野生型与CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁样品中唾液酸的测定

本方法的总体目标是利用高效液相色谱分析法检测野生型和CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁中N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的含量。该方法有助于解答糖科学领域中的相关问题，特别是CMAH小鼠模型的不同基因型对这些动物实际唾液酸含量的影响。与基因筛查相比，该技术的主要优势在于还可确定杂合子小鼠中唾液酸的相对水平。

本方法将由本实验室的两名研究生曹翠和王文娇进行评估。首先按照文本方案所述，从小鼠中收集CMAH基因敲除小鼠的乳汁和肝脏组织。为从乳汁中分离唾液酸，取50 µL乳汁转移至1.5 mL离心管中，加入1.2 mL已配制好的水性乙酸溶液。

为从肝组织中分离唾液酸，将20至50毫克小鼠肝脏轻轻解冻后转移至Dounce组织研磨器中。加入1.2毫升水相乙酸溶液，通过轻柔剪切均质化组织10秒。将所得悬液转移至1.5毫升离心管中。

接下来，将酸化后的牛奶或组织悬液在 80 摄氏度下孵育 4 小时。然后，在 14,000 ×g 条件下离心 10 分钟。将上清液顶部的 1000 µL 转移至新的 1.5 mL 离心管中。

在室温下通过离心蒸发除去溶剂，直至完全干燥。将样品重新溶解于500 µL蒸馏水中。接下来，通过将每份样品200 mg阴离子交换树脂转移至带有活塞的空3 mL离心管中，制备微型阴离子交换柱。

加入 2 毫升水性乙酸溶液，以将树脂中的氯离子替换为乙酸根离子。当溶剂到达树脂顶部时，立即关闭活塞。轻轻加入 2 毫升蒸馏水，然后打开活塞。

当大部分溶剂到达树脂顶部时，立即停止流动。确保树脂始终被溶剂覆盖。然后，用两毫升蒸馏水再洗涤树脂柱两次，以去除过量的乙酸盐。

将所得的500微升样品溶剂转移至树脂柱上，并弃去穿流液。用2毫升蒸馏水轻轻洗涤树脂。使用1毫升50毫摩尔的醋酸铵溶液将样品阴离子从树脂上洗脱至1.5毫升离心管中。

在室温下通过离心蒸发除去溶剂，直至干燥。使用分析天平称取5至8毫克的N-乙酰神经氨酸，放入1.5毫升离心管中。记录精确质量，并为每毫克样品加入164微升蒸馏水。

以适中的价格获取少量 N-羟乙酰神经氨酸，例如以 1 毫克分装的形式。加入 154 微升蒸馏水至化合物中，配制成浓度约为 20 毫摩尔/升 Neu5Gc 的储备液。将溶液转移至 1.5 毫升离心管中。

该溶液可在 -20 摄氏度保存长达 12 个月。取每种储备液各 5 µL，加入一个新的 1.5 mL 离心管中。然后，在室温下通过离心蒸发去除溶剂至干燥。

向来自小鼠乳汁、小鼠肝脏或混合唾液酸标准品的唾液酸样品中加入20微升OPD溶液。剧烈涡旋震荡样品30秒。然后，在避光条件下于80摄氏度孵育4小时。

将样品静置冷却5分钟后，加入80 µL蒸馏水。然后以14,000 ×g离心1分钟。接着，将80 µL上清液转移至300 µL高回收率HPLC小瓶中。

衍生化的唾液酸样品可在4至6摄氏度下保存长达一周。使用连接在线荧光检测器的标准高效液相色谱（HPLC）系统分析样品。分析时采用反相C18色谱柱，柱长为250毫米，直径为4.6毫米。

在配制溶剂A和溶剂B，并按照方案中所述设置高效液相色谱（HPLC）运行条件后，将50 µL样品注入HPLC系统。使用荧光检测器，激发波长为373 nm，发射波长为448 nm，监测洗脱情况。最后，根据文本方案中所述方法计算Neu5Gc的相对含量。

图中显示了来自纯合子 CMAH 基因敲除小鼠和杂合子 CMAH 基因敲除小鼠乳汁样本的荧光标记唾液酸的代表性高效液相色谱（HPLC）色谱图，同时展示了野生型小鼠的结果。类似地，图中还显示了小鼠肝脏来源的荧光标记唾液酸的色谱图。

比较 Neu5Gc 的相对含量显示，CMAH 纯合敲除小鼠不含 Neu5Gc，而杂合 CMAH 基因敲除小鼠和野生型小鼠的 Neu5Gc 含量介于 10% 至 75% 之间。熟练掌握后，若操作得当，可在八小时内完成样品制备。样品可进行 HPLC 自动进样过夜分析。

在进行该实验操作时，需注意务必在同一天内完成唾液酸的分离及衍生化步骤。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如质谱分析）来确认所获得的荧光信号的性质。该技术的建立使研究人员能够探究生物样品中唾液酸的分布情况。

请注意，操作浓乙酸和甲酸具有极高的危险性，进行该实验操作时必须采取防护措施，例如佩戴防护装备。