使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱学研究

单分子力谱技术通过施加外力操控单个分子，能够在原子尺度上为分子生物学提供极为深入的见解。在此，我们展示了利用原子力显微镜进行的恒定速度测量。最终，我们可以利用这些数据确定蛋白质的稳定性、去折叠速率以及去折叠路径。

开始操作时，将一个非导电的粘性标签贴到一个洁净的、15毫米宽的铁盘上。揭去覆盖膜，将一块洁净的、未镀层或镀金的玻璃载玻片牢固地压在暴露的粘性表面上。将载玻片存放在洁净且加盖的培养皿中。

接下来，使用离心过滤器浓缩纯化的多聚蛋白，然后反转柱子，将蛋白洗脱至实验所用缓冲液中。根据280纳米处的吸光度确定合适的蛋白浓度，随后配制100微升浓度为100微克/毫升的蛋白溶液。取60微升该蛋白溶液滴加至载玻片中央。

注意不要让液体渗入载玻片和铁盘之间，否则会在实验过程中导致样品不受控地移动。将样品在室温下静置至少10分钟。首先，小心地捏住悬臂的末端，将其放入探针固定槽中。

确保悬臂梁牢固就位。然后将持样细胞放入原子力显微镜（AFM）探头中。将探头置于倒置显微镜载物台上，并将电池组连接至AFM探头以启动激光器。

为显微镜探测器设置摄像头，以便在显示器或电视屏幕上观察激光光束。在显微镜引导下，调整激光位置，使其照射到悬臂探针尖端。样品准备就绪后，向探针固定池的每个通道中注入10 µL实验缓冲液。

从样品载玻片中倾倒约 40 微升液体，并加入 40 微升缓冲液。同时，开始准备原子力显微镜以进行测量。首先，将载玻片放置在压电马达上方的磁铁上。

确认原子力显微镜（AFM）载物台处于抬升位置，然后将AFM探头放置在载物台上，使悬臂位于样品液滴上方。接着，将一小片纸放在AFM光电二极管前方。调节激光，直到纸上的光斑明亮且聚焦，然后移除纸片。

启动原子力显微镜（AFM）软件以查看来自光电二极管的信号。调节AFM探头中的反射镜，使激光信号在四个光电二极管象限中均达到最大，且上下两对象限之间的信号差为零。开始校准AFM时，将AFM探头信号的滤波器设置为全带宽，并确保压电陶瓷处于关闭状态。

在原子力显微镜软件中，对每次包含 1,024 个数据点的计算，测量 512 次功率谱的平均值。对第一个峰对应的功率谱密度进行积分，该峰对应于悬臂梁的主要振动模式。接下来，打开压电控制器，并将滤波器设置为 500 赫兹。

在监测不同信号的同时，迅速将原子力显微镜（AFM）探头向下移动数百微米。每次向下移动数百微米，并观察不同信号是否出现稳定的跳跃。当信号跳跃的高度开始持续增加时，表明探针尖端已非常接近样品表面。

当探针与表面接触导致偏转信号饱和后，略微提升探针头，然后调节压电电压，使原子力显微镜（AFM）探针头上下移动100至5,000纳米以定位样品表面。随后，进行拉伸实验，扫描尺寸约为500纳米，使探针与表面接触，或压电马达行程约为100纳米。利用实验结果计算弹簧常数和灵敏度。

在软件中，将扫描尺寸设置为大于多结构域蛋白完全展开后理论总长度的40%。将悬臂定位在距离表面为扫描尺寸80%的位置。将扫描速度设置为每秒300纳米。

进行拉伸实验，测量相应的压电位置和光电二极管信号。在测量过程中每小时向流体池中添加实验缓冲液，以防止样品干燥。对I91多蛋白以及在NI10C分子两侧各由三个I91结构域包围的多蛋白的记录中的去折叠事件，均采用蠕虫状链模型进行拟合。

两次记录均显示出 I91 特有的力与轮廓长度增量，表明原子力显微镜的校准已成功。含有 N110C 分子的多蛋白记录显示出足够多的 I91 事件，证实新出现的事件来源于目标蛋白的解折叠。锚蛋白重复序列的平均轮廓长度约为 10.5 纳米，解折叠力介于 8 至 25 皮牛顿之间。

必须使用多聚蛋白，因为侧翼蛋白的解折叠事件可作为单分子事件的阳性对照，用于特征识别。若无此对照，数据容易被误读。