腺相关病毒大鼠静脉注射方法及中枢神经系统转导效果评估的方法与技巧

腺相关病毒载体基因转移的总体目标是在大范围基础上对大鼠的脑和脊髓进行遗传学操控。该方法有助于回答基因转移领域中的关键问题。它是一种在体内高效导入基因的方法，因此是一种非常强大且极具通用性的技术。

该操作既快速又具有高度可重复性。我们已在多篇论文中采用这种大范围基因转导方法，在大鼠脊髓内广泛表达与肌萎缩侧索硬化相关的蛋白。我的同事 Robert Dayton 将演示该操作过程。

Mychal Grames 将协助 Robert。首先准备工作站，先用 70% 乙醇清洁台面，然后在工作区域放置一个加热垫，并将其温度设置为 37 °C。

在加热垫上放置一个实验台垫。检查氧气和异氟烷是否充足，以确保手术过程的需要。用70%乙醇清洁诱导室和麻醉面罩，并将麻醉面罩放在实验台垫上。

确保准备好以下物品：每只动物准备一块约 5 x 5 厘米的石蜡膜方片、一个酒精消毒片以及两至三个纱布垫，每只动物还需准备移液器吸头和微量移液器。随后，在室温下解冻载体，并为每只动物标记一个无菌微量离心管。将所需体积的 AAV 移入相应的管中，并用乳酸林格液或生理盐水补足至目标注射体积。

涡旋振荡样品一到两秒后，短暂离心五秒，使样品沉降至管底。用移液器将全部注射体积的样品从管中移出，滴加到一片石蜡膜上。接着，在1毫升注射器上安装一根30号针头。

将针头斜面朝下插入石蜡膜上的载体中。回抽注射器活塞，直至所有病毒进入针头和注射器内。使用麻醉系统对大鼠进行适当麻醉。

通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度足够。然后将大鼠侧卧置于操作区域，通过鼻罩维持麻醉。当大鼠侧卧时，应使一侧尾静脉朝上。

注射部位位于尾部长度的三分之二处。用酒精消毒棉片擦拭注射部位。紧握尾部注射区域稍上方，一指直接按压在尾侧静脉上，以使静脉扩张。

针头斜面朝上，将针头与可见的尾静脉方向对齐。刺入尾静脉上方的皮肤，同时需格外小心，避免刺伤另一只手所握住的尾部以及压迫尾静脉。松开对尾静脉的压力，以恢复正常的血流。

然后将针头插入静脉。为确认针头已刺入尾静脉，轻轻回抽针栓。如果针头位于静脉内，血液会流入针头中。

必要时重新调整针头位置后，通过用手将注射器末端抵住尾巴来稳定针头。以每秒约 20 µL 的速度缓慢将载体注入尾部。若注射效果不佳，动物将仅部分被转导，实验结果可能无意义。

然而，经过练习，良好的注射操作具有很高的可重复性和可靠性。如果载体已注射完毕，将针头从尾部拔出，并用纱布按压注射部位30至60秒，以帮助止血。关闭异氟烷麻醉气体和氧气。

监测大鼠直至其恢复意识，然后将其放回笼中。将可能被腺相关病毒（AAV）污染的材料弃置到适当的生物危害容器中，并用70%乙醇清洁工作台。使用带冷冻台的滑动式切片机，从已固定并经冷冻保护的AAV注射动物脑组织中获取50微米厚的冠状切片。

在对GFP进行免疫染色并封片后，使用显微镜的低倍物镜对每个切片在预定义的兴趣区域内拍摄显微照片。所有待分析样本的相机设置应保持一致，并将数据保存为TIFF文件。在广泛使用的Scion Image程序中打开显微照片。

将打开两个窗口，关闭标记为“index color”的窗口。选择“options”，然后选择“density slice”。在查找表窗口中，一系列色阶将以红色标示。

在窗口中，使用光标仅填充特定的 GFP 标记，当图像中开始出现非特异性背景时即停止。接下来，点击“analyze”（分析）并设置比例尺。第四行应显示“units”（单位），从下拉列表中选择“pixels”（像素），然后点击“okay”（确定）。

为测量荧光面积，请点击“分析”，然后点击“测量”。接着点击“分析”并选择“显示结果”。此时将出现一个结果窗口，荧光面积的测量值位于标有“面积”的标题下方。

记录完所有测量数据后，计算每只动物三个至六个切片区域的平均值。采用适当的统计学方法比较各组之间的转导区域。此代表性图像显示了大鼠小脑中 GFP 的免疫荧光结果，该结果来自尾静脉注射 AAV9-GFP 后四周的组织样本。

使用图像分析软件选择性地突出显示荧光区域，并对突出显示的像素进行定量。此图为未转导动物的GFP图像。采用与GFP注射动物相同的参数分析该图像时，确实检测到极低水平的背景信号。

一旦掌握，每只大鼠的注射操作可在约五分钟内完成。总之，该技术描述了一种高效将基因导入大鼠中枢神经系统的方法，单次基因递送即可实现持久表达和长期效应。最重要的是，该方法通过外周途径对中枢神经系统进行干预。

一种相对无创的静脉注射载体方法，可到达脑和脊髓，即中枢神经系统（CNS）。