原子力显微镜对单蛋白质分子的力谱

单分子力光谱学可以让我们用力操纵单个分子，从而在原子尺度上为分子生物学提供巨大的见解。在这里，我们使用原子力显微镜演示恒定速度测量。我们最终可以使用这些数据来确定蛋白质的稳定性、展开速率和展开路径。

要开始该步骤，请将非导电胶粘剂卡舌连接到干净、15 毫米宽的铁盘上。取下盖板，将清洁、未涂覆或镀金的玻璃滑轨牢固地压在外露胶粘剂上。将幻灯片存放在干净、有盖的培养皿中。

接下来，将纯化的多蛋白浓缩在离心过滤器中，然后反转柱，将蛋白质放入缓冲液中，用于实验。根据280纳米的吸光度确定适当的蛋白质浓度，然后准备100微升的100微升每毫升蛋白质溶液。将蛋白质溶液的 60 微升滴涂抹在幻灯片的中心。

注意不要让液体在幻灯片和铁盘之间滑动，因为这将导致在实验过程中不受控制的样品运动。让样品在室温下至少坐10分钟。首先，小心地拿起悬臂，放在探针保持单元中。

确保悬臂牢固地固定。然后将保持单元放在 AFM 头中。将头部置于倒置显微镜舞台上，将电池组连接到 AFM 头，为激光供电。

为显微镜探测器设置摄像机，以在监视器或电视屏幕上显示激光。在显微镜的引导下，将激光定位到悬臂尖端。样品准备就绪后，将实验缓冲液的 10 微升刷新到探针保持单元的每个端口中。

从样品幻灯片中抽取约 40 微升液体，并添加 40 微升缓冲液。同时，开始准备原子力显微镜进行测量。首先，将幻灯片放在压电电机上方的磁铁上。

确认 AFM 级处于提升位置，然后将 AFM 头与悬臂放在样品液滴上方的舞台上。接下来，在 AFM 光电二极管前面放置一张小纸。调整激光，直到纸张上的斑点明亮且聚焦，然后取出纸张。

启动 AFM 软件以查看来自光电二极管的信号。调整 AFM 头镜，使激光信号在所有四个光电二极管象限中最大化，顶部和底部象限对之间的不同信号为零。要开始校准 AFM，请将 AFM 头信号的滤波器设置设置为全带宽，并确保压电已关闭。

在 AFM 软件中，测量功率谱的 512 个计算平均值，每个计算有 1，024 个数据点。将功率光谱密度集成在第一个峰值上，对应于悬臂的主要振动模式。接下来，打开压电控制器，将过滤器设置为 500 赫兹。

在监控不同信号的同时，快速将 AFM 头向下移动几百微米。继续一次将头部向下移动几百微米，同时观察不同信号中的一致跳跃。当信号跳跃开始高度增加时，尖端非常接近样品表面。

一旦偏转信号在尖端与表面接触时饱和，稍微抬起头部，然后调整压电电压，使 AFM 磁头向上或向下移动 100 到 5，000 纳米以找到样品表面。之后，进行一个拉拔实验，扫描大小约为500纳米，使尖端接触表面，或约100纳米的压电电机运动。使用结果计算弹簧常数和灵敏度。

在软件中，将扫描大小设置为比展开的多蛋白的总理论大小大 40%。放置悬臂，使悬臂的扫描尺寸从表面的 80% 。将扫描速度设置为 300 纳米/秒。

执行拉力实验并测量生成的压电位置和光电二极管信号。在整个测量过程中每小时向流体细胞添加实验缓冲液，防止样品干燥。I91多蛋白和多蛋白的录音中的展开事件，其中三个 I91 域在每侧NI10C分子的两侧，都装有蠕虫一样链模型。

两个记录均显示 I91 的特征力和轮廓长度增量，表明 AFM 校准成功。含有N110C分子的多蛋白的录音显示，I91事件足以证实新事件来自感兴趣的蛋白质展开。安基林重复线平均轮廓长度约为 10.5 纳米，展开力在 8 到 25 个皮科内托恩斯之间。

使用多蛋白至关重要，因为侧翼蛋白的展开事件为单个分子事件提供了指纹的正控制。如果没有这一点，数据很容易被误解。