多肽和蛋白质量化使用自动免疫-MALDI (iMALDI)
2017年8月18日
提出了在使用自动的免疫-MALDI (iMALDI) 技术的复杂生物体液蛋白质定量的协议。
这种自动化免疫 MALDI 检测的总体目标是以准确、灵敏的方式定量复杂生物液中的肽和完整蛋白质。这种方法可以帮助回答定量蛋白质组学领域的关键问题，例如量化蛋白质水平以进行诊断或监测患者对治疗的反应。该方法的主要优点是它可以非常灵敏和准确地定量复杂样品中的蛋白质水平。
该技术允许在早期诊断疾病，因为测定的免疫富集步骤允许定量低丰度蛋白质和肽生物标志物。虽然这种方法可以深入了解血浆肾素活性，但它也可以应用于其他疾病相关研究，例如癌症相关蛋白质的定量，用于预后、诊断和治疗管理。要开始此程序，请将人血浆样品在室温水浴中解冻 5 分钟。
然后，将样品放在冰上直至完全解冻。接下来，手动将 200 μL 的每种血浆样品转移到 1.1 mL 深孔板的单独孔中。将板在 2 摄氏度和 3， 000 rpm 下离心 10 分钟。
然后，使用 Bravo 连续稀释每微升 500 飞摩尔的 Ang-1 NAT 标准溶液，以制备含有鸡蛋清白蛋白的六种校准品溶液。离心后，将每个校准品的 200 微升移液至孔中，并将 125 微升生成缓冲液移液至样品板中。使用自动液体处理系统，将 125 μL 血浆上清液或 125 μL 鸡蛋清白蛋白溶液与 25 μL 血管紧张素 I 生成缓冲液混合在新的 1.1 mL 深孔板中。
现在，自动将溶液转移到 96 孔板中，每种溶液重复 3 次，每孔 34 μL 溶液。然后，将板在 37 摄氏度下孵育 3 小时。对于抗体与蛋白 G 微珠的偶联，首先将 78 μL 先前制备的微珠浆液转移到 1.5 mL 试管中。
用 1 毫升 25% 乙腈的 PBSC 溶液洗涤珠子 7 次，用 1 毫升 PBSC 洗涤 3 次，在每次洗涤之间使用磁力架沉淀珠子。洗涤珠子后，将它们重悬于 110 μL PBSC 中，并加入 110 μL 抗血管紧张素 I 抗体。通过移液混合珠子和溶液。
然后，将微珠在室温下孵育 1 小时，同时以 8 rpm 的速度旋转。在此之后，用 1 毫升 PBSC 洗涤珠子 3 次。然后，将珠子重悬于 1， 100 μL 的 PBSC 中。
现在，手动将微珠溶液转移到 96 孔板中。然后，让 Bravo 将珠子分装到同一个 96 孔板中。血管紧张素 I 生成期 3 小时后，将孵育板置于冰上 10 分钟以终止血管紧张素 I 的生成。用 PBS 缓冲液自动将稳定同位素标准肽储备液稀释 100 倍。
此外，将稳定同位素标准肽稀释液自动分装到 96 孔 PCR 板中。将 10 μL 稀释的肽溶液转移到孵育板的每个孔中。将稀释的肽溶液与血浆样品或鸡蛋清白蛋白溶液混合。
自动将样品或标准溶液添加到微珠溶液中，并混合。孵育 1 小时后，用 5 毫摩尔碳酸氢铵溶液自动洗涤珠子 3 次。每次洗涤后，使用磁铁将珠子拉到底部。
最后一次洗涤后，向每个孔中加入 10 微升碳酸氢铵溶液以重悬珠子。自动将 7 μL 的微珠浆液转移到光斑尺寸为 2， 600 微米的 MALDI 靶板上。磁珠干燥后，自动将基质孔中先前制备的 2 微升 HCCA 基质溶液添加到目标板上的每个样品点上。
在此之后，使用正反射器模式使用 MALDI-TOF 仪器分析样品点。使用供应商特定的软件执行内部校准、数据平滑和基线扣除。用于测量血管紧张素 I 的自动化 iMALDI 程序允许对大量样品进行高通量分析，日内变异系数低于 10%此处显示了通过测量人血浆样品中的血管紧张素 I 获得的代表性光谱。
此处显示了使用自动化 iMALDI 分析获得的 188 份患者样本的 PRA 值与使用临床 LC-MS/MS 程序获得的 PRA 值的相关性。两种方法的相关系数为 0.98，斜率之间的差异可能是由于使用了不同的内标或不同的抗体。测定的线性范围和测定精度显示在此处。
一旦掌握，这项技术可以在大约 5 小时内完成。尝试此过程时，请记住正确调整吸头头和液体处理速度。该手术后，可以使用其他方法来确认患者的原发性醛固酮增多症，包括口服盐负荷或盐水输注试验。
自动化 iMALDI 技术允许对生物样品（包括患者样品）进行特异性和准确的高吞吐量定量筛查，以查找疾病相关蛋白质或肽。观看此视频后，您应该对如何进行基于质谱的蛋白质和肽定量的自动化 iMALDI 分析有很好的了解。不要忘记，处理生物样本（例如人血浆）是极其危险的，因此在执行该程序时必须始终采取必要的安全预防措施。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种使用自动化免疫-MALDI（iMALDI）技术来定量复杂生物液体中的肽和完整蛋白质的协议。该方法旨在提供准确和敏感的测量，有助于诊断和治疗监测。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 生物测定
- 诊断学
背景
- 定量蛋白质组学对于理解各种条件下的蛋白质水平至关重要。
- 低丰度蛋白质和肽生物标志物的定量可能具有挑战性。
- 早期疾病诊断可以显著影响治疗结果。
- 自动化技术增强了蛋白质定量的灵敏度和准确性。
研究目的
- 开发一种用于蛋白质定量的敏感和准确的方法。
- 促进疾病在早期阶段的诊断。
- 提供有关血浆肾素活动和癌症相关蛋白的见解。
使用的方法
- 自动化免疫-MALDI（iMALDI）技术。
- 低丰度蛋白质的免疫富集步骤。
- 解冻人血浆样本以进行分析。
- 定量复杂生物液体中的蛋白质和肽。
主要结果
- 该方法允许对复杂样本中的蛋白质进行敏感定量。
- 它可以应用于各种疾病相关研究。
- 通过准确的蛋白质测量促进早期疾病诊断。
- 可以获得有关治疗监测和患者反应的见解。
结论
- 自动化iMALDI技术是定量蛋白质组学的宝贵工具。
- 该方法增强了早期诊断疾病的能力。
- 它为未来蛋白质定量研究提供了一个框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
