Name: 用耐热配体测量生物分子 DSC 剖面快速表征折叠和结合的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习使用差示扫描量热法（DSC）与热不稳定配体快速表征生物分子折叠和结合相互作用的热力学参数。该方法通过全局拟合分析，仅需两次实验即可高效获取数据，为生物量热学和药物设计研究提供重要技术支持。

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R. W. H. V 获得加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）生物纳米机器培训项目的支持。A. K. M. 和 P. E. J. 分别获得 NSERC 基金项目 327028-09（A. K. M.）和 238562（P. E. J.）的支持。

1. 样品制备
<ol>
	<li>纯化目标生物分子13。 
	注意：本方案使用市售的可卡因结合DNA适配体MN4，在3 kDa截留分子量的离心过滤装置中，经2 M NaCl缓冲液置换三次，再用去离子水置换三次后使用。</li>
	<li>合成并纯化，或直接购买所需的热不稳定配体13。 
	注意：MN4可结合热不稳定配体可卡因。MN4也可结合奎宁，后者在此实验温度下用作配体热稳定性的阴性对照。</li>
	<li>配制用于纯化后生物分子透析及配体溶解的缓冲液（本实验中MN4及配体使用20 mM磷酸钠、140 mM NaCl、pH 7.4的缓冲液）。</li>
	<li>使用截留分子量为0.5–1.0 kDa的透析袋，将生物分子在至少2 L缓冲液中进行透析。</li>
	<li>将最终缓冲液（称为工作缓冲液）通过已充分平衡的0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>称取所需质量的配体，并将其溶解于过滤后的工作缓冲液中。若所需配体浓度对应的称量质量过小而难以准确称量，可配制高浓度配体储备液（例如10倍浓缩液）。 
	注意：所有DSC实验必须使用相同的工作缓冲液处理样品和配体，i.e.，严禁使用与生物分子不同批次的工作缓冲液溶解配体，否则将导致缓冲液不匹配，从而在数据中产生假象。</li>
	<li>将生物分子储备液通过已充分与工作缓冲液平衡的0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>通过吸光度测定确定生物分子浓度（核酸如MN4在260 nm处测定，蛋白质在280 nm处测定）。</li>
	<li>将制备好的生物分子和配体储存于4 °C冰箱中（适用于MN4及本实验所用配体），若生物分子和配体可耐受冷冻且需长期保存，亦可储存于-20 °C或-80 °C。在将缓冲液、生物分子和配体溶液装入DSC仪器前，需使用台式脱气仪（见材料表）进行脱气处理。 
	注意：脱气有助于防止DSC在较高温度下产生气泡。气泡会导致信号假象，干扰DSC峰形和基线。</li>
</ol>
2. DSC 样品制备
<ol>
	<li>从DSC仪器上拧下压力手柄（参见材料表）。</li>
	<li>将硅胶管从工作缓冲液引出，并连接至参比毛细管的前端法兰（金属开口）。</li>
	<li>通过将参比毛细管的后端法兰连接至样品毛细管的前端法兰，在参比与样品毛细管之间建立连接。</li>
	<li>将一段硅胶管连接至样品毛细管的后端法兰，并引至带有真空管线的废液瓶。</li>
	<li>打开真空管线，用200 mL工作缓冲液冲洗DSC系统。</li>
	<li>用工作缓冲液填充DSC的参比毛细管。在参比毛细管的法兰上各连接约3–5 cm长的硅胶管段。</li>
	<li>将1 mL移液器吸头插入后端法兰的硅胶管中。用移液器吸取0.8 mL工作缓冲液，将装有缓冲液的移液器吸头插入前端参比法兰的硅胶管中。</li>
	<li>轻轻按压移液器推杆，使工作缓冲液经前端硅胶管流入参比毛细管，并上升至后端法兰所连接的移液器吸头中。继续下压移液器推杆，直至工作缓冲液液面升至前端硅胶管上方稍高位置，然后缓慢释放推杆，使液面回落至后端硅胶管上方稍高位置。
	<ol>
		<li>重复使工作缓冲液前后流动，以排除参比毛细管内的气泡。 
		注：通常溶液来回流动10次足以清除所有气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用拇指堵住后端移液器吸头，轻轻向上拉动后端和前端移液器吸头，将其连同所连接的硅胶管一并从参比法兰上取下。</li>
	<li>按照步骤2.6–2.9的方法，用工作缓冲液填充样品毛细管。在参比和样品毛细管的后端法兰上安装黑色塑料盖帽，前端法兰保持裸露。</li>
	<li>安装压力手柄。</li>
	<li>打开DSC软件（参见材料表），待功率读数稳定后，点击界面顶部的红色向上箭头对仪器加压；DSC的功率显示在界面右上角的方框中，同时显示仪器的温度和压力读数。 
	注：在DSC加压过程中需监测功率读数。若功率变化超过约10 µW，表明毛细管中形成气泡，可能导致数据伪影。此时必须取出溶液并进一步脱气后方可继续操作。</li>
	<li>通过执行一次正向和反向扫描，使DSC系统与工作缓冲液达到平衡。在屏幕左侧的&#34;实验方法&#34;选项卡中，确保已选择&#34;扫描&#34;选项，以使DSC处于温度扫描模式。 
	注：实验参数包括温度扫描范围、扫描速率、高低温平衡时间以及扫描次数。
	<ol>
		<li>在&#34;实验方法&#34;选项卡下的&#34;温度参数&#34;子区域中，点击&#34;加热&#34;按钮。输入下限和上限实验温度分别为1和100 °C，扫描速率为1 °C/min，平衡时间为60 s。</li>
		<li>在平衡时间输入框下方点击&#34;添加序列&#34;按钮。在弹出窗口的&#34;要添加的步数&#34;字段中输入2（用于一次加热和一次冷却扫描），并勾选&#34;交替加热/冷却&#34;选项框。点击&#34;确定&#34;；添加的扫描步骤将显示在界面下方区域。检查每一步扫描的参数是否符合预期。</li>
		<li>点击界面顶部的绿色&#34;播放&#34;按钮开始实验。在弹出窗口中导航至目标文件夹，并输入用于保存实验数据的文件名。通过点击&#34;数据&#34;选项卡（位于&#34;实验方法&#34;选项卡右侧）查看实验进程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 收集热不稳定配体的DSC数据集
注意：最小实验流程包括五个实验：含配体和不含配体的缓冲液参比实验（用于基线校正，参见讨论部分）、游离生物分子样品实验、配体结合态生物分子实验，以及延长高温平衡时间的配体结合态生物分子实验。
<ol>
	<li>运行参考实验以对样品数据进行基线校正。在两个毛细管中重新装入工作缓冲液，并在适当的温度范围内以1 °C/min的速率采集多次正向和反向扫描数据。-1 上部（高温）平衡时间为120秒。
	<ol>
		<li>通过逐一选中界面下部先前的缓冲液平衡扫描，并点击界面中右侧的红色“X”，将其删除。通过点击添加新的扫描 &#34;添加系列&#34; 按钮，在相应字段中输入 20 &#34;添加步骤&#34;，并检查 &#34;交替加热/冷却&#34; 盒子。点击“确定”，然后点击上方的绿色播放按钮运行实验。</li>
		<li>用含有目标浓度配体的工作缓冲液，在两根毛细管中重复步骤 3.1 - 3.1.1，以获得配体的对照实验（分别采用 120 s 和 600 s 的高温平衡时间进行两次独立实验，用于获取热不稳定性配体转化的速率常数）。 
		注意：此处使用的扫描速率可确保后续实验中的生物分子在正向和反向扫描过程中均处于热力学平衡状态（参见 讨论）。扫描速率 &#60; 0.1 - 0.2 °C/min-1 导致热变曲线噪声增大，不适用于DSC实验。温度范围应从游离生物分子熔解温度以下足够低的温度延伸至配体饱和生物分子熔解温度以上足够高的温度（对于MN4约为20–80 °C）。验证扫描结果的可重复性（例如，进行10次正向扫描和10次反向扫描，共20次，已足够）。</li>
		<li>若使用多种配体（如可卡因和奎宁），用200 mL工作缓冲液冲洗DSC（重复自&#160;步骤2.5）在每次运行之间清除毛细管中的配体，以防止交叉污染。 
		注意：在完成配体结合实验后，建议对游离生物分子进行一次重复实验，以检查先前使用的配体是否强烈吸附于毛细管壁上，并且无法通过缓冲液冲洗充分去除。如果在配体结合实验之后，游离生物分子的热谱图显示出更大的信号幅度以及更高的变性温度，则很可能在冲洗后配体仍残留在量热计中。此时，应通过将毛细管在60 °C下与20% Contrad-70孵育1小时（取下塑料盖和压力手柄）来去除吸附的配体。在DSC软件中，将实验模式更改为 &#34;等温的&#34; 在“实验方法”标签下，选择持续时间为 3,600 s，等温温度为 60 °C，平衡时间输入 0。点击 &#34;添加到实验方法&#34;等温实验显示在屏幕的下半部分。完成后，用2 L去离子水冲洗仪器，并从步骤2.5开始重复操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用与参考扫描相同的DSC加样程序和实验参数运行样品实验。对于游离生物分子数据集，确保参考毛细管中含有工作缓冲液，而样品毛细管中含有溶于工作缓冲液并达到目标浓度的游离生物分子。
	<ol>
		<li>对于配体结合实验，确保参考毛细管中含有工作缓冲液中的配体，而样品毛细管中含有工作缓冲液中的生物分子和配体。在添加不同配体之间，按照步骤2.5冲洗系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行一次额外的实验，将结合了热不稳定配体的生物分子在高温平衡阶段的时间延长至600秒，其余所有实验参数均与步骤3.2.1相同。 
	注意：第二次配体结合实验中高温平衡阶段的持续时间仅需选择为确保配体消耗速度较短平衡时间实验更快即可。若第一次实验中的配体结合峰随扫描次数增加而缓慢衰减（例如连续峰最大值之间的差异≤0.5 °C时，应将高温平衡阶段延长10至20倍，以确保在第二次实验中充分耗尽配体。准确计算配体转化的速率常数要求第二次实验中配体的耗尽速度明显快于第一次实验。若第二次实验中配体耗尽未得到足够加速，则两次实验经全局分析所得的配体浓度将相近，因而无法用于计算。</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>在DSC数据分析软件中打开DSC实验文件（参见材料表），并将原始功率数据导出为电子表格。</li>
	<li>将包含原始功率数据的电子表格导入数据拟合软件中。</li>
	<li>通过从游离态和配体结合态生物分子实验的功率数据中减去缓冲液的功率数据，对样品数据进行基线校正。 
	注意：对于热不稳定配体实验，初始配体浓度随着每次扫描逐渐降低。因此，理想的做法是用缓冲液扫描1减去样品扫描1，依此类推。我们发现，随着配体转化的进行，含可卡因的缓冲液扫描数据无明显变化，因此可使用单次热不稳定配体缓冲液扫描数据校正所有热不稳定配体结合态的数据。</li>
	<li>将基线校正后的样品功率数据转换为热容。 
	注意：该转换需要生物分子的部分比容，可通过估算获得14,15,16。将功率转换为热容的方程此前已有描述17。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>按照先前所述方法4，使用一组共同的基线、配体浓度、折叠及配体结合参数，对短平衡时间的热不稳定配体结合热容数据集进行全局拟合。</li>
	<li>对长平衡时间数据集重复进行全局拟合，以计算热不稳定配体转化的速率常数，方法同前4。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

修改与故障排除
在图1和图2中所采用的全局拟合分析的详细方法此前已有描述4。本文概述了使用热不稳定性配体进行DSC结合实验的操作与数据分析中的实际问题。需要注意的是，单独测得的热不稳定性配体的DSC基线将从配体+生物分子的数据集中扣除，从而有效消除配体自身热转化过程所释放或吸收的热量。标准的热不稳定性配体全局拟合分析（图1和图2）假设在整个温度扫描过程中系统始终处于热力学平衡状态，并且在每条热谱图中，热不稳定性配体的浓度保持恒定，仅在高温平衡阶段期间发生减少。我们此前已证明，该假设适用于可卡因结合的MN4，并预期其同样适用于任何动力学特性与此相似的热不稳定性配体/生物分子体系。
然而...

差示扫描量热法（DSC）是一种用于定量分析生物大分子结合与折叠相互作用的有力方法1,2,3DSC 的优势包括能够阐明结合与折叠机制，并获得相应的热力学参数2,3此外，DSC 可在接近生理条件的溶液中进行，且无需对生物分子或配体进行标记， 例如，使用荧光染料、自旋标记物或核同位素4仪器通过温度扫描，测量在有配体和无配体条件下使生物大分子变性所需的热量。所得热谱图可用于提取调控配体结合与折叠过程的热力学参数。差示扫描量热法（DSC）或其他热力学技术所提供的信息，对于指导靶向生物大分子药物的设计至关重要。1,5,6,7,8然而，反复扫描至高温（约 60 - 100 °C）可能会带来问题。例如，许多具有重要药用价值的化合物在持续暴露于高温时会发生重排或分解9,10,11, 即，它们具有热不稳定性。通过DSC检测结合相互作用通常需要进行多次升温和降温扫描，以验证热变性曲线在热力学分析中的可重复性12初始配体热转化为具有不同结合特性的次级形式，导致连续热谱图的形状和位置出现显著差异，因为随着每次扫描的进行，初始配体的浓度逐渐降低，而热转化产物则不断积累。此类数据集不适用于传统的分析方法。
我们最近开发了一种针对热不稳定配体DSC数据集的全局拟合方法，该方法通过一次配体结合实验，并参考游离生物大分子所必需的热图谱，即可获得表征生物分子折叠与结合相互作用的完整热力学参数集4。与标准DSC方法相比，该分析方法将所需的实验时间和样品量减少了约10倍。我们通过假设配体的热转化发生在每次扫描的高温阶段（在此阶段热图谱不依赖于配体浓度）来校正配体热转化的影响。因此，在用于提取热力学参数的热图谱部分，配体浓度可视为恒定。此外，我们还展示了如何通过增加一个具有更长高温平衡时间的补充实验，获得配体热转化的速率常数。对于配体热转化温度依赖性较弱的体系（即在所有温度下均显著发生转化的情况），该分析方法可进一步改进，以纳入变化的配体浓度。本文以DNA适配体MN4与热不稳定配体可卡因为例，演示了该方法的应用；可卡因在高温下（&#62;60 °C）会迅速转化为苯甲酰爱冈宁。奎宁则被用作配体热不稳定性的阴性对照，因其在这些实验温度下不发生转化，但仍能与MN4结合。我们详细描述了热不稳定配体DSC数据的采集方法及其分析过程，从而获得折叠、结合及配体转化过程的热力学与动力学参数。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用去离子水</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 微米无菌注射器滤器</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa 离心滤器</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>透析袋，截留分子量 0.5–1.0 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>塑料 DSC 法兰盖</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA 适配体 MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>可卡因</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>奎宁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III 微量热仪</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun 软件</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze 软件</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

利用热不稳定配体测量生物大分子dsc谱图以快速表征折叠与结合相互作用

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

差示扫描量热法（DSC）是一种强大的技术，可用于量化调控生物大分子折叠和结合相互作用的热力学参数。这些信息在新型药物化合物的设计中至关重要。然而，许多具有药理学意义的配体在DSC分析所用的高温条件下化学性质不稳定。因此，测量结合相互作用具有挑战性，因为在量热计样品池内，配体及其热转化产物的浓度持续发生变化。本文介绍了一种利用热不稳定配体和DSC快速获取折叠、结合及配体转化过程热力学和动力学信息的实验方案。我们已将该方法应用于DNA适配体MN4，该适配体可结合热不稳定的配体可卡因。通过一种考虑热不稳定配体转化的新全局拟合分析方法，仅需一对DSC实验即可获得完整的折叠与结合参数。此外，我们证明仅需一个额外的DSC数据集即可获得热不稳定配体转化的速率常数。本文还提供了识别和分析多种更复杂情形下数据的指导原则，包括生物大分子的不可逆聚集、缓慢折叠、缓慢结合以及热不稳定配体的快速耗尽。

热不稳定配体DSC的代表性数据如图1所示。随着每次扫描过程中热不稳定配体的逐渐消耗，其结合峰的位置和高度连续地向未结合生物分子的峰位置移动（图1a）。游离变性曲线被用作热不稳定配体转化终点的参考（图1b）。MN4与奎宁结合的数据作为热不稳定配体转化的阴性对照（图1b）。最终的热不稳定配体扫描曲线的相变中点和峰高略高于未结合的MN4，表明热不稳定配体的转化产物（苯甲酰爱康宁）对MN4具有较弱的亲和力。图1中数据集经全局分析所得的热力学参数列于表1。MN4在可卡因或奎宁存在下的折叠参数在误差范围内相同，这符合预期，因为稀释的小分子不应影响游离生物分子的折叠热力学。结合参数与等温滴定 calorimetry（ITC）<sup class="xref"...

我们提出了一种利用差示扫描量热法快速表征生物分子折叠及与热不稳定配体结合相互作用的实验方案。

利用热不稳定配体测量生物大分子DSC谱图以快速表征折叠与结合相互作用

差示扫描量热法（DSC）是一种强大的技术，可用于量化调控生物大分子折叠与结合的热力学参数……

本方法的总体目标是利用热不稳定的配体，仅通过最少两次实验，通过差示扫描量热法（DSC）提取调控生物分子折叠和结合相互作用的热力学参数。该方法有助于回答生物量热学和药物设计领域中的关键问题，例如：调控生物分子与强结合抑制剂之间相互作用的热力学参数的相对大小是多少？该技术的主要优势在于，可在单次实验中完成完整的配体滴定，从而通过全局拟合分析快速提取热力学参数。首先，准备用于将纯化的生物分子透析至配体溶液中的缓冲液。使用截留分子量为0.5至1.7千道尔顿的透析袋，将生物分子在至少一升缓冲液中进行透析。获得高质量DSC数据最关键的步骤是将生物分子和配体在目标缓冲液中进行透析。这可确保 DSC 数据中不存在缓冲液不匹配的伪影。将最终缓冲液（称为工作缓冲液）通过已用缓冲液充分平衡的 0.2 微米滤膜过滤。称取所需质量的配体，并将其溶解于过滤后的工作缓冲液中。如果目标配体浓度所需的称样质量过小而无法准确称量，则需配制高浓度的配体储备液。将生物分子储备液通过已用工作缓冲液充分平衡的 0.2 微米滤膜进行过滤。随后，通过吸光度测定确定生物分子的浓度。将制备好的生物分子和配体储存在4摄氏度冰箱中，或在-20或-80摄氏度下冷冻保存，前提是该生物分子和配体可耐受冷冻且需要长期储存。在将缓冲液、生物分子和配体溶液装入差示扫描量热仪（DSC）之前，使用台式脱气仪进行脱气处理。从DSC上拧下压力手柄。然后，从工作缓冲液引出一段硅胶管，并将其连接到参比毛细管的前端法兰上。通过将参比毛细管的后端法兰连接到样品毛细管的前端简单法兰，建立参比毛细管与样品毛细管之间的通路。接着，将一段硅胶管连接至样品毛细管的后端法兰，并将其通向带有真空管线的废液瓶。打开真空管路，用200毫升工作缓冲液冲洗DSC。首先，将长约3至5厘米的硅胶管连接到参比毛细管法兰上。接着，将一个1毫升移液枪头插入后侧法兰的硅胶管中。用移液枪吸取 0.8 毫升工作缓冲液，将装有缓冲液的枪头插入前部参考法兰的硅胶管中。轻轻下压移液枪按钮，使工作缓冲液流经前部硅胶管，进入参考毛细管，并向上流入后部法兰连接的枪头内。继续下压移液枪按钮，直至工作缓冲液液面升至前部硅胶管稍上方，然后缓慢释放移液枪按钮，使工作缓冲液液面降至后部硅胶管稍上方为止。继续在参比毛细管中来回推动工作缓冲液，以排出管内气泡。接着，用食指堵住后端移液尖端，轻轻上拉后端移液尖端和前端移液管，将它们连同连接的硅胶管一并从参比法兰上取下。像之前一样，用工作缓冲液加载样品毛细管。将黑色塑料盖置于后部参比样品法兰上，前部法兰保持裸露。将压力手柄连接至DSC，然后打开DSC软件，在功率读数稳定后，点击界面顶部的红色向上箭头，对仪器加压。DSC的功率显示在界面右上角的方框中，同时显示仪器的温度和压力读数。在屏幕左侧的“实验方法”选项卡中，通过执行一次正向和反向扫描，使用运行缓冲液平衡DSC。确保已选择扫描选项以运行DSC和温度扫描模式。在实验方法选项卡下方的温度参数设置区域中，点击加热按钮。输入1和100摄氏度作为实验温度的下限与上限，扫描速率设为每分钟1摄氏度，平衡时间设为60秒。在平衡时间输入框下方点击"AddSeries"按钮。在弹出的窗口中，将步骤数输入框设置为2，并勾选"Alternate Heating/Cooling"复选框。单击“确定”。添加的扫描将显示在界面的下半部分。检查每项扫描的参数是否符合预期。单击界面顶部的绿色播放按钮以开始实验。导航至所需窗口，在弹出窗口中输入用于保存实验的文件名。点击实验方法选项卡右侧的数据选项卡，查看实验进度。通过在两个毛细管中重新加载DSC工作缓冲液，运行参考实验以对样品数据进行基线校正。在合适的温度范围内，以每分钟1摄氏度的速率采集多个升温和降温扫描数据，升程平衡时间为120秒。通过逐一高亮界面下部先前的缓冲液平衡扫描曲线，并点击界面中右侧的红色X，将其删除。点击AddSeries按钮，输入要添加的步数为20，并勾选交替加热/冷却（Alternate Heating/Cooling）选项，以添加新的扫描曲线。然后，点击“确定”，并像之前一样点击绿色播放按钮运行实验。在两根毛细管中均使用含有目标浓度配体的工作缓冲液重复上述步骤，以获得配体的参比实验数据。分别进行两次独立实验，用于获取热不稳定性转化的速率常数。对于游离生物分子数据集，确保参考毛细管中含有工作缓冲液，而样品毛细管中含有溶于工作缓冲液并达到所需浓度的游离生物分子。接下来，采用与参考扫描相同DSC加样程序和实验参数运行样品实验。对于配体结合实验，确保配体溶于工作缓冲液并置于参考毛细管中，而样品毛细管中则含有溶于工作缓冲液的生物分子与配体。在添加不同配体之间，按前述方法冲洗系统。另进行一次实验，将生物分子与热不稳定配体结合，高温平衡时间延长至600秒，其余实验参数均与之前相同。随后按照文本方案中所述进行数据处理与分析。热不稳定配体结合峰的位置和峰高随着每次扫描过程中热不稳定配体的逐渐消耗，连续向未结合分子的峰位置和峰高方向下移。三维成熟曲线用作判断热不稳定配体转化终点的参考依据。相较于短时间平衡阶段的数据，延长高温平衡时间可使每次扫描中热不稳定配体浓度的降低更为显著。利用两组数据经优化全局拟合得到的浓度参数，可计算出配体在高温平衡条件下的转化速率常数。若操作得当，掌握该技术后可在72小时内完成实验。在实施该实验步骤时，需注意对生物分子配体进行脱气处理，同时使用加样移液器排出DSC毛细管中的气泡，以避免产生数据伪影。观看本视频并阅读文章后，您应能充分掌握如何对生物大分子开展差示扫描量热法（DSC）实验，以及如何实施全局拟合分析，以快速提取调控折叠和结合相互作用的热力学参数。尽管该方法可用于研究平衡状态下的折叠与结合相互作用，也可拓展应用于其他体系，例如表现出慢折叠和/或配体结合动力学的生物分子。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用耐热配体测量生物分子 DSC 剖面快速表征折叠和结合的相互作用

本文介绍了一种利用等温滴定 calorimetry...

等温滴定 calorimetry 测定大分子-配体亲和力

本视频演示了差示扫描量热法——一种用于研究生物分子与配体之间相互作用的技术。通过对待测样品施加反复的加热和冷却循环，并获取热力学分析所需的扫描数据，来研究DNA适配体与热不稳定配体之间的结合。...

利用差示扫描量热法研究DNA适配体与热不稳定配体的相互作用

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。...

无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

差示扫描荧光法是一种广泛用于筛选小分子文库与蛋白质相互作用的方法。本文介绍了一种简单的方法，可将此类分析扩展至估算小分子与其靶标蛋白之间的解离常数。...

使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

差示扫描量热法可测量蛋白质变性所需的热转变温度及总热能。所得结果用于评估疫苗制剂中蛋白质抗原的热稳定性。...

差示扫描量热法——一种评估蛋白质抗原热稳定性和构象的方法

本文介绍了一种用于制备和纯化稳定同位素标记蛋白质的实验方案，以及随后利用核磁共振（NMR）波谱法和微尺度热泳（MST）实验表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法。...

利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）检测球状蛋白与丝状蛋白的相互作用

微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。...

使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用

监测目标蛋白熔解温度的变化即热移位分析（thermal shift assay, TSA）是一种用于筛选包含数百种化合物的片段库的高效方法。本文介绍了一种采用机器人辅助纳米微分扫描荧光法（nano-DSF）的TSA实验方案，通过监测内在色氨酸荧光和光背向散射进行片段筛选。...

基于片段的先导化合物发现中用于筛选的纳米差示扫描荧光法

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通过差示扫描荧光法检测CD40蛋白与伞形酮的相互作用

本文介绍了热位移分析法，这是一种高通量、基于荧光的技术，用于研究小分子与目标蛋白质的结合。...

利用热 shift 测定法探究底物与硒蛋白 O 的结合

学习使用差示扫描量热法（DSC）与热不稳定配体快速表征生物分子折叠和结合相互作用的热力学参数。该方法通过全局拟合分析，仅需两次实验即可高效获取数据，为生物量热学和药物设计研究提供重要技术支持。

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