Name: 基于磁珠复合法的撕裂细胞因子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习使用磁珠复合法分析人眼泪液中的细胞因子谱，以研究其在眼部疾病中的作用。该方法仅需微量样本即可同时检测多种分析物，为眼科炎症研究提供高效工具。

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本研究工作得到了陈笃生医院个性化种子基金项目2015年中心资助、新加坡眼科研究所试点资助以及陈笃生医院基金申请资助的支持。

本研究中使用的方案已获得新加坡陈笃生医院机构审查委员会的批准。
1. 泪液细胞因子分析
<ol>
	<li>泪液采集：
	<ol>
		<li>让受试者舒适地坐在检查椅上，并将头部靠在头托上。</li>
		<li>让受试者向上看，小心打开Schirmer试纸条（由Whatman 41号滤纸制成），将试纸条的圆端置于眼睑下方穹窿处，并指示受试者闭眼5分钟。在采集泪液时，应尽量减少对眼表的接触。30</li>
		<li>让受试者睁开眼睛，取出试纸条并将其放入无菌的1.5 mL微量离心管中。立即将该管转移至实验室，或在检测细胞因子谱型前于-80o C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从泪液试纸条中洗脱泪液样本：
	<ol>
		<li>将泪液试纸条剪成0.5 cm长度（以标准化待测泪液量），并放入无菌的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入30 µL分析缓冲液，在室温下孵育5分钟，随后以14,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中，并丢弃试纸条。将含样本的管置于冰上，立即用于细胞因子谱型分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂准备： 
	注：每个样本通过基于微球的多重检测法测定的41种分析物包括：白细胞介素（IL）-1α、IL-1β、IL-Rα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12 p40、IL-12 p70、IL-13、IL-15、IL-17A、干扰素-α（IFN-α）2、IFN-γ、干扰素-γ诱导蛋白10（IP-10, CXCL10）、巨噬细胞来源趋化因子（MDC）、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α和MIP-1β、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、MCP-3、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、TNF-β、生长调节致癌蛋白（GRO）、肿瘤生长因子α（TGF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）-2、血小板源性生长因子（PDGF）-AA、PDGF-AB/BB、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）、fractalkine、可溶性CD40配体（sCD40L）、Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）以及活化后调节、正常T细胞表达和分泌蛋白（RANTES）。
	<ol>
		<li>将抗体微球溶液（50X）小瓶恢复至室温（20&#160;- 25 oC），并涡旋震荡1分钟。</li>
		<li>计算检测所需孔数，并计算检测所需的总抗体微球混合液量（每孔25 µL）及每种抗体微球溶液（50X）的用量。</li>
		<li>通过加入计算量的每种抗体微球溶液，并用剩余量的微球稀释液补足至最终体积，来制备混合液。确保混合液中每种抗体的终浓度为1X。为防止移液误差，应始终多准备至少20%的混合液体积。 
		注：例如，对于96孔检测，准备3000 µL抗体微球混合液。每种抗体微球溶液所需量 = 3000 / 各抗体微球溶液的储存浓度；3000 / 50 = 每种抗体微球溶液60 µL
		<ol>
			<li>将41种抗体微球溶液各取60 µL（60 × 41 = 2460 µL）加入混合瓶中，再向抗体微球混合物中加入540 µL微球稀释液，制成3000 µL的最终工作溶液（1X）。</li>
			<li>使用前充分混匀微球混合液。检测后，将剩余混合液于2-8 oC保存，可使用长达30天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向QC1和QC2标准品原液中各加入250 µL去离子水，以制备质控品（QC）。</li>
		<li>通过反复倒置数次并涡旋震荡10秒，充分混匀。将溶液转移至正确标记的聚丙烯微量离心管中，剩余溶液于-20 °C保存，可使用长达30天。</li>
		<li>将30 mL 10X洗涤缓冲液与270 mL去离子水混合，充分混匀，以制备洗涤缓冲液（稀释前将10X缓冲液恢复至室温，并通过混匀溶解所有盐类沉淀）。未使用的洗涤缓冲液（1X）于2-8 °C保存，可使用长达30天。</li>
		<li>向细胞因子标准品原液中加入250 µL去离子水，以制备人细胞因子标准品原液（所有分析物浓度为10,000 pg/mL）。反复倒置数次并涡旋震荡10秒，充分混匀。静置10分钟，将原液转移至正确标记的聚丙烯微量离心管中。检测后，将剩余溶液于-20 °C保存，可使用长达30天。</li>
		<li>用分析缓冲液对人细胞因子工作标准品进行5倍系列稀释（50 µL -&#62; 200 µL），获得2000、400、80、16和3.2 pg/mL的标准品。</li>
		<li>标准品制备完成后，应在60分钟内使用工作标准品，并以分析缓冲液作为空白/背景（-pg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于微球的多重检测法进行细胞因子谱型分析：
	<ol>
		<li>将所有试剂恢复至室温，并在加入96孔微孔板前涡旋震荡5-10秒。若洗脱的泪液样本在检测前于-80o C保存，则需在冰上解冻泪液提取物，并以1000 × g离心5分钟。</li>
		<li>按垂直排列方式准备检测工作表，包括人细胞因子工作标准品[0（空白）、3.2、16、80、400、2,000和10,000 pg/mL]、QC1、QC2及样本。</li>
		<li>向板的每孔中加入200 µL 1X洗涤缓冲液，用板封膜密封，并在室温（20-25 oC）下于板式摇床上孵育10分钟。</li>
		<li>将板倒置，倾去1X洗涤缓冲液，并在吸水纸上轻拍数次，以去除孔中残留的洗涤缓冲液。</li>
		<li>向相应孔中分别加入25 µL每种人细胞因子工作标准品、QC1、QC2、空白（分析缓冲液）及样本。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL分析缓冲液。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL 1X抗体微球混合液。由于抗体微球溶液对光敏感，需用板封膜密封板，并用铝箔包裹，以在检测过程中避光。</li>
		<li>将板置于4 oC摇床上过夜孵育。</li>
		<li>将板置于自动磁力板式洗涤器的板架上。静置1分钟，使磁珠沉降至孔底，然后吸去孔内液体。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，静置1分钟后吸去孔内液体。重复洗涤一次（板洗涤操作请遵循试剂盒制造商的说明）。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL检测抗体溶液，密封板，用铝箔包裹，并在摇床上室温孵育60分钟。</li>
		<li>向每孔中加入25 µL链霉亲和素-藻红蛋白溶液，密封板，用铝箔包裹，并在摇床上室温孵育30分钟。</li>
		<li>将板置于磁力板式洗涤器上。静置1分钟后吸去孔内液体。每孔加入200 µL洗涤缓冲液，静置1分钟后吸去孔内液体。重复洗涤一次。</li>
		<li>向每孔中加入150 µL鞘液，并将板置于摇床上室温振荡5分钟，以重悬抗体微球。</li>
		<li>立即使用基于微球的多重检测板式读数仪读取数据，并采用五参数曲线拟合算法分析细胞因子浓度。泪液细胞因子谱型分析的示意图见图1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测板读取（仪器设置）与数据分析：
	<ol>
		<li>开启基于微球的多重检测读数仪，并预热激光30分钟。</li>
		<li>启动基于微球的多重检测软件。在“自动维护”选项卡下，选择“校准-验证”选项。将校准和验证微球的每种试剂小瓶涡旋震荡30秒。将每种试剂各取5滴加入指定孔中。向指定储液槽中加入去离子水和70%乙醇。</li>
		<li>创建新方案
		<ol>
			<li>打开“方案”页面，然后点击“方案”选项卡。点击&#34;创建新方案&#34;；“设置”选项卡将打开。</li>
			<li>在“名称”框中输入方案名称。</li>
			<li>在“名称”框右侧的框中输入方案描述。</li>
			<li>在“版本”框中输入方案版本。</li>
			<li>在“制造商”框中输入该方案的制造商信息。</li>
			<li>在“采集设置”部分定义设置如下：设“体积”：100 µL，“超时”：60 s；“DD门控”：8,000至15,000；“报告增益”：标准PMT；“微球类型”：磁性微球。</li>
			<li>在“分析设置”部分定义设置，选择“定量”作为分析类型。设“标准品数量”：6；“对照品数量”：0；勾选“重复均值”框； 
			勾选“在采集样本时分析结果”框。</li>
			<li>点击&#34;下一步&#34;；“分析物”选项卡打开，在编号的分析物网格中点击所需的分析物（微球ID）。</li>
			<li>在分析物网格右侧的“名称”列中点击并输入相应的分析物名称（分析物名称及其对应的微球区域详情见表1）。</li>
			<li>在“应用全部”按钮左侧的“单位”框中点击并输入所需的测量单位（即 pg/mL）。然后点击&#34;应用全部&#34;。</li>
			<li>在“计数”框中点击并输入每种分析物所需的微球计数（即 50）。点击&#34;应用全部&#34;。</li>
			<li>点击&#34;下一步&#34;；“板布局”选项卡打开。高亮标准品孔，并在重复计数下选择&#34;2&#34;，然后点击&#34;S&#34;标准品按钮。对空白&#34;B&#34;和样本&#34;U&#34;孔重复此步骤。</li>
			<li>点击&#34;保存&#34;。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>创建新的标准品/对照品批次
		<ol>
			<li>打开“方案”页面，然后点击“标准品 &amp;#38; 对照品”选项卡。点击&#34;创建新的标准品/对照品批次&#34;。</li>
			<li>打开“选择方案”框。选择在步骤1.5.3中创建的方案。</li>
			<li>相应输入标准品信息：标准品/对照品试剂盒编号、名称、有效期和制造商。</li>
			<li>输入每种分析物最高标准品的数值（即 10000 pg/mL）。在稀释倍数中输入5，然后点击&#34;应用全部&#34;，以自动生成其余标准品的预期浓度。</li>
			<li>点击&#34;保存&#34;。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从现有方案创建新批次
		<ol>
			<li>打开“批次”页面，点击&#34;从现有方案创建新批次选项卡&#34;。</li>
			<li>在“批次名称”框中输入批次名称，并在“输入可选描述”框中输入批次描述。</li>
			<li>点击之前生成的方案（在步骤1.5.3中）。</li>
			<li>点击&#34;下一步&#34;；下一个打开的选项卡为“标准品 &amp;#38; 对照品”选项卡。查看检测标准品的详细信息，并选择&#34;下一步&#34;。</li>
			<li>在“板布局”选项卡上，为此批次分配孔命令，并点击&#34;保存&#34;，将批次信息保存至“待处理批次”列表。</li>
			<li>将板放入基于微球的多重检测板式读数仪中，振荡5分钟，并从待处理批次列表中运行该批次。获取的数据将以.csv文件格式保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用rbx转换软件，将基于微球的多重检测软件生成的.csv文件转换为.rbx文件（结果数据文件）格式。启动转换软件，选择“选择xPONENT文件(s)”下的.csv文件，点击&#34;生成&#34;按钮；.rbx文件将保存在选定的输出文件夹中。</li>
		<li>启动分析软件并打开.rbx文件。</li>
		<li>使用4PL/5PL曲线拟合优化标准曲线。
		<ol>
			<li>在“标准曲线”选项卡中选择以下设置：“回归类型”：“Logistic-5PL”；“坐标轴变换”：“Log(x) - Linear(y)”；勾选“显示浓度范围线”框；勾选“显示未知样本”框；勾选“显示对照样本”框；勾选“应用于所有分析物”框；勾选“优化后显示报告”框。</li>
			<li>点击&#34;优化&#34;按钮进行自动优化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在“输入样本信息”选项卡下标注样本标识。</li>
		<li>在“报告表”选项卡中获取观测浓度，并点击&#34;导出报告表&#34;生成电子表格文件，用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。无财务利益或利益冲突。

细胞因子是一类由细胞分泌的小分子蛋白质，具有强大的免疫调节功能，可调控免疫反应。32 泪液样本中多种细胞因子的表达谱与眼部多种病理状态相关，对细胞因子谱的研究有助于理解疾病发病机制、判断眼表健康状况、疾病严重程度、诊断及进展过程。2,5 传统方法面临的主要挑战是蛋白浓度较低和样本体积较小，这限制了ELISA等检测方法在泪液细胞因子谱分析中的应用。33 基于微球的多重检测技术是一种免疫分析方法，相较于ELISA具有显著优势。该技术仅需少量样本即可同时分析多种分析物，且灵敏度高，能够检测生物液体中皮克水平的蛋白质浓度。34
本文报道了一种利用基于微球的多重检测技术对健康人泪液中41种细胞因子进行定量分析的标准化方案。在该检测面板包含的41种细胞因子中，基于微球的多重检测技术可在泪液样本中检测到40种，而未能检测到MIP-1α。该...

泪液由泪腺和副泪腺产生，覆盖在眼球的外表面。泪膜由外层的脂质层和内层的水样层组成，其中水样层包含可溶性蛋白质、黏蛋白以及膜结合型黏蛋白。泪液可防止微生物侵袭、提供营养，并为眼表提供润滑作用。泪液还在空气与组织之间形成界面，促进氧气向角膜的传输。1 泪膜的成分包括蛋白质、碳水化合物、脂质和电解质。多项研究已发现，泪液蛋白质与青光眼、干眼症、春季结膜炎、糖尿病、甲状腺相关性眼病及癌症等眼部和全身性疾病之间存在关联。2,3,4 泪液样本可通过微毛细管或泪液采集条（Schirmer条）收集。此外，Schirmer试验是角膜与屈光手术门诊中的常规检查方法，其结果可用于细胞因子分析实验。由于泪液样本采集无创、生物样本易于获取，且泪液成分与多种生理和病理状态密切相关，因此泪膜被认为是多种眼部和全身性疾病的潜在生物标志物来源。4,5,6
泪液细胞因子在研究眼表健康及各种眼病的炎症状态中起着重要作用。7 已有报道指出，泪液样本中多种细胞因子浓度异常与干眼病、春季角结膜炎（VKC）、特应性角结膜炎（AKC）、季节性过敏性结膜炎以及葡萄膜炎相关。8,9,10,11,12,13 泪液蛋白可通过传统方法进行分析，如质谱法、蛋白质印迹法和酶联免疫吸附测定（ELISA）。14,15 然而，这些方法的局限性在于灵敏度较低，且需要较大体积的样本，难以实现每位患者泪液中多种细胞因子的同时分析。16,17 基于微球的多重检测技术已被开发用于复杂混合样本中多种分析物的检测，并已成功应用于泪液样本，以在不同疾病中分析多种细胞因子。6,18 结合夹心ELISA与流式细胞术的技术使这些检测方法在单一样本中对多种分析物的定量检测灵敏度高于传统ELISA。19 该方法可应用于多种临床样本及细胞培养上清液，有助于研究多种病理生理条件下免疫应答的变化。20,21,22,23,24
已有若干研究对基于微球的多重检测法与ELISA进行了比较，并报道了两种方法之间存在相关性。Loo 等 比较了基于微球的多重检测法与传统ELISA在人血清或血浆样本中检测脂联素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、瘦素（leptin）和饥饿素（ghrelin）的效果，报道两种方法间具有强相关性（r&#62;0.9）25。Dupont 等 报道，在检测来自孕妇的植物血凝素和脂多糖刺激的全血样本中的IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-ϒ和TNF-α时，基于微球的多重检测法与ELISA之间也存在强相关性26。Pickering 等 报道了基于微球的多重检测法与ELISA在检测血清中针对b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza type b）多糖（r=0.96）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）类毒素（r=0.96）以及白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）类毒素（r=0.91）的抗体时，同样具有强相关性27。Biagini 等 报道，基于微球的多重检测法与ELISA在检测血清样本中炭疽杆菌（Bacillus anthracis）抗保护性抗原IgG时具有高度正相关性（r=0.852）28。Wang 等 报道，在脑脊液样本中检测阿尔茨海默病生物标志物——淀粉样蛋白-β 42（r=0.77）、总tau蛋白（r=0.94）以及181位氨基酸磷酸化的tau蛋白（r=0.82）时，基于微球的多重检测法与ELISA之间也存在相关性29。这些研究证明了基于微球的多重检测法适用于多种临床样本，所需样本量较小，且与标准ELISA具有良好的相关性，使其成为传统ELISA方法在不同类型样本中检测多种分析物的有力替代方案，尤其适用于不同疾病表型的研究。本文中，我们描述了一种标准化的基于微球的多重检测法操作流程，用于使用Schirmer试纸从健康受试者采集的泪液样本中进行41种分析物的细胞因子谱分析。

<table><tbody><tr><td>Milliplex MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠面板-1 试剂盒</td><td>美国默克公司</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Luminex 仪器&amp;nbsp;</td><td>Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xPonent 软件&amp;nbsp;</td><td>Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBXGenerator 软件</td><td>BIO-RAD，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平板振荡器</td><td>美国康宁公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>帝肯酶标洗板机</td><td>Tecan，瑞士</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>美国 Scientific Industries 公司</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Mettler Toledo，加利福尼亚州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Axygen，美国</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Schirmer 泪液分泌试验试纸条</td><td>眼科护理与治疗，美国</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D 校准试剂盒</td><td>Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D 验证试剂盒</td><td>Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr><td>眼科检查椅</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于微球的多重检测法用于分析泪液细胞因子谱

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

泪膜是由覆盖在眼球外表面的脂质、蛋白质和矿物质组成的复杂混合物，可为下方细胞提供润滑、营养和保护。泪液分析是识别多种眼表疾病生物标志物以进行预测、诊断和预后的新兴研究领域。泪液易于获取，且采集过程无创。因此，随着技术的进步，越来越多的研究致力于在泪液中鉴定多种分析物，以研究蛋白质或代谢物组成的变化及其与病理状态的关联。泪液中的细胞因子是研究眼表健康状况的理想生物标志物，也有助于理解干眼症和春季性结膜炎等不同类型眼表疾病的发生机制。基于微球的多重检测技术能够在少量样本中高灵敏度地同时检测多种分析物。本文介绍了一种标准化的泪液样本采集、提取及利用基于微球的多重检测方法进行细胞因子谱分析的实验方案。

使用泪液流量试纸从4名健康男性受试者的8只眼睛中采集泪液样本，并采用上述方案分析细胞因子水平。4名受试者的年龄分别为36岁、42岁、44岁和52岁。根据2007年国际干眼研讨会（International Dry Eye Workshop）指南，通过临床检查（包括泪膜破裂时间、Schirmer试验、角膜染色、结膜染色、眼睑/睑板腺检查、角膜泪液征象以及视觉症状和体征）评估眼表健康状况及干眼病情况，所有受试者均未表现出任何干眼病的体征或症状。31
在分析的41种细胞因子中，有31种细胞因子在所有泪液样本中均被检测到；IL-17A、MIP-1β和TNF-α在4名受试者的7只眼中被检测到；IL-4在4名受试者的6只眼中被检测到；IFN-γ在3名受试者的6只眼中被检测到；IL-1A在3名受试者的5只眼中被检测到；eotaxin和IL-9在2名受试者的3只眼中被检测到；IL-3在1只眼中被检测到，而MIP-1α在任...

泪膜细胞因子分析有助于研究多种眼部疾病。基于微球的多重检测方法操作简便、灵敏度高，能够在少量样本中同时检测多个靶标。本文介绍了一种利用基于微球的多重检测技术进行泪膜细胞因子谱分析的实验方案。

泪膜是由脂质、蛋白质和矿物质组成的复杂混合物，覆盖于眼球的外表面，从而提供润滑、营养和……

本实验方案的总体目标是利用基于微球的多重检测技术，研究通过Schirmer试纸采集的人类泪液样本中的细胞因子谱。该方法有助于解答眼科领域的一些关键问题，例如细胞因子在各种眼表疾病中的作用。该技术的主要优势在于，可在较小样本体积下同时检测多种分析物。演示该操作的是我实验室的博士后 Praveen Balne。根据文本方案采集受试者的泪液后，将泪液采集条剪成 0.5 厘米长，放入无菌的 1.5 毫升微量离心管中。加入 30 微升检测缓冲液，室温孵育 5 分钟。然后在14,000 × g条件下离心1分钟。将上清液转移至另一个1.5毫升微量离心管中，并弃去条带。随后将含有样品的管置于冰上，并立即使用洗脱的泪液样品进行细胞因子谱分析。进行基于微球的多重检测时，将所有试剂恢复至室温，并涡旋振荡5到10秒。若洗脱的泪液样本在检测前保存于-80摄氏度，需在冰上解冻冻存的泪液提取物，并以1,000 × g离心5分钟。为人类细胞因子标准品QC-1、QC-2及样本准备一份垂直排列的检测工作表。向板的每个孔中加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液，并用板封膜密封。然后在室温下将板置于板式摇床上孵育 10 分钟。接着将板倒置倾倒去除 1× 洗涤缓冲液，并多次轻拍至吸水纸上，以除去孔中残留的洗涤缓冲液。然后向相应的孔中加入每种工作浓度的人细胞因子标准品 QC-1、QC-2、仅含检测缓冲液的空白孔以及样品，各 25 微升。每孔加入 25 微升检测缓冲液。随后，向各孔加入 25 微升 1X 抗体磁珠混合溶液。由于抗体磁珠溶液对光敏感，需密封反应板，并用铝箔和板盖包裹，以在实验过程中避光。将反应板置于4°C摇床上过夜孵育。次日，将反应板放置于自动磁性板洗涤仪的板架上，静置1分钟，使磁珠在孔底部沉降。使用自动磁力板洗涤仪吸出孔内液体，每孔加入 200 微升洗涤缓冲液。静置 1 分钟后，如前所述吸出孔内液体，并重复洗涤一次。每孔加入 25 微升检测抗体溶液。用封板膜封住板孔，盖上铝箔和板盖，在室温下置于摇床上孵育60分钟。然后每孔加入25 µL链霉亲和素-藻红蛋白溶液，密封并覆盖板后，在室温下置于摇床上继续孵育30分钟。孵育结束后，将板置于磁力板洗涤器上，静置1分钟。然后吸去孔内液体，每孔加入200 µL洗涤缓冲液。静置1分钟后，吸去孔内液体，再重复洗涤一次。向每个孔中加入150微升鞘液。然后将板置于摇床上，在室温下振荡5分钟，以重悬抗体珠，随后进行板读数并分析细胞因子浓度。根据文本方案读取检测板时，打开批次页面，点击从现有方案创建新批次选项卡。在批次名称框中输入批次名称，并在“输入可选描述”框中输入关于该批次的描述。点击先前生成的方案，然后点击下一步。接下来打开的标签页为标准品与对照品标签页。查看检测标准的详细信息，然后选择下一步。在“板布局”选项卡下，为该批次分配孔位指令，然后单击保存，将批次信息保存至待处理批次列表中。将板加载到基于微球的多重检测板读数仪中，并从待处理批次列表中运行该批次。启动 RBX 转换软件，在选择指数文件处，选择由基于微球的多重检测软件生成的 csv 文件。然后单击生成按钮。一个 rbx 文件将被保存在选定的输出文件夹中。现在，启动分析软件并打开 rbx 文件。然后使用 4PL-5PL 曲线拟合方法优化标准曲线。为优化标准曲线，请在标准曲线选项卡中选择以下参数：回归类型为 logistics 5PL，坐标轴转换方式为 log X、linear Y。接着勾选以下选项：显示浓度范围线、显示未知样品、显示对照样品、应用于所有分析物，以及优化后显示报告。单击优化按钮以进行自动优化。在“输入样本信息”选项卡中，标注样本的标识。最后，在“报告表格”选项卡中获取观测到的浓度，并单击“导出报告表格”以将数据生成电子表格文件，用于进一步分析。采集了四名年龄在36至52岁之间的健康男性共八只眼睛的泪液样本。使用基于微球的多重检测方法分析了41种细胞因子，其中31种在所有泪液样本中均被检出。例如，IL-17A、MIP-1b和TNFa在四名受试者的七只眼睛中被检出，而IL-4在四名受试者的六只眼睛中被检出。此外，在3名受试者的6只眼睛中检测到干扰素γ。在3名受试者的5只眼睛中检测到白细胞介素-1α。在2名受试者的3只眼睛中检测到嗜酸性粒细胞趋化因子和白细胞介素-9。在一只眼睛中检测到白细胞介素-3，而在所有样本中均未检测到MIP-1a。该散点图展示了所检测到的41种细胞因子的平均浓度及其标准差。白细胞介素-1ra在所有样本中均高表达。趋化因子 IP-10、GRO、MCP-1、PDGF-AA、Fractalkine、白细胞介素-a、EGF、PDGF-BB、VEGF 和 G-CSF 也在纳克/毫升水平高度表达，其余细胞因子则在皮克/毫升水平表达。如图所示，泪液细胞因子中检测到的最低浓度为 TNF-a，其均值±标准差为 27.25±19.97 皮克/毫升。在所有样本中均检测到的 31 种细胞因子中，通过 T 检验分析，左右眼之间的浓度均无统计学显著差异。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 1.5 天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何开展基于微球的多重检测以进行泪液细胞因子谱分析。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于磁珠复合法的撕裂细胞因子分析

本视频展示了一种基于微球的多重检测方法，用于分析人泪液中的细胞因子。该方法能够对单一样本中的多种细胞因子进行同时检测，显著提高了灵敏度，有助于研究各种病理生理条件下免疫反应的变化。...

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本视频展示了一种基于微球的多重免疫检测试验，用于定量样本中多种细胞因子靶标。该方法使用一组与细胞因子特异性抗体偶联的不同微球，以结合样本中存在的细胞因子。通过生物素标记的检测抗体，将链霉亲和素标记的报告分子固定在已结合的细胞因子上。流式细胞术根据微球的独特大小和内部荧光强度来识别已结合的细胞因子，而报告分子的荧光强度则反映细胞因子的数量。...

一种基于微球的多重免疫检测法用于定量多种细胞因子靶标

我们介绍一种利用多重微球抗体阵列对唾液蛋白质进行分析的方法。采用碳二亚胺化学法将单克隆抗体共价连接至荧光染料编码的4.5...

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一种用于液相色谱-串联质谱泪液蛋白质组学分析的蛋白质悬浮液捕获样品制备方法

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本方案描述了一种优化的酶联免疫吸附测定法（ELISA），用于检测和定量通过微毛细管采集的人类泪液中的17β-雌二醇和睾酮。该方法可实现对泪液激素水平的微创测量。...

利用酶联免疫吸附测定法检测人泪膜中的性激素

学习使用磁珠复合法分析人眼泪液中的细胞因子谱，以研究其在眼部疾病中的作用。该方法仅需微量样本即可同时检测多种分析物，为眼科炎症研究提供高效工具。

基于微球的多重检测法用于分析泪液细胞因子谱

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