Name: 高级共焦显微镜技术研究 DNA 损伤的蛋白质-蛋白质相互作用和动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解使用UVA激光微照射技术诱导DNA损伤并观察蛋白质招募的方法。该技术可在活细胞中研究DNA修复机制，同时保持正常细胞周期进程，为癌症生物学和细胞损伤响应研究提供重要见解。

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本工作由捷克共和国科学基金会项目 P302-12-G157 资助。实验还得到了捷克-挪威研究计划 CZ09 的支持，该计划由挪威基金监管，并获得捷克共和国教育、青年和体育部资助（资助编号：7F14369）。

<ol><li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+damage+to+cellular+DNA%3A+direct+and+photosensitized+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li>
<li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858(2012).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques%3A+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li>
<li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281(2011).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39(2014).</li>
<li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).</li>
<li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li>
<li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li>
<li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li>
<li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowitz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+Aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li>
<li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1%2C+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S%2FG2%2FM+phases+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li>
<li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li>
<li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET%3A+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593(2012).</li>
<li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li>
<li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li>
<li>Bártová, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li>
<li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+%28ADP+ribose%29-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li>
<li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li>
<li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li>
<li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li>
<li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li>
<li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23867337">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

显微镜技术是科研实验室中的基本工具。本文简要描述了用于研究蛋白质在DNA损伤位点募集及其动力学的方法。我们特别总结了在活细胞局部显微照射领域的实验经验，并讨论了利用FRAP研究蛋白质动力学，以及通过受体漂白FRET28及其改进技术FRET-FLIM（图4A-D）研究DNA损伤位点处蛋白质-蛋白质相互作用的方法。文中所示这些方法对于深入理解DNA修复过程至关重要，尤其是借助先进的共聚焦显微镜对活细胞系统中蛋白质动力学进行观测时尤为关键6,7,8,28。这些方法在未来的医学应用中具有重大价值，可用于分析放射治疗对组织的影响，或表征肿瘤细胞的形态特征。为了优化该方法，我们建议从已知存在相互作用的蛋白质对开始实验，如<strong class="xfi...

DNA损伤会导致出现多种DNA损伤位点，包括环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）、8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷以及单链或双链断裂1,2。γ射线是一种能量最高、穿透力最强的电离辐射形式，因此广泛应用于放射治疗3。另一方面，由紫外激光实验诱导的DNA损伤可模拟生物体对紫外线的自然暴露。UVA显微辐照作为一种显微技术，是研究单个活细胞中DNA损伤的实验工具。该技术最早在40年前被用于揭示染色体区域的组织结构4,5。该技术的应用高度依赖共聚焦显微镜的功能特性或现代纳米显微技术的技术限制。为诱导DNA损伤，可在紫外辐照前使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）或Hoechst 33342对细胞进行预致敏处理。Bártová 等6此前已描述了预致敏步骤，而近期我们对该显微辐照技术进行了优化，以避免细胞死亡或凋亡的发生。例如，使用405 nm紫外激光（无需Hoechst 33342预致敏）主要诱导产生53BP1阳性的双链断裂（DSBs），而环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的形成则相对较少。相反，预致敏步骤与紫外显微辐照结合使用时，可同时诱导产生极高水平的CPDs和DSBs7,8。该方法难以用于单一DNA修复通路的研究。
通过微辐照技术，可以在活细胞中分析蛋白质在DNA损伤位点的招募、动力学行为及相互作用。Luijsterburg 等人曾发表该方法的一个应用实例，用于研究异染色质蛋白1βet al.9；我们最近首次发现多能性因子Oct4以及与卡哈尔体相关的蛋白coilin会被招募至紫外线诱导的DNA损伤位点6,10。这些DNA损伤位点上的蛋白质动力学也可通过荧光漂白后恢复技术（FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching）11,12,13或荧光共振能量转移技术（FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer）14,15进行研究。这些方法有助于揭示蛋白质在DNA损伤位点的简单扩散行为或蛋白质之间的相互作用。用于进一步表征蛋白质的有用工具是荧光寿命成像显微技术（FLIM, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy），或其与FRET技术的结合形式（FRET-FLIM）16。这些方法可用于研究稳定或瞬时表达荧光标记目标蛋白的活细胞中的生物学过程17。此处展示了一个示例：GFP标记的p53蛋白及其在DNA损伤应答中起重要作用的相互作用蛋白mCherry标记的53BP1的荧光指数衰减时间（τ）18,19。参数τ即荧光寿命，由FLIM计算获得，其数值取决于特定的荧光染料、结合状态及其所处的细胞微环境。因此，该方法能够揭示蛋白质亚群之间的差异，以及它们在例如DNA损伤后的结合能力与功能特性。
本文概述了本实验室用于研究微照射染色质位点处特定时间的蛋白质招募、动力学、扩散以及蛋白质-蛋白质相互作用的先进显微技术的方法学框架。文中提供了在活细胞中诱导局部DNA损伤的逐步操作方法，并描述了适用于研究由紫外激光诱导的局部DNA损伤位点处DNA损伤相关事件的各种方法学。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2TM</td><td></td></tr><tr><td>ES-D3 [D3]</td><td>ATCC</td><td>CRL-11632TM</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Fucci 细胞</td><td></td><td></td><td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN-Biotech</td><td>P03-0710</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>HyClone</td><td>SV30180.03</td><td></td></tr><tr><td>ES 细胞 FBS</td><td>Gibco</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>mLIF（小鼠白血病抑制因子）</td><td>默克密理博</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>MTG（1-巯基甘油）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biosera</td><td>XC-A4122/100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Biosera</td><td>XC-T1717/100</td><td>用1稀释 &amp;times; PBS 按 1:6 比例稀释</td></tr><tr><td>Nunclon 细胞培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7866</td><td>D3小鼠胚胎干细胞的培养</td></tr><tr><td>&amp;micro;-35 mm培养皿+A15:I35m 500网格</td><td>Ibidi GmbH</td><td>81166</td><td>显微镜培养皿</td></tr><tr><td>0.2% 明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>用去离子水稀释并高压灭菌</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞转染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-p53 质粒</td><td>Addgene</td><td>12091</td><td></td></tr><tr><td>mCherry-PCNA 质粒</td><td></td><td></td><td>由克里斯蒂娜·卡多索（Cristina Cardoso）慷慨惠赠，德国工业大学（Technische Universit&amp;auml;达姆施塔特</td></tr><tr><td>mCherry-53BP1 质粒</td><td>Addgene</td><td>19835</td><td></td></tr><tr><td>Metafecetene</td><td>Biontex Laboratories GmbH</td><td>T020&amp;ndash;2.0</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;times; PBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9625</td><td>用于转染，使用 1 &amp;times; 用无核酸酶水稀释的 PBS</td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;共聚焦显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Leica TCS SP8</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白光激光器</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm 激光器</td><td>相干公司</td><td></td><td>激光功率 80 mW</td></tr><tr><td>405 nm 激光器</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>激光功率 50 mW</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;免疫荧光染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR International Ltd</td><td>631-1580</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194854</td><td></td></tr><tr><td>皂苷（来自皂荚树皮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>53BP1</td><td>Abcam</td><td>ab21083</td><td>一抗</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A27040</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories Ltd</td><td>H-1000</td><td>封片剂</td></tr></tbody></table>

利用高级共聚焦显微镜技术研究dna损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

使用激光进行局部微照射是研究活细胞中与DNA修复相关过程的有用工具。本文介绍了一种方法学策略，用于分析蛋白质在DNA损伤位点随时间的动力学变化，或在局部微照射染色质上的蛋白质-蛋白质相互作用。我们还展示了如何利用Fucci细胞系统识别细胞周期的各个阶段，以研究细胞周期依赖性的蛋白质在DNA损伤处的动力学行为。本文还提供了使用两种紫外激光（355 nm和405 nm）诱导不同类型DNA损伤的方法学描述。只有经405 nm半导体激光微照射的细胞能够正常进行有丝分裂，并且不产生环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。我们还展示了如何在特定时间点固定微照射后的细胞，以对内源性目标蛋白质进行免疫检测。在DNA修复研究中，我们进一步描述了生物物理方法的应用，包括在具有自发性DNA损伤灶的细胞中进行光漂白后荧光恢复（FRAP）和荧光寿命成像显微技术（FLIM）。此外，我们还展示了FLIM-FRET（荧光共振能量转移）在蛋白质-蛋白质相互作用实验研究中的应用。

利用先进的共聚焦显微镜技术，我们观察到mCherry标记的53BP1和mCherry-PCNA蛋白在DNA损伤位点的聚集。该分析通过活细胞局部显微辐照实现。为了识别DNA修复相关蛋白在单个细胞周期各阶段的核内分布模式，我们采用了Fucci细胞系统，该系统可用于区分细胞周期的G1期、早期S期和G2期（图1）。我们此前在Suchankova et al.26中发表的Fucci细胞模型的生物学应用表明，53BP1在细胞周期的G1期、S期和G2期均被募集至局部诱导的DNA损伤位点，这与其在非同源末端连接（NHEJ）中的功能相关；NHEJ是介导双链断裂修复的主要机制之一。另一方面，该实验系统在单细胞水平上显示，与同源重组修复途径（HRR）相关的PCNA蛋白仅在S期末期和G2期识别双链断裂（DSB）27。为开展DNA修复机制的研究，我们还优化了辐照条件，以确保细胞在紫外激光照射后仍能继续进行有丝分裂（<stron...

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

利用激光进行局部微照射是研究活细胞中与DNA修复相关过程的有效工具。本文描述了一种方法学……

这些实验的总体目标是通过局部显微照射细胞来诱导 DNA 损伤，并观察参与 DNA 修复过程的蛋白质的募集情况。该方法有助于我们理解一个极为复杂而深刻的问题，即正常细胞和癌细胞如何应对 DNA 损伤。该技术的主要优势在于，我们能够在单个活细胞中研究 DNA 损伤应答。本次实验操作将由我实验室的博士后 Sona Legartova 和博士生 Jana Suchankova 演示。首先，在添加了 10% FBS 和适当抗生素的 DMEM 培养基中培养 HeLa 细胞。将细胞置于 37

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高级共焦显微镜技术研究 DNA 损伤的蛋白质-蛋白质相互作用和动力学

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。...

基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过...

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。...

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。...

激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。...

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

了解使用UVA激光微照射技术诱导DNA损伤并观察蛋白质招募的方法。该技术可在活细胞中研究DNA修复机制，同时保持正常细胞周期进程，为癌症生物学和细胞损伤响应研究提供重要见解。

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

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