原子力显微镜对单蛋白质分子的力谱
February 28th, 2019
我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子的机械性能和机械展开途径的详细程序和策略。我们还展示了代表性的结果, 作为选择和理由的良好单蛋白分子记录的参考。
单分子力光谱学可以让我们用力操纵单个分子，从而在原子尺度上为分子生物学提供巨大的见解。在这里，我们使用原子力显微镜演示恒定速度测量。我们最终可以使用这些数据来确定蛋白质的稳定性、展开速率和展开路径。
要开始该步骤，请将非导电胶粘剂卡舌连接到干净、15 毫米宽的铁盘上。取下盖板，将清洁、未涂覆或镀金的玻璃滑轨牢固地压在外露胶粘剂上。将幻灯片存放在干净、有盖的培养皿中。
接下来，将纯化的多蛋白浓缩在离心过滤器中，然后反转柱，将蛋白质放入缓冲液中，用于实验。根据280纳米的吸光度确定适当的蛋白质浓度，然后准备100微升的100微升每毫升蛋白质溶液。将蛋白质溶液的 60 微升滴涂抹在幻灯片的中心。
注意不要让液体在幻灯片和铁盘之间滑动，因为这将导致在实验过程中不受控制的样品运动。让样品在室温下至少坐10分钟。首先，小心地拿起悬臂，放在探针保持单元中。
确保悬臂牢固地固定。然后将保持单元放在 AFM 头中。将头部置于倒置显微镜舞台上，将电池组连接到 AFM 头，为激光供电。
为显微镜探测器设置摄像机，以在监视器或电视屏幕上显示激光。在显微镜的引导下，将激光定位到悬臂尖端。样品准备就绪后，将实验缓冲液的 10 微升刷新到探针保持单元的每个端口中。
从样品幻灯片中抽取约 40 微升液体，并添加 40 微升缓冲液。同时，开始准备原子力显微镜进行测量。首先，将幻灯片放在压电电机上方的磁铁上。
确认 AFM 级处于提升位置，然后将 AFM 头与悬臂放在样品液滴上方的舞台上。接下来，在 AFM 光电二极管前面放置一张小纸。调整激光，直到纸张上的斑点明亮且聚焦，然后取出纸张。
启动 AFM 软件以查看来自光电二极管的信号。调整 AFM 头镜，使激光信号在所有四个光电二极管象限中最大化，顶部和底部象限对之间的不同信号为零。要开始校准 AFM，请将 AFM 头信号的滤波器设置设置为全带宽，并确保压电已关闭。
在 AFM 软件中，测量功率谱的 512 个计算平均值，每个计算有 1，024 个数据点。将功率光谱密度集成在第一个峰值上，对应于悬臂的主要振动模式。接下来，打开压电控制器，将过滤器设置为 500 赫兹。
在监控不同信号的同时，快速将 AFM 头向下移动几百微米。继续一次将头部向下移动几百微米，同时观察不同信号中的一致跳跃。当信号跳跃开始高度增加时，尖端非常接近样品表面。
一旦偏转信号在尖端与表面接触时饱和，稍微抬起头部，然后调整压电电压，使 AFM 磁头向上或向下移动 100 到 5，000 纳米以找到样品表面。之后，进行一个拉拔实验，扫描大小约为500纳米，使尖端接触表面，或约100纳米的压电电机运动。使用结果计算弹簧常数和灵敏度。
在软件中，将扫描大小设置为比展开的多蛋白的总理论大小大 40%。放置悬臂，使悬臂的扫描尺寸从表面的 80% 。将扫描速度设置为 300 纳米/秒。
执行拉力实验并测量生成的压电位置和光电二极管信号。在整个测量过程中每小时向流体细胞添加实验缓冲液，防止样品干燥。I91多蛋白和多蛋白的录音中的展开事件，其中三个 I91 域在每侧NI10C分子的两侧，都装有蠕虫一样链模型。
两个记录均显示 I91 的特征力和轮廓长度增量，表明 AFM 校准成功。含有N110C分子的多蛋白的录音显示，I91事件足以证实新事件来自感兴趣的蛋白质展开。安基林重复线平均轮廓长度约为 10.5 纳米，展开力在 8 到 25 个皮科内托恩斯之间。
使用多蛋白至关重要，因为侧翼蛋白的展开事件为单个分子事件提供了指纹的正控制。如果没有这一点，数据很容易被误解。
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概述
本文详述了使用原子力显微镜测量单个蛋白分子的机械性质和展开路径的程序。它通过单分子力谱学提供了关于蛋白质稳定性和展开速率的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 分子生物学
- 单分子技术
背景
- 单分子力谱学允许操纵个别分子。
- 原子力显微镜是这些测量的关键工具。
- 理解蛋白质力学对于洞察生物过程至关重要。
- 获得的数据可以提供蛋白质稳定性和展开机制的信息。
研究目的
- 展示蛋白质机械性质的测量。
- 说明单个蛋白分子的展开路径。
- 为良好的单蛋白记录提供参考。
使用的方法
- 使用原子力显微镜进行恒定速度测量。
- 使用粘合标签和玻璃片准备样品。
- 在洁净条件下存储准备好的片片。
- 分析数据以确定蛋白质稳定性和展开速率。
主要结果
- 成功测量单个蛋白分子的力学性质。
- 确定展开路径和速率。
- 提供代表性结果以进行方法验证。
- 对分子水平蛋白质稳定性的见解。
结论
- 原子力显微镜有效用于研究单个蛋白质力学。
- 数据可以显著增强对蛋白质行为的理解。
- 该方法为未来的单分子研究提供了指导。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule force spectroscopy using atomic force microscopy (AFM) enables direct quantification of protein mechanical stability and unfolding pathways, providing mechanistic insight not accessible through bulk assays. This capability is critical for de-risking early-stage target validation and informing predictive models of protein behavior under physiological stress. Integrating AFM-based measurements into discovery workflows enhances confidence in target selection and supports risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly quantifies protein stability and unfolding rates at the single-molecule level.
- Enables mechanistic de-risking by revealing high-energy conformational states.
- Supports functional target validation through precise measurement of unfolding events.
- Improves predictive confidence in target selection by clarifying folding pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mechanical fingerprints for protein constructs used in downstream assays.
- Facilitates reproducible, quantitative readouts for assay standardization.
- Enables robust comparison of protein variants or engineered constructs.
- Supports screening readiness by confirming assay system integrity at the molecular level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein misfolding or instability.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular mechanics to functional outcomes.
- De-risks translational advancement by confirming mechanistic hypotheses in physiologically relevant conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based force spectroscopy fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on protein folding and stability mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical readouts for assay qualification.
- Analytics: Provides force-extension curves and contour length measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular biophysics with preclinical model selection when protein misfolding is implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse protein targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule measurements for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and single-molecule data analysis.
- Demands specialized instrumentation and calibration protocols.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data comparability.
- Adaptation may be needed for different protein constructs or buffer conditions.
- Interpretation depends on robust positive controls to avoid data misattribution.
