 
		注：单个视野中单颗粒的密度既不应过高——这会使跨帧目标匹配变得模糊，增加数据分析难度，也不应过低——可能导致DNA上单分子事件的发生频率过低。</li>
		<li>优化照明强度，使结合在盖玻片表面的分子迅速发生光漂白以降低背景，而沿DNA扩散的分子则不会过快漂白，从而可检测到更长的轨迹。 
		注：我们通常在视野中使用200–800 W/cm2的功率密度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成步骤4.6后，注入DNA染色染料以确认DNA分子仍可被流动拉伸。</li>
	<li>同时运行阳性和阴性对照样品。 
	注：良好的阳性对照是一种四肽TetraMethylRhodamine(TMR)-KRRR（TMR连接至N端氨基），其在中性pH下的平均一维扩散系数为10.5 ± 0.7（标准误差）M(bp2/s)11。良好的阴性对照是在无DNA固定的通道中，用检测缓冲液测量感兴趣的标记样品，此时不应检测到任何DNA上的扩散活性。</li>
</ol>
5. 数据分析：
注意：&#160;使用定制的单粒子追踪软件来识别沿 DNA 扩散的单个分子的轨迹，并估算其扩散系数。该软件首先高精度地确定单个粒子的质心位置，识别出粘附在盖玻片表面的粒子，然后将不同帧中的粒子进行连接，形成时间序列轨迹。基于这些轨迹，估算出一维扩散系数。
<ol>
	<li>开始数据分析时，打开一种脚本软件（参见材料表），进入单粒子追踪软件的目录，打开名为 &#34;largedataprocess3.m&#34;一个需要定义的重要参数是单颗粒检测的阈值。</li>
	<li>为了确定最佳阈值，运行该 &#34;Determine_threshold_value.m&#34; 脚本。该脚本将展示阈值如何影响单颗粒检测。在确定最佳阈值后，运行该 &#34;largedataprocess3.m&#34; 脚本</li>
	<li>单粒子追踪分析完成后，通过运行以下步骤过滤原始轨迹 &#34;Trajectory_filtering.m&#34; 脚本。内置图形用户界面（GUI）用于可视化过滤步骤。</li>
	<li>在图形用户界面面板上，将沿 DNA 的最小位移 MinXDisp 设为 2 像素；将垂直于 DNA 的最大位移 MaxYDisp 设为 2 像素；将最小帧数 minFrames 设为 10；将三联体的最小状态数 minTriplets 设为 10；将沿 DNA 的最小扩散系数 D_par 设为 0；将垂直于 DNA 的最大估计扩散系数 D_trans 设为 10 M(bp2S-1；设置最小统计参数，Chi2_stat，设为 -5；将沿 DNA 位移与垂直于 DNA 位移的最小比值（MinX/Y）设为 2。 
	注意：所有通过这些筛选参数的原始轨迹列于表1中，未通过的列于表3中。</li>
	<li>单击表1中的轨迹编号，该轨迹将在图形1中显示 &amp;#38;2. 点击 &#34;播放&#34; 单击按钮以播放原始荧光图像。单击 &#34;添加至表2&#34; 以识别该轨迹为单分子滑动轨迹。最后，关闭图形用户界面时，所有添加到表2的轨迹将被保存。</li>
	<li>为计算平均扩散系数，请运行该脚本 &#34;Calculate_mean_diffusion_constant.m&#34;平均扩散系数是根据通过所有筛选步骤并已添加至表2的轨迹集估算得出的。</li>
</ol>

<ol><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.+1.+Models+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory.</a> Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).</li>
<li>Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+base-excision+DNA-repair+protein+finds+intrahelical+lesion+bases+by+fast+sliding+in+contact+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).</li>
<li>Leith, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+sliding+kinetics+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent sliding kinetics of p53.</a> P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+IV.+Viral+proteinase+slides+along+DNA+to+locate+and+process+its+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates.</a> J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).</li>
<li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+Viral+Proteinase+by+a+Peptide+and+DNA+in+One-dimensional+Space+II.+Adenovirus+proteinase+is+activated+in+an+unusual+one-dimensional+biochemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction.</a> J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).</li>
<li>Graziano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space%3A+I.+binding+to+DNA+and+to+hexon+of+the+precursor+to+protein+VI%2C+pVI%2C+of+human+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus.</a> J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).</li>
<li>Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+viral+proteinase+by+a+peptide+and+DNA+in+one-dimensional+space%3A+III.+atomic+resolution+structure+of+the+nascent+form+of+the+adenovirus+proteinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase.</a> J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).</li>
<li>Kabata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+molecules+of+RNA+polymerase+sliding+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA.</a> Science. 262, 1561-1563 (1993).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26831565">&#34;Molecular sled&#34;- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA.</a> Nature Communications. , (2016).</li>
<li>Xiong, K., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sled+sequences+are+common+in+mammalian+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular sled sequences are common in mammalian proteins.</a> Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).</li>
<li>Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+on+DNA%3A+from+peptides+to+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Sliding on DNA: from peptides to small molecules.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).</li>
<li>Turkin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+biomolecular+interactions+by+molecular+sledding%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding.</a> Chem Sci. 7, 916-920 (2016).</li>
<li>Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+chemical+reactions+by+molecular+sledding%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Accelerating chemical reactions by molecular sledding.</a> Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+and+nanoscale+curtain+rods%3A+high-throughput+tools+for+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging.</a> Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Enzymes+Replicating+DNA+Using+a+Single-molecule+DNA+Stretching+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Expt%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay.</a> J Vis. Expt. , e1689(2010).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724(2012).</li>
<li>Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+estimation+of+diffusion+coefficients+from+single-particle+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22+Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726(2014).</li>
<li>Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+CM+%22Hydrodynamic+Flow-stretching+Assay+for+Single-Molecule+Studies+of+Nucleic+Acid-Protein+Interactions%22">Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-Molecule+Studies+of+Protein-DNA+Interaction%3A+Diffusive+Search+and+Sequence-Dependent+Motors%22">Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors</a>. , Harvard University. (2007).</li>
<li>Gorman, J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+one-dimensional+diffusion+of+proteins+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).</li>
<li>Lin, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Bias+from+Flow+to+Elucidate+Single+DNA+Repair+Protein+Sliding+and+Interactions+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA.</a> Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).</li>
<li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+TALE+protein+dynamics+reveals+a+two-state+search+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism.</a> Nat Commun. 6, 7277(2015).</li>
<li>Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALE+proteins+search+DNA+using+a+rotationally+decoupled+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism.</a> Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li>
</ol>

Broad研究所可选择就本文所述工作的某些方面申请专利。

从传统的两步法盖玻片功能化反应方案转换为一步法反应方案后，我们发现盖玻片功能化的可靠性显著提高。由于盖玻片制备的总操作时间少于三十分钟，我们建议在每次进行单分子成像实验的当天新鲜制备盖玻片。为尽量减少硅烷-PEG-生物素试剂的降解，试剂到货后应分装并置于干燥的N2气体环境中，于-20 °C保存。本文中我们未使用过去曾采用的生成-COO-或-CH3末端基团的PEG分子20。其中，-COO-基团的负电荷和-CH3基团的疏水性分别被用于防止DNA分子和特定蛋白质样品在表面的非特异性吸附。我们在完全以生物素封端的PEG表面上观察到小肽样品的表面吸附非常低，而硅烷-PEG-COOH和/或硅烷-PEG-CH3可能适用于某些蛋白质样品的检测，或在检测条件（例如pH &#60;7.5）促进DNA与表面相互作用时使用。
从玻璃载玻片流动池转向PDMS流动池加快了流动池&#160;的构建速度，并便于多通道的集成。我们通常在每个流动池中设计八个通道，从而在每块功能化盖玻片上同时进行八项独立实验。为进一步提高每块盖玻片的通量，可采用更多数量的微加工通道。
在初次填充后的任何阶段，都应尽量避免通道内形成气泡。通常情况下，气泡不会导致拴系DNA的丢失（尽管这种情况也可能发生），但会干扰流体流动，并可能导致DNA黏附在盖玻片上。缓冲液脱气以及添加少量表面活性剂通常可有效防止管路和流动通道中产生气泡。如果气泡已进入管路，应尝试在缓慢流速下冲洗排出气泡，并确保气泡不流经DNA拴系的区域。
由于生成的数据量巨大，简洁高效的数据分析软件至关重要。我们通常从一个流动池的测量中收集70万张高分辨率图像，这些图像可在配备四核处理器和32 GB内存的台式计算机上，通过我们定制的单粒子追踪软件在一天内完成处理。软件检测一维扩散轨迹的假阳性率（步骤5.5）取决于样品，且在以下条件下可保持较低水平：1）视场中单个粒子的密度足够低，使得跨帧连接粒子时几乎没有歧义（蛋白质样品通常比肽样品更容易非特异性吸附到盖玻片上，因此每种蛋白质样品的缓冲液和激光功率密度均需优化）；2）单个粒子的信噪比足够高，从而降低粒子误识别的可能性。尽管如此，软件仍可能偶尔出错，我们建议使用提供的图形用户界面（GUI）对数据进行人工检查，以评估软件性能。在对假阳性轨迹检测特别敏感的应用中，可更严格地设置包括阈值、minFrames、minTriplets和Chi2_stat在内的处理参数，但这会降低对真实结合事件的检测灵敏度，并可能导致轨迹识别中的统计偏差增大。在此，我们分享并描述我们的单粒子追踪软件，旨在帮助标准化数据分析方法，并促进关于最佳实践的讨论。
在我们的实验方案中，成像过程中需要持续流动以维持DNA模板分子的拉伸状态，此时流体流动可能会对某些蛋白质沿DNA模板的转运产生偏向性，特别是当这些蛋白质通过跳跃机制扩散，或所标记的荧光基团具有较大流体力学半径时22,23。尽管这种偏向性在大多数数据集中可以被测量并加以校正，但使用小荧光基团标记且通过滑动机制扩散的蛋白质，其转运通常不会受到流动的可检测程度的干扰2,4,24。值得注意的是，流动速度对蛋白质沿DNA转运的影响已被用于研究蛋白质在DNA上扩散的机制23。&#160;一种密切相关且可实现无流动条件下测量的替代方法，是使用两端均带有生物素的DNA模板，该模板在流动中短暂拉伸后，通过两端固定于盖玻片上，从而在停止流动后仍保持伸展构象25,26,27,28。&#160;双端固定法的优势在于可进行无流动的转运实验，但需要对DNA模板分子的两端进行修饰，在固定过程中需精确控制流动，并需表征两个固定位点之间的距离。此外，还需评估不同DNA分子间张力的异质性以及DNA构象动力学对单分子实验的影响。
除了研究分子沿DNA的一维扩散外，本研究所报道的单分子检测方法还可惠及许多领域 体外 在单分子水平上开展的生物化学与生物物理研究，包括蛋白质对DNA的靶向搜寻过程、DNA上的酶活性及其他相关研究。
故障排除
问题1：流道发生泄漏。
解决方案：首先，确保流道设计在流道周围及流道之间留有至少 1.5 mm 的密封边缘；然后，在组装流室时，确保盖玻片、双面胶带和 PDMS 块之间的接触表面平整、干燥且无杂物，施加的密封压力均匀，并在室温下进行密封操作。
问题2：固定DNA的密度太低。
解决方案：当 PEG 功能化效率较低或 DNA 分子未成功进行生物素标记时，会出现此问题。根据我们的经验，使用新鲜或妥善保存的硅烷-PEG-生物素试剂制备的盖玻片中，应有超过 &#62; 90% 的样品显示出较高的DNA固定密度。若已确认生物素标记的λ-DNA批次有效但固定密度仍然较低，可尝试在PEG功能化过程中提高硅烷-PEG-生物素的浓度，并在DNA固定步骤中提高链霉亲和素和生物素-λ-DNA的浓度。若上述方法无效，则应更换PEG和链霉亲和素试剂。
问题3：DNA黏附在盖玻片上，无法通过流动拉伸。
解决方案：此问题也可能出现&#160;当 PEG 功能化效率较低时，且在低检测 pH 条件下问题加剧时，可尝试增加 BSA 流通量或提高 pH（例如至 8.0），以抑制 DNA 在表面的吸附（步骤 4.3.2）。若在特定检测条件下 DNA 吸附问题持续存在，可在 PEG 功能化过程中尝试加入高达 90% 的硅烷-PEG-COOH。
数据分析说明：
我们使用定制的单粒子追踪软件来识别单个分子沿 DNA 扩散的轨迹，并据此估算其一维扩散系数 D1。为了改进数据分析，我们采用了径向对称算法18&#160;对粒子进行定位，并采用基于协方差的估计器19&#160;来估算一维扩散系数，这显著加快了数据分析速度，同时未影响准确性。我们此前通过分析模拟数据验证了该定制软件的可靠性11。主要步骤如下所述。
颗粒鉴定：
此步骤用于从背景中检测和分割颗粒——即衍射极限下的光斑。首先对图像进行空间带通滤波，以增强3-5像素范围内颗粒的信号（该范围对应于本系统中点扩散函数的尺寸），然后根据强度进行阈值分割（参见脚本：spt2_SD_sandbox.m）。
质心分配
图像分割仅能将分子定位到像素级别的空间分辨率。为了实现更高精度的分子定位，可对上述经过滤波处理的图像应用径向对称超分辨率算法18&#160;。（该方法基于解析计算，因此与二维高斯拟合等其他常用的高精度方法相比，可显著降低计算负担（参见脚本：spt2_SD_sandbox.m）。）
颗粒追踪：
为了追踪粒子随时间的运动轨迹，我们必须在帧间重新识别同一粒子。我们将轨迹的起始、闪烁和终止阶段视为轨迹的组成部分。通过限制每帧中粒子的最大位移，我们将当前帧中的粒子与前序帧中出现的粒子进行关联。当存在多种可能的关联情况时，采用Jonker-Volgenant算法以获得全局最优的关联集合（参见脚本：traceTraj4_kx.3.m）。
D1 估计：
为了从轨迹数据中估算D1值，我们采用基于协方差的估计器（Covariance-Based Estimator, CVE）19。&#160;该方法基于解析计算，相较于常用的均方位移回归法等其他方法，在计算效率和统计严谨性方面更具优势（参见脚本：runspt5_SD.m）。
轨迹过滤：
某些轨迹包含与表面结合分子相连等伪迹，必须予以去除。我们实现了多种筛选特征，包括沿 DNA 的最小位移、垂直于 DNA 的最大位移、轨迹的最小长度、连续检测到的位置三联体的最少数量，以及最低概率评分（定义见 Xiong 等11），通过这些参数的过滤可获得一组偏差最小、可能代表在 DNA 上扩散的分子的轨迹（参见脚本：sptViewFig2_update3x.m）。

生物学中一个长期存在的问题是，作用于基因组特定位点的内源性蛋白质如何能够足够快速地定位其DNA靶标，以确保生物体的存活及其对环境的有效响应。过去四十年的研究提出并广泛支持一种假说，即蛋白质对DNA靶标的搜寻动力学可通过“促进扩散”机制得以加速，该机制中蛋白质在三维空间中的自由扩散与沿DNA的一维扩散（包括滑动和跳跃过程）之间交替进行1。目前人们已知，许多参与基因调控、核酸代谢及其他生命过程的蛋白质均具备在DNA上滑动的能力2,3,4,5,6,7,8,9。此外，最近的研究报道表明，即使是小肽也能够结合DNA并在其上滑动，并具有沿DNA运输“货物”的能力；例如蛋白质分子或PCR引物10,11,12,13,14。
在过去的15年中，单分子流动拉伸实验已被广泛用于研究分子在DNA上的结合与扩散行为2,15,16.&#160;在此类实验中，将生物素标记的双链DNA分子固定于表面，并施加层流以拉伸DNA。 &#62; 80% 拉伸的 DNA 可作为空间延伸的模板，用于研究荧光标记分子的结合与转运活性，其中通过延时荧光成像追踪单个分子沿 DNA 的运动轨迹。在本实验方案中，为优化可重复性与操作便捷性，该检测包含五个主要步骤：生物素标记的λ-DNA制备、盖玻片功能化、流动池构建、荧光成像及数据分析。在先前的方案中17，玻璃盖玻片经过功能化处理&#160;首先与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）反应，再与胺反应性聚乙二醇（PEG）试剂（如NHS-PEG-生物素）反应，从而在盖玻片表面形成一层抵抗检测组分非特异性吸附的PEG层。功能化盖玻片的质量在很大程度上取决于PEG试剂的质量以及各步骤的反应条件。本方案描述了一种简化的功能化流程和多重流动池构建方法，无需使用液体粘合剂。&#160;或在组装流式细胞仪的当天进行固化。我们还描述了一种简化且稳健的数据分析流程11 通过应用径向对称方法进行质心定位，消除了计算密集型的回归步骤18&#160;基于协方差的扩散常数估计器19.
本文报道了一种简单、稳定且高通量的单分子流动拉伸检测方法，在盖玻片功能化、流动池构建和数据分析方面均有显著改进。特别是，我们开发了一步法盖玻片功能化方案，其中洁净干燥的盖玻片直接与硅烷-聚乙二醇-生物素（silane-PEG-biotin）反应。与传统的两步反应方案相比，该方案简化了盖玻片制备流程，并提高了功能化表面质量的可靠性。我们描述了将此类功能化盖玻片与多通道聚二甲基硅氧烷（PDMS）流动池结合使用的方法，该流动池无需胶水即可实现牢固的管路连接。此外，这些流动池的每个流动腔均配备多个计算机控制的进样口，可在实验设置过程中实现试剂流动的自动化，减少人工操作时间，并提高检测通量。

<table><tbody><tr><td>生物素标记的寡核苷酸，5&amp;rsquo;-AGGTCGCCGCCC(A)&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;-生物素-3&amp;rsquo;</td><td>IDT</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td>标准脱盐纯化即可满足要求</td></tr><tr><td>&amp;lambda;-DNA</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>N3011S</td><td>分装保存，尽量减少冻融循环次数</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶及连接反应缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>截留分子量为100 kDa的Amicon离心过滤管</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>1号玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾颗粒</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪，型号PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅烷-聚乙二醇-生物素（Silane-peg-biotin）</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>在干燥氮气中于-20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C保存</td></tr><tr><td>一款CAD软件</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Adhesive Applications</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>胶带切割机，型号CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS及交联试剂套装</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>脱气室，型号F42010-0000</td><td>BEL-ART Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>混合器，型号ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔器，Harris Uni-Cores，0.5 mm规格</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>可用针头尺寸相近的手动活检穿孔器替代</td></tr><tr><td>Tygon管</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>内径0.020&quot;，外径0.060&quot;</td></tr><tr><td>Peek管</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>内径0.007&quot;，外径0.031&quot;</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>N7021S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>新英格兰生物实验室公司</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Orange核酸染料</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td>显微镜、相机、物镜、二向色镜和带通滤光片可使用类似设备替代</td></tr><tr><td>100倍物镜，数值孔径1.49，CFI Apo TIRF</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS相机</td><td>滨松光子学</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>532 nm激光器</td><td>上海瑞森光子技术有限公司</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>选择与所用染料相匹配的激光波长</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR，&gt;=85%纯度</td><td>麻省理工学院生物聚合物实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B，经HPLC纯化</td><td>由布鲁克海文国家实验室Walter Mangel博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脚本编程软件</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* 溶剂阀、计算机接口及组装说明详见零件清单，网址：https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿dna的运输

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

我们介绍一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维扩散。该实验中，玻璃盖玻片通过一步反应用硅烷-聚乙二醇-生物素（silane-PEG-biotin）进行功能化修饰。流动池通过将带有预切通道的双面胶夹在功能化盖玻片与含有进样和出样孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）板之间构建而成。一个流动池中集成了多个通道，且各通道的试剂流动可完全自动化，显著提高了实验通量并减少了每个实验所需的人工操作时间。在每个通道内，生物素标记的λ-DNA被固定在表面，并通过施加层流实现DNA的流动拉伸。DNA分子被拉伸至其轮廓长度的&#62;80%，作为空间延伸的模板，用于研究荧光标记分子的结合与转运活性。通过延时全内反射荧光（TIRF）成像追踪单个分子的运动轨迹。利用简化的自定义单粒子追踪软件分析原始图像，可自动识别沿DNA扩散的单分子轨迹，并估算其一维扩散系数。

图2a展示了pVIc-Cy3B（pVIc：GVQSLKRRRCF；Cy3B连接于半胱氨酸残基）分子在pH 6.5、2 mM NaCl缓冲液中沿DNA扩散时检测到的运动轨迹。pVIc的扩散为双向，由环境热能驱动。根据这些轨迹，可估算每条轨迹的一维扩散常数（D1值）（见图2b中的直方图）。通过将每条轨迹的D1值按其包含的连续三联位置检测点数量加权平均，计算得该pVIc偶联物的平均D1值为22.2 ± 0.9（标准误差）M(bp2/s)。
<img alt="微流控PCR工作站示意图；通过显微镜和荧光检测进行DNA流动分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：用于追踪单个分子沿DNA运动的装置。 
a) 一个八通道PDMS微流控芯片粘附在功能化盖玻片上，DNA可固定于其上（附有美国25美分硬币作为比例参照）；b) 流动池局部放大示意图，显示流动拉伸的λ-DNA分子；c) 用于拉伸DNA的全内反射荧光（TIRF）显微镜与流动系统示意图；d) 流动拉伸的λ-DNA的TIRF图像；e) pVIc-Cy3B（pVIc：GVQSLKRRRCF；Cy3B标记在半胱氨酸残基上）分子结合到流动拉伸的λ-DNA上的TIRF图像。本图已获许可修改2,12。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="DNA迁移图与扩散直方图，x(t)、y(t) 与时间的关系以及D1频率分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：pVIc (GVQSLKRRRCF) 沿DNA的一维扩散。 
a) pVIc在流动拉伸的λ-DNA上沿轴向扩散（137条轨迹），实验条件为2 mM NaCl缓冲液，pH 6.5。x(t)和y(t)分别表示沿λ-DNA轴向和横向的位移。虚线水平线表示因荧光染料闪烁而缺失的数据点。b) pVIc沿λ-DNA扩散时扩散系数D1的直方图。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案展示了一种简单、可靠且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维（1D）扩散。

一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿DNA的运输

我们介绍一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维扩散。在此实验中，……

本实验的总体目标是建立一种简单、稳定且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿 DNA 的运输过程。首先，通过将生物素标记的寡核苷酸连接至 lambda-DNA，制备生物素标记的 lambda-DNA。第二步是采用一步反应法，制备聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）功能化的盖玻片。接下来，通过将带有预切微通道的双面胶带夹在聚乙二醇（PEG）功能化的盖玻片与含有进样和出样孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基片之间，构建高通量流动池。最后一步是利用延时全内反射荧光（TIRF）成像技术追踪流动通道中单个荧光分子的运动轨迹。为了识别沿流动拉伸的λ-DNA扩散的单个分子轨迹，采用一种可靠且高效的定制单粒子追踪软件来分析原始荧光图像。与其它方法相比，本实验方案的主要优势在于盖玻片制备的可靠性更高、通量更大、样品制备所需人工操作时间更短，以及无需人工干预的数据分析流程更为简便。本实验操作将由我实验室的博士后 Dr.Kan Xiong 进行演示。在开始本实验之前，请按照方案文本中的描述准备好所有必要的试剂。将0.5 毫克/毫升的λ-DNA储存液加热至65摄氏度，持续60秒，然后立即放入湿冰中。在微量离心管中，将100微升λ-DNA溶液与2微升10微摩尔的生物素标记寡核苷酸混合。将混合物在65摄氏度加热60秒，然后缓慢冷却至室温。将混合物置于冰上。加入11微升T4 DNA连接酶反应缓冲液，轻轻混匀。然后加入2微升相当于800单位的T4 DNA连接酶，轻轻混匀。在16摄氏度下孵育混合物两小时，或在4摄氏度下过夜。使用标称分子量截留值为100千道尔顿的离心过滤管纯化产物。将1号盖玻片置于染色缸内的95%乙醇中，超声处理10分钟，随后用超纯水冲洗三次。将染色缸中加入一摩尔氢氧化钾，再次超声处理10分钟，然后用超纯水冲洗三次。重复此循环两次。在洁净干燥的氮气流下干燥盖玻片。将盖玻片在900毫托压力下进行5分钟的空气等离子体处理，进一步清洁并干燥。在室温下，将50微升浓度为25毫克/毫升的硅烷-聚乙二醇-生物素溶解于95%乙醇中，与盖玻片孵育2小时。用超纯水洗去未反应的聚乙二醇，并在洁净干燥的氮气流下干燥聚乙二醇包被的盖玻片。使用 CAD 软件设计流道，并用胶带切割机在双面胶带上切割出流道。清除流道内的残留胶质。制备 PDMS 块体时，将 45 克 PDMS 与 5 克交联试剂使用混合器充分混合。将混合物倒入两个100毫米的培养皿中，置于真空 chamber 内约30分钟，直至所有气泡消失。将培养皿放入80摄氏度的烘箱中约两小时，直至PDMS固化。裁剪出一块与双面胶膜上预切通道尺寸相匹配的PDMS片。从双面胶带上撕下一层保护膜，并将其粘附到PDMS切片的一个平整面上。使用23号针头的活检打孔器在PDMS切片上打出出口和入口孔。撕下双面胶带的另一层保护膜，并将其粘附到盖玻片的功能化表面。将组装好的流动池固定在显微镜载物台插件上。将所有预先脱气的试剂加入储液槽中，储液槽通过Tygon管连接至电磁阀，再通过另一段管路连接至PEEK管，以防止试剂回流。试剂的流动由电磁阀控制，电磁阀通过脚本编程应用程序进行调控。用空白缓冲液冲洗一个流路通道以进行预润。将另外三根PEEK管插入入口孔中。注意避免在通道内产生气泡。将Tygon管通过一段短的PEEK管从出口连接至样品废液容器。注入0.2 毫克/毫升的链霉亲和素溶液，孵育5分钟。随后注入空白缓冲液，洗去未结合的链霉亲和素。流加浓度为1毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液，并孵育1分钟。随后流加空白缓冲液以洗去未结合的牛血清白蛋白。再流加100皮摩尔的生物素标记λ-DNA溶液，并孵育10分钟。然后用空白缓冲液冲洗，以洗去未结合的λ-DNA。为检测PEG功能化盖玻片的质量，加入DNA染色剂（如SYTOX Orange染料）并开始荧光成像。若盖玻片质量良好，则拉伸后流动的λ-DNA密度会较高。此外，调整TIRF角度，以获得几乎完全流动拉伸的λ-DNA图像的最佳信噪比。为追踪单个分子的轨迹，首先在新通道内开始孵育，然后使用注射泵以足够高的流速引入亚纳摩尔浓度的荧光标记分子，并以100赫兹的帧率采集时间序列荧光图像。通常在一个视野中采集10,000帧，同时采集多个视野的视频。最后，再次流入DNA染色染料以确认DNA仍可被流动拉伸。将使用定制的单粒子示踪软件来识别沿DNA扩散的单个分子的轨迹。该软件将首先高精度地确定单个粒子的质心位置。去除附着在盖玻片表面的颗粒，然后将不同帧中的颗粒进行连接，以形成延时轨迹。根据这些轨迹，估算一维扩散常数。开始数据分析时，打开一个脚本编程应用程序，并进入单颗粒追踪软件的目录。打开名为 largedataprocess3.m 的脚本。需要定义的一个重要参数是单颗粒检测的阈值。为了确定最佳阈值，运行 determine_threshold_value。m 脚本。该脚本将可视化阈值如何影响单颗粒检测。确定最佳阈值后，运行 largedataprocess3。脚本。完成单颗粒追踪分析后，将通过运行 trajectory_filtering.m 脚本对原始轨迹进行过滤。构建了一个图形用户界面（GUI）以可视化过滤步骤。在 GUI 面板上，将沿 DNA 的最小位移（MinXDisp）设置为两个像素，将垂直于 DNA 的最大位移（MaxYDisp）设置为两个像素。将最小帧数 minFrames 设为 10。将三联体的最小状态数 minTriplets 设为 10。将沿 DNA 的最小扩散常数 D_par 设为零。将垂直于DNA的最大估计扩散常数 D_trans 设为10 兆碱基对平方每秒。将最小统计参数 Chi2 Stat 设为负五。将沿DNA方向位移与垂直于DNA方向位移的最小比值 MinX/Y 设为二。所有通过这些筛选参数的原始轨迹将列于表一中，未通过的轨迹将列于表三中。单击表一中的某个轨迹编号，该轨迹将在图一和图二中显示。单击播放按钮以播放原始荧光图像。如果该轨迹为单分子滑动轨迹，请单击“添加到表2”。最后，关闭图形用户界面时，所有添加到表2的轨迹将被保存。将通过所有筛选步骤的轨迹合并在一起，用于估算平均扩散系数。要计算平均扩散系数，只需运行脚本 calculate_mean_diffusion_constant.m。该方法将为许多从事体外单分子生物物理学研究的人员提供帮助。

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