腺相关病毒对大鼠的静脉管理方法和技巧及中枢神经系统转导的评价

这种腺相关病毒载体基因转移的总体目标是在广泛的范围内对大鼠的大脑和脊髓进行基因纵。这种方法可以帮助回答基因转移领域的关键问题。这是一种非常有效的体内引入基因的方法，因此，这是一种非常强大、非常通用的技术。

该程序既快速又高度可重复。我们在几篇出版物中使用了这种大规模的基因转移方法在整个大鼠脊髓中表达肌萎缩侧索硬化症相关蛋白。我的同事 Robert Dayton 将演示该程序。

Mychal Grames 将协助 Robert。首先准备工作站，首先，用 70% 乙醇清洁表面。然后在工作区域放置一个加热垫，并将其加热至 37 摄氏度。

将长凳垫放在加热垫的顶部。检查是否有足够的氧气和异氟醚进行手术。用 70% 乙醇清洁感应室和麻醉面罩，并将麻醉面罩放在工作台垫上。

确保手头有以下物品，每只动物一个约 5 x 5 厘米的石蜡膜方块，每只动物一个酒精制备垫和两个或三个纱布垫，移液器吸头和一个微量移液器。然后，在室温下解冻载体，并为每只动物标记一个无菌微量离心管。将所需体积的 AAV 移液到适当的试管中，并用乳酸林格溶液或生理盐水将体积调至所需的注射体积。

旋样品 1 或 2 秒，然后脉冲离心 5 秒，将样品带到试管底部。将总注射体积从管中移出，移液到石蜡膜的正方形上。接下来，将 30 号针头放在 1 毫升注射器上。

将针头的斜面朝下放入石蜡膜上的载体中。向后拉注射器柱塞，直到所有病毒都进入针头和注射器中。使用麻醉系统对大鼠进行适当麻醉。

通过对脚趾捏没有反应来确保足够的麻醉平面。然后，将大鼠侧卧在工作区域，并使用鼻锥保持麻醉。老鼠侧卧时，一侧侧尾静脉应朝上。

注射位于尾部长度的三分之二处。用酒精制备垫擦拭注射部位。牢牢地将尾部保持在注射区域略上方，用一根手指直接放在尾部外侧静脉上，这将使静脉扩张。

斜面朝上，将针头与可见的尾静脉沿同一方向对齐。刺穿尾静脉的皮肤，同时非常小心地避免另一只手握住尾巴并按压尾静脉。释放尾静脉的压力以允许正常的血液流动。

然后将针头移入静脉。为确保针头刺穿了尾静脉，请稍微向后拉柱塞。如果针头在静脉中，血液会流入针头。

如果需要，重新定位针头后，将注射器的末端靠在尾部以稳定针头。以每秒约 20 微升的速度将载体缓慢注入尾部。在注射不良的情况下，动物只会被部分转导，结果可能没有用。

然而，通过实践，好的注射是非常可重复和可靠的。如果已经施用了载体，请从尾部取下针头，并将纱布垫压在注射部位，以帮助止血 30 至 60 秒。关闭异氟醚麻醉和氧气。

监测老鼠，直到它恢复意识，然后将其放回笼子里。将可能被 AAV 污染的材料丢弃到适当的生物危害容器中，并用 70% 乙醇清洁工作站。使用具有冷冻阶段的滑动切片机，从 AAV 注射动物的固定和冷冻保护大脑中获得 50 微米的冠状切片。

在 GFP 免疫染色并安装在载玻片上后，使用显微镜用低倍率镜头在确定的感兴趣区域对每个切片进行显微照片。保持所有要分析的样品的相机设置相同，并将数据保存为 TIFF 文件。在广泛使用的 Scion Image 程序中打开显微照片。

将打开两个窗口，关闭指示为索引颜色的窗口。选择 options（选项），然后选择 density slice（密度切片）。一系列阴影将在 Look up table （查找表） 窗口中以红色表示。

在窗口中，使用光标仅填写特定的 GFP 标签，并在图像中开始拾取非特异性背景时停止。接下来，单击 analyze 并设置 scale。第四行应该显示单位，从下拉列表中选择像素，然后单击确定。

要测量荧光面积，请单击 analyze（分析），然后单击 measure（测量）。然后，单击 analyze and show results。将出现一个结果窗口，荧光面积测量将位于标有 area 的标题下。

记录完所有测量值后，将每只动物的 3 到 6 个部分的值平均。使用适当的统计检验来比较各组之间的转导区域。该代表性图像显示了尾静脉注射 AAV 9 GFP 后 4 周大鼠小脑中的 GFP 免疫荧光。

使用图像分析软件选择性地突出显示荧光区域并量化突出显示的像素。这是来自未转导动物的 GFP 图像。使用与 GFP 注射动物相同的参数对该图像进行分析，确实检测到非常低水平的背景信号。

一旦掌握，每只大鼠可以在大约 5 分钟内完成注射。总之，这项技术描述了一种有效地将基因引入大鼠 CNS 的方法，一次性基因递送产生持久的表达和长期影响。最重要的是，中枢神经系统是从外围纵的。

一种相对无创的静脉内载体注射，到达大脑和脊髓，即 CNS。