Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

这种行为记录设置和协议的总体目标是使用多摄像头视频采集系统量化秀丽隐杆线虫对可溶性化合物的基于群体的化学感应偏好，然后进行自动视频分析。这种方法可以通过对遗传突变体进行更快、更标准化的行为分析来促进 C Elegans 的神经生物学研究。该技术的主要优点是可以在相同条件下同时测定多个重复，同时监测线虫种群对可溶性线索的反应的时间动态。

演示行为室组件的是该实验室的科学家 Christopher Cronin。首先，请按照随附的文本协议中的说明准备织物盖、相机支架、角支架、挤压杆和相机支架组件。从连接到中心杆的端杆开始，将相机支架和皮套安装到相机支架组件上。

接下来，组装行为暗室框架。首先将四个 1 英尺的挤压铝棒连接到方形聚酯板上。将一根杆滑到织物片全向的两个 T 形螺母上，使杆沿织物宽度居中。

拧紧紧固件以将织物板固定到每个杆上。将方形聚酯板铺在工作台面上，顶部有四个连接的铝条。然后，将八个角支架滑到四个铝条的顶面上，每个铝条的两端各一个。

将角支架放在杆上，使支架的垂直支腿与杆的末端齐平，并通过将螺钉拧紧到 T 形螺母中将其固定到位。在每个角处，竖立一个一英尺的铝挤压件，将挤压件滑过两个角支架腿上的 T 形螺母。然后，通过拧紧紧固件将立杆固定到水平杆上，从而连接两个相邻的水平杆。

将 H 形相机支架组件的松散 T 形螺母滑入框架的立柱中。让 H 一直滑到框架每个角的角支架顶部。拧紧四个角支架螺钉，将相机支架组件固定到位。

接下来，使用最后四个 1 英尺挤压铝棒组装腔室的底层。放置角支架，使支架的支腿与杆的末端齐平，然后拧紧螺钉以将其固定到位。然后，将杆在框架立柱之间滑下，将松动的 T 形螺母放在立柱通道中。

放置杆，使其角支架的顶部边缘比立柱的开口端低一英寸，并通过拧紧角支架螺钉固定到位。接下来，将四个矩形聚酯板的 T 形螺母向下滑入直立挤压杆的通道中，以覆盖腔室的侧面并拧紧紧固件以固定到位。选择一侧作为进入腔室内部的门，并卸下腔室底层的两个螺钉和 T 形螺母。

在每个角的顶端放置一个塑料帽，作为完整框架的支脚。将框架正面朝上，将每张幻灯片插入框架空间层内的两个面板支架，然后扭转以将它们固定到位。然后，将一块 12 x 12 英寸的透明丙烯酸树脂放在面板支架的顶部，为检测板提供一个载物台。

最后，按照随附的文本协议中的说明定位摄像机和舞台模板。在实验前一天，将 28 个 35 毫米空板放在平坦的表面上，每堆 5 个或更少。用 5 毫升线虫生长培养基琼脂填充每个检测板，并让检测板在室温下盖上盖子直立晾干。

实验当天，打开背光，启动计算机并启动显微镜相机的视频捕获软件。将显微镜相机连接到计算机，然后单击软件窗口顶部带编号的相机缩略图以查看相机的实时馈送。要调整视频录制设置，请下拉摄像机源左上角的视频格式菜单，然后选择 MJPG 1280x1024。

接下来，下拉视频格式菜单旁边的文件夹菜单，然后选择保存视频文件的文件夹。单击相机源右上角的自动曝光图标，然后关闭自动曝光。然后，单击自动曝光图标右侧的 LED 图标以关闭内置的显微镜相机 LED。

单击相邻的设置图标并选择单色。最大化对比度，并调整亮度。将解决方案放置模板对齐到舞台板对齐模板的顶部，然后单击摄像机馈送左侧的延时视频录制图标。

输入持续时间为 5 秒，间隔为 1 秒，以每秒 1 帧的速度录制 5 秒校准视频。使用 5 毫升玻璃移液器将 1.2 毫升线虫生长培养基缓冲液添加到同步蠕虫板中，然后轻轻搅拌板以将蠕虫移入缓冲液中。从板中吸取缓冲液，并将缓冲液中的蠕虫分配到干净的微量离心管中。

让试管静置 1 到 2 分钟，让蠕虫沉降到底部。然后，使用塑料移液器吸头从试管中去除尽可能多的洗涤缓冲液，而不会干扰试管底部的聚集蠕虫颗粒。用 1 毫升干净的线虫生长培养基缓冲液重新填充试管，然后再重复洗涤程序两次。

接下来，将溶液放置模板贴在解剖显微镜的载物台顶部。然后，将一条双面胶带放在板对齐模板的两侧。将检测板的周边与板对齐模板上的圆圈对齐，然后向下按压，直到模板粘附在板的底部。

然后，将检测板模板成员标记与解剖显微镜上的溶液放置模板成员标记对齐。接下来，使用 P2 移液器将 1 微升 M13 缓冲液放入象限 1 和 4。使用新吸头将 1 微升 10 毫摩尔 CuCl2 溶液分别放入象限 2 和 3。

一旦溶液滴完全吸收到琼脂中，使用玻璃巴斯德移液管将洗涤过的蠕虫转移到检测板中。将一滴蠕虫滴在圆形处理区域的上方和下方的区域。将组织折叠四次，并使用钝边吸收检测板上多余的洗涤缓冲液。

立即通过对齐模板角的数量，将分析板排列在行为室的显微镜相机下。等待 2 到 3 分钟，让蠕虫适应检测板。然后，单击摄像机源左侧的延时视频录制图标，并输入 10 分钟的持续时间和 1 秒的间隔，以录制每秒一帧的 10 分钟视频。

最后，点击 Start 开始，开始视频录制。对于每个视频帧，首选项索引函数计算每个感兴趣区域中的蠕虫像素数，并计算一个像素占感兴趣区域中像素总数的百分比。此处显示了针对不同基因型和处理配对获得的偏好指数值。

阳性偏好指数值表示对治疗的吸引力，而负偏好指数值表示排斥。当 M13 缓冲溶液同时置于感兴趣的对照和实验区域时，获得 0.02 的偏好指数，表明没有空间偏差。该图还显示 N2 蠕虫强烈避开铜离子，导致偏好指数为 0.67。

此外，在感觉纤毛形成中缺陷的 osm-3 和在 ASH 介导的伤害感受反应中缺陷的 ocr-2 突变体表现出对铜离子的回避减少，甚至表现出一些轻微的吸引力。在尝试此协议时，快速但平稳和一致地工作很重要。记录设置和测定方案可以很容易地适应，以表征由不同秀丽隐杆线虫感觉品种之间的相互作用引起的基于群体的行为反应。