Name: 纳米材料在水介质中的分散: 对协议优化的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 了解纳米材料在水介质中分散的优化方案，通过实时表征确定最佳超声条件。该方法利用动态光散射和透射电镜技术，帮助研究人员获得稳定均匀的纳米颗粒分散体系，同时保持样品完整性。

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取得这些成果的研究获得了项目编号NE/J010783/1的资助。项目NanoValid获得了欧盟第七个研究、技术发展与示范计划资助协议第263147号的资助。

注意：所有化学品均未经进一步纯化直接使用。实验中全程使用电阻率为 18 MΩ·cm 的超纯水。所有制备好的分散液通常在 5 °C 避光条件下储存，用于后续表征或稳定性研究，但具体储存条件可能因材料组成及其他相关性质（如溶解性）而异。例如，银纳米颗粒（Ag NPs）在 2–5 °C 避光保存时通常可在一段时间内保持稳定；然而，悬浮液中仍会发生动态变化，分散液最终会重新团聚并随时间发生沉降。在进行生物学测试前，应使用动态光散射（DLS）、紫外-可见光谱（UV-vis）和透射电子显微镜（TEM）对这些材料进行分析以验证其质量4,5,13,14。以下分析采用 0.02 mg/mL 的浓度。该样品浓度适用于动态光散射（DLS）、紫外-可见光谱（UV-vis）、盘式离心、zeta 电位计算以及透射电子显微镜（TEM）分析。
1. 超声波发生器输出功率的校准
注意：超声处理过程中传递到悬浮液的有效声功率是一个关键参数，以获得可重复的分散体系。该参数不同于制造商所标注的发生器的电输入或输出功率，因为有效声功率是指实际传递到悬浮液中的功率26。在多种计算有效传递功率的方法中，最常用的是量热法26。该方法被公认为是直接测量传递至悬浮液的有效功率的一种简单且高效的方式7。在此方法中，记录在特定超声仪设置下液体随时间的温度升高情况，并利用以下公式计算所传递的有效功率： 
<img alt="功率公式 P=(dT/dt)MCp；热力学方程分析。" src="/files/ftp_upload/56074/56074eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
其中，P 表示传递的声功率（W），T 为温度（K），t 表示时间（s），CP 为液体的比热容（水的比热容为 4.18 J/g·K），M 为液体的质量（g）。
<ol>
	<li>使用配备小瓶探头的超声波探头校准输出功率 
	注意：该方法改编自 Taurozzi 等7，建议执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将一个空的塑料小瓶置于微量天平上，并对天平去皮归零。</li>
		<li>向小瓶中加入 1.5 mL 去离子水（电阻率 18 MΩ·cm），并使用天平记录液体的质量。</li>
		<li>将小瓶放入小瓶探头高强区域的六个小瓶孔之一中，并使用夹具将连接至数字温度计的温度探头浸入液体中。确保探头不接触小瓶壁，且位于液面下约 2 cm 处。</li>
		<li>将小瓶探头设置为 24 kHz 和 10 W（振幅调节为 50%），并以连续模式运行。 
		注意：此处测试的其他振幅调节设置为 70%、90% 和 100%。</li>
		<li>在最初 5 分钟内以 30 秒间隔记录水温的上升情况，并确保小瓶或装置不发生位置移动。</li>
		<li>在电子表格软件中创建温度-时间曲线图，并使用最小二乘法回归获得最佳线性拟合。</li>
		<li>获取曲线图的斜率（即温度随时间的上升速率），并使用公式 1计算输出功率。重复实验三次，取平均值。</li>
		<li>对 70%、90% 和 100% 的振幅设置重复步骤 1.1.1 至 1.1.4。该程序获得的功率值将在分散处理过程中报告。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用超声波清洗槽校准输出功率
	<ol>
		<li>将一个空的塑料小瓶置于微量天平上，并对天平去皮归零。</li>
		<li>向小瓶中加入 1.5 mL 去离子水（电阻率 18 MΩ·cm），并使用天平记录液体的质量。</li>
		<li>将小瓶置于超声波清洗槽中央，半浸入水中，并用夹具固定。使用夹具将连接至数字温度计的温度探头浸入液体中。确保探头不接触小瓶壁，且位于液面下约 2 cm 处。</li>
		<li>将超声波清洗槽设置为 40 kHz 和 80 W，并以连续模式运行。</li>
		<li>在最初 5 分钟内以 30 秒间隔记录水温的上升情况，并确保小瓶或装置不发生位置移动。</li>
		<li>在 Excel 中创建温度-时间曲线图，并使用最小二乘法回归获得最佳线性拟合。</li>
		<li>在电子表格软件中获取曲线图的斜率（即温度随时间的上升速率），并使用公式 1计算输出功率。重复实验三次，取平均值。该程序获得的功率值将在分散处理过程中报告。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用配备试管换能器的超声探头在水相介质中进行分散的步骤
<ol>
	<li>使用洁净的药匙将所需纳米粉末各 2 mg 分别称取至三个洁净的玻璃小瓶中。标记为 1、2 和 3 号小瓶。</li>
	<li>用移液器吸取 1 mL 去离子水，沿每支小瓶的管壁加入。用洁净的细玻璃棒搅拌成浓稠浆状，然后加入剩余的去离子水，使最终浓度达到 0.2 mg/mL。若为疏水性样品，先用 1 mL 体积分数 0.5% 的乙醇进行预润湿，再加入去离子水至所需终浓度。</li>
	<li>用瓶盖密封各小瓶，并在水平圆周方向充分振荡，以去除附着在小瓶管壁上的纳米粉末。</li>
	<li>将三个小瓶放入配备小瓶换能器的超声探头中，在脉冲模式（1 s/1 s，即开启 1 秒，关闭 1 秒）下施加首次超声处理，功率为 1.1 W，持续 2 分钟。此过程将使分散液温度升高约 4 °C。</li>
	<li>取出 1 号小瓶，从液面上方吸取适量等分试样，用去离子水稀释至浓度为 0.02 mg/mL。使用一系列互补技术（如 DLS、TEM、UV-vis 和 ELS，详见第 4 节）对稀释后的分散液进行粒径、粒径分布、形貌、团聚状态和泽塔电位的表征。准确记录并存档测量结果。</li>
	<li>从步骤 2.4 开始暂停 10 分钟，使样品冷却，避免系统内温度急剧上升。对 2 号和 3 号小瓶在相同振幅和脉冲模式下进行第二次超声处理，持续 4 分钟。取出 2 号小瓶，重复步骤 2.5，记录并存档超声处理 6 分钟后的数据。</li>
	<li>再次暂停 10 分钟，对 3 号小瓶进行第三次超声处理，持续 4 分钟，然后执行步骤 2.5。记录并存档超声处理 10 分钟后的测量结果（详见第 4 节）。 
	注意：操作纳米颗粒悬浮液时必须穿戴实验服、手套和护目镜。在进行较长时间实验时，超声仪必须置于声学屏蔽箱内，且在靠近超声源操作时必须佩戴高防护耳罩。</li>
</ol>
3. 使用超声波清洗仪在水相介质中进行分散的步骤
<ol>
	<li>使用洁净的药匙，在四个洁净的玻璃小瓶中分别称取 2 mg 所需的每种纳米粉末，并将小瓶标记为 4、5、6 和 7 号。</li>
	<li>用移液器吸取数滴去离子水（DI 水），沿每个小瓶的瓶壁加入，并借助洁净的细玻璃棒搅拌成浓稠浆状。然后加入剩余的去离子水，使每个小瓶中的最终浓度为 0.2 mg/mL。 
	注意：对于疏水性样品，需先使用 1 mL 体积分数为 0.5% 的乙醇进行预润湿，再加入去离子水以达到所需的最终浓度。</li>
	<li>用瓶盖密封每个小瓶，并在水平圆周方向上充分振荡，以去除粘附在瓶壁上的任何纳米粉末。</li>
	<li>将四个小瓶置于超声波清洗槽中央，使小瓶一半浸入水中，在室温下以 80 W 功率进行第一次超声处理，持续 15 分钟。此过程将导致分散液温度升高约 3 °C。</li>
	<li>从超声波清洗槽中取出 4 号小瓶，从瓶内液面顶部吸取适量等分试样，用去离子水稀释至浓度为 0.02 mg/mL，并使用一系列互补技术（如动态光散射 DLS、透射电子显微镜 TEM、紫外-可见光谱 UV-vis 和电泳光散射 ELS，详见第 4 节）对样品的粒径、粒径分布、形貌、团聚状态及 zeta 电位进行表征。记录并保存测量结果。</li>
	<li>更换超声波清洗槽中的水，对 5、6 和 7 号小瓶在相同条件下（80 W）进行第二次超声处理，持续 15 分钟。取出 5 号小瓶，按照步骤 3.5 进行表征，并记录超声处理 30 分钟时的测量数据。</li>
	<li>再次更换超声波清洗槽中的水（以避免温度进一步升高），在相同条件下对 6 和 7 号小瓶进行第三次超声处理，持续 30 分钟，并在 15 分钟时短暂暂停以更换水。取出 6 号小瓶，按照步骤 3.5 进行表征，并记录超声处理 1 小时时的测量结果。</li>
	<li>每 15 分钟更换一次超声波清洗槽中的水，在保持参数不变的情况下对 7 号小瓶进行第四次超声处理，持续 1 小时。取出 7 号小瓶，按照步骤 3.5 完成全部表征，并记录超声处理 2 小时时的测量数据。</li>
</ol>
4. 不同时间点分散样品的表征
<ol>
	<li>使用DLS进行粒径表征27
	<ol>
		<li>打开DLS软件。创建一个可针对特定纳米材料（包括标准品）进行个性化设置的粒径测量文件，使用马尔文手册中提供的折射率值。此外，根据软件要求输入其他必要数据，如吸收值、黏度值以及分散剂类型。</li>
		<li>输入样品的实验条件，例如 2 min 平衡时间， 20 °C 温度，比色皿类型为低体积一次性比色皿，实验以自动模式运行。按“文件|保存”（以所需名称保存）。</li>
		<li>点击“文件｜打开新测量”，使用标称尺寸为100 nm的标准乳胶微球进行DLS验证测试，以确认仪器性能
		<ol>
			<li>使用低体积一次性比色皿。用注射器或移液器加入1 mL样品，避免产生气泡。 
			注意：使用前用乙醇和去离子水清洗比色皿。</li>
			<li>将比色皿插入仪器中。点击文件测量面板上的“start”按钮。请注意，仪器将对样品平衡2 min，然后开始测量 20 °C. 
			注意：如果样品先前存放在冰箱中，使用前应使其达到室温。</li>
			<li>在自动模式下至少采集五个测量值，通过选中所有测量结果并点击顶部面板的“平均值”按钮，计算并报告其平均尺寸。将数据导出至 Excel 用于进一步分析。</li>
			<li>以Z均值报告流体动力学直径，PdI宽度表示单峰分布时Z均值的标准偏差28若Z均值与强度加权粒径分布的平均值之间存在显著差异，表明样品可能存在多分散性或团聚现象，则应报告强度加权粒径分布的平均值，并对样品状态加以说明。</li>
			<li>重复步骤 4.1.3 进行新的测量。 
			注意：动态光散射（DLS）不适合用于非理想样品的分析。此处的非理想样品是指具有高多分散性、非球形颗粒、严重团聚或沉降的样品。 等等。 重复测量可能因颗粒沉降/沉淀而导致读数不准确。在此情况下，建议采用其他互补技术，例如圆盘离心法，可用于对分散体系进行定性评估。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过圆盘离心法测定粒径分布
	<ol>
		<li>打开 CPS 软件。选择“程序定义”，在顶部输入样品标准操作程序（SOP）名称，并填写样品参数，如最小和最大直径、颗粒密度、折射率、吸收率以及非球形因子。29.
		<ol>
			<li>例如，对于氧化锌纳米颗粒，在最小直径和最大直径选项卡中分别输入 0.1 微米和 1.0 微米，在颗粒密度中输入 5.61 g/mL，折射率输入 2.1，颗粒吸收输入 0.001，非球形度输入 1。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据PVC标准的峰直径填写校准标准详细信息 0.377 µm 颗粒密度为1.385 g/mL。同时填写液体参数（蔗糖，液体密度为1.04 g/mL，液体折射率为1.35），并命名和保存该程序。</li>
		<li>选择已选定的程序（第4.2.1步中保存的标准操作程序），通过圆盘上的孔注入第一梯度层，即1.6 mL蔗糖（24%），然后按“开始”。 
		注意：蔗糖的作用是在圆盘以恒定速度旋转时在其内部建立密度梯度。系统将根据尺寸范围自动计算圆盘转速。</li>
		<li>等待软件达到自动计算的转速（RPM，转/分钟）。通过注入蔗糖梯度（8% 低密度和 24% 高密度，参见 表1），每次1.6 mL总体积，从最高密度溶液开始，至最低密度溶液结束。 
		注意：此处将8%蔗糖溶液标记为低浓度，24%蔗糖溶液标记为高浓度。按以下体积混合（每次总体积为1.6 mL），依次注入离心管中，直至形成梯度。
		<ol>
			<li>随后，注入1.0 mL 十二烷封液，以维持碟片内梯度至少6 h。使碟片离心机平衡1 h。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择“运行分析仪”，输入样品编号，然后按开始。用1 mL注射器向圆盘中注入0.2 mL标准品，同时按下空格键；随后注入0.2 mL样品，同时再次按下空格键。等待测量完成后，点击下一个样品。</li>
		<li>使用圆盘离心机控制系统软件采集和处理数据。具体操作为：点击“检索分布”，然后选择样品名称，即可打开该样品的粒径分布图。将数据导出至电子表格管理软件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用紫外-可见光谱法研究分散稳定性 
	注意：紫外-可见光谱法常用于通过仔细观察吸收光谱中峰强度、光谱偏度、光谱形状以及吸收峰波长位移的变化，来评估悬浮液的稳定性和聚集情况。4具体步骤如下。
	<ol>
		<li>打开紫外-可见分光光度计软件，点击“光谱扫描”30.</li>
		<li>使用标准石英比色皿（半微量矩形石英池，10 mm，190 - 2,700 nm）。用移液器加入 2 - 3 mL 样品。
		<ol>
			<li>使用前，先用50%硝酸清洗比色皿10分钟，再用纯化水冲洗三次。随后用丙酮润洗，除去多余液体，并在空气中晾干。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从软件面板顶部点击“Instrument”，然后点击“set wavelength”，在波长选项卡中将仪器设置范围预设为700 nm至200 nm。</li>
		<li>点击“基线”。使用相应的“空白”样本对每个光谱进行背景扣除。 即，一个仅装有分散介质（此处为水）的比色皿。 
		注意：对于疏水性样品，使用与乙醇：水相似的比例作为分散介质。</li>
		<li>在每个样品上至少采集三个独立光谱，方法为点击“Instrument| Property”，并在光谱数量中输入“3”。取平均值用于分析。保存数据并导出以供进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ELS 测量 Zeta 电位
	<ol>
		<li>打开DLS软件。创建一个可以针对特定纳米材料进行个性化的zeta电位测量文件，使用马尔文手册中的折射率值。输入其他可直接填入软件的信息。 例如，吸收率、黏度以及样品设置选项卡中显示的分散剂类型。点击“文件｜保存”，并以所需名称保存。</li>
		<li>单击“文件｜打开新测量”，使用参考标准 DTS 1235（Zeta 电位标准品）验证仪器性能。该标准品为 pH 9 缓冲水溶液中的聚苯乙烯乳胶标准品，Zeta 电位为 -42 ± 4.2 mV。</li>
		<li>使用容量不小于1 mL的注射器制备样品。采用带有两侧电极的一次性折叠毛细管池进行Zeta电位测量。通过毛细管池上的一个端口小心地将样品注入毛细管池内，注意避免产生气泡。
		<ol>
			<li>当样品开始从另一端出现时，插入塞子并清除可能溅到电极上的液体。用乙醇和去离子水彻底清洗比色皿。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将折叠的毛细管池插入仪器中。平衡2分钟，然后进行测量 200 °C 除非另有说明，若分散样品此前存放在冰箱中，使用前应使其恢复至室温。</li>
		<li>以自动模式至少采集五次测量数据，并报告平均的zeta电位值。导出数据并进行分析17,18 （通常认为，当zeta电位值低于-25 mV或高于25 mV时，体系稳定），可在线或离线分析解读。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用透射电子显微镜进行形态学表征
	<ol>
		<li>使用300目带孔碳膜铜网进行样品制备。在洁净的铜网上滴加一滴分散样品（约0.1 mL，0.02 mg/mL）。</li>
		<li>在常温条件下让样品自然风干，同时保持网格覆盖，以防止空气中的污染物进入。</li>
		<li>用超纯水清洗载网，以去除任何干燥效应，并进行透射电子显微镜成像。 
		注意：在载网上滴加分散液会增加载网上颗粒的浓度，从而导致颗粒间吸引力增强。不均匀干燥可能产生伪影。用超纯水进行短暂冲洗可消除这一风险，并有助于载网均匀干燥。31.</li>
		<li>以 dm3 格式获取图像，随后使用透射电子显微镜（TEM）软件离线分析。 
		注意：图像可用于推断有关颗粒大小、结构和形状的补充信息。文件将转换为 tiff 格式，以便对形状和大小等特性进行量化分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无竞争性财务利益。IK 和 EVJ 共同构思了本研究，IK 负责实验设计，并共同完成实验操作、数据分析及手稿撰写。LJE 和 IR 完成了透射电子显微镜（TEM）成像。SA、MLM 和 MC 提供了碳纳米管（CNTs），其余共同作者在各个阶段参与了手稿的讨论与审阅，RT 参与了手稿的编辑工作。

本研究的最终目标是开发一种策略，以确定在水中分散特定种类纳米材料的最佳超声处理条件。本文旨在仔细记录超声过程中的实验步骤和参数，以弥补以往综述中指出的知识空白，并遵循先前提出的相关建议15。通过在每次超声循环后对分散液进行表征，并检测样品的稳定性和均匀性，来确定最佳分散条件。超声处理程序及稳定性状态的影响将基于纳米材料关键理化性质的特征性变化进行评估，这些性质通过多种分析技术测定，包括动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）、紫外-可见光谱（UV-vis）和透射电子显微镜（TEM）。当前的实验方案是在以往文献和其他研究项目所建立的纳米材料分散方法21,22,37,38,39基础上，结合一些改进和优化而形成的，旨在解决关键的知识缺口、操作步骤问题，并提升其对具有相似表面特性的更广泛纳米材料的适用性7。然而，在将该方法应用于其他纳米材料时，仍需谨慎调整其超声时间、强度和类型。此外，尚需进一步研究以建立超声处理程序与纳米材料生物活性之间的相关性。本研究评估并比较了六种不同类型的纳米材料分散液，主要关注其稳定性，采用超声水浴和配备小瓶振荡器的超声探头，在设定的时间点进行处理。为保持悬浮液的纯度，避免因污染导致的非预期改变，本研究未使用探头式超声。使用小瓶振荡器时，样品瓶可保持密闭状态，从而杜绝样品间的交叉污染。
校准超声设备是一个关键因素，因为市面上有多种不同频率、振幅和功率的超声设备可供选择。为了确定传递到悬浮液中的有效声能，需采用量热法对超声设备进行校准。计算结果显示，样品管超声探头在70%振幅设置下以及超声浴在100%设置下的声功率均小于&#60;1 W（分别为0.75 ± 0.04 W 和 0.093 ± 0.04 W）。然而，制造商标示的样品管探头和超声浴设备的输出功率分别为200 W和80 W。这表明，尽管电源功率较高，但在空化泡生成过程中大部分能量已损失，仅有少量能量实际传递至待处理的分散体系中26。近期研究强调，相较于超声设备的输入功率，控制空化效应的测量对于在超声过程中实现更好的分散控制更为重要8。该方法在精确分散高灵敏度纳米材料（如碳纳米管）方面展现出良好前景，建议在今后的研究中推广应用。
本研究中使用的每种技术均基于不同的原理，且均存在一定的局限性。动态光散射（DLS）不适用于非球形悬浮液以及高度多分散体系。在此类情况下，建议使用扩散波谱法（DCS），因其具有高分辨率、高准确性和高精密度40。DCS能够完全分辨尺寸分布极窄、差异小至3%的峰。透射电子显微镜（TEM）可提供纳米颗粒的直接可视化图像，是评估颗粒聚集状态、分散性、尺寸和形貌的有力工具，但该技术需要对样品进行干燥处理，可能导致产生人为假象41。如步骤4.5.3所述，通过超纯水洗涤载网可消除此类问题。
在该方法中，强调了一些关键步骤，例如实验方案中所用小瓶的类型、小瓶在超声浴中的浸入深度和位置，以及探头式超声仪中小瓶的放置位置。震荡过程中系统的温度控制是一个重要参数。建议频繁更换超声浴中的水，并在使用探头式超声仪时采用脉冲模式运行，以避免超声过程中产生热量积聚，从而防止样品发生任何改变。对于氧化锌等疏水性样品，预润湿步骤有助于颗粒的分散，但可能引发一些非预期的变化。超声时间和能量应足够高以实现颗粒的去团聚，但又不能过高而导致颗粒破碎。结果表明，团聚体的破碎程度取决于颗粒的类型。
我们的研究结果强调了制定详细分散方案的重要性，因为实验表明，在超声处理过程中，关键的理化性质可能会受到超声设备类型、超声时间及输出功率等因素的影响而发生改变。结果显示，在高强度震荡条件下，样品的完整性可能受到损害。结果还表明，碳纳米管（CNTs）对震荡极为敏感，当超声时间和强度发生变化时，极有可能发生断裂。分散碳纳米管的近似最佳条件为：使用超声波清洗仪时为2–15分钟，而使用超声探头时仅需2分钟。然而，超声处理仍可能导致部分纳米管变短，但此处无法准确量化这一现象。动态光散射（DLS）可能并非表征碳纳米管的理想技术，但仍可提供纳米管的流体动力学直径，该数据有助于反映不同样品间碳纳米管长度分布的差异。16,42,43以往研究表明，通过添加表面活性剂可显著增强碳纳米管（CNTs）的分散效果，因为表面活性剂分子会吸附在纳米管单层表面，从而在超声处理过程中形成保护屏障，防止其断裂。35,44然而，这种情况无法与本实验方案直接比较，因为本方案中未使用任何表面活性剂。需要注意的是，对于碳纳米管（CNTs）而言，确保其长度分布非常重要，因为长径比通常与特定的毒理学反应相关。相比之下，CeO₂2 与碳纳米管（CNTs）相比，CeO2 得到了不同的结果，其中使用超声波浴或探头进行长时间超声处理会导致一次粒子的形成。CNT 与 CeO2 两种情况下的研究结果差异凸显了针对不同材料定制分散方案的重要性 例如，根据起始材料优化超声时间与输出功率 即，纳米材料粉末的类型。每种纳米材料粉末样品类型均有所不同，因为粉末内部的团聚程度各不相同。在某些情况下，解团聚过程成功地将团聚体分解至一次粒子水平，透射电子显微镜（TEM）图像中出现此前超声处理前不可见的其他形态颗粒即为明证。延长超声处理时间导致氧化铈团聚体在不同角度持续断裂，从而形成多面体颗粒。
对于市售的水相银纳米颗粒（Ag NPs）分散液样品，我们的研究结果也强调了对其进行长期稳定性与均匀性评估的重要性。在使用前，有必要确保分散液已得到充分表征，尤其是在长期储存的情况下。然而，纳米材料的保质期通常很短，会随着时间推移而老化，其长期储存后的性能表现可能与新鲜制备的分散液存在差异。
此处结果凸显了建立统一策略以确定不同纳米材料优化方案的必要性。所提出的策略是采用不同变体的超声处理方法，并确保在不同时间点通过互补的分析手段对分散体系进行充分表征。此前的研究人员已强调，应采用多方法联用策略，以在不同时间和实验条件下对分散质量进行表征与监测。45尽管本研究中介绍的超声处理方法是针对特定纳米材料的分散，但这些方法也可作为在水中分散其他具有相似表面性质的金属及金属氧化物纳米材料的基础。然而，若更换纳米材料种类或液体介质，则需对基本操作方案进行优化，这可通过谨慎调整多种因素来实现 例如超声时间、强度和超声设备类型。无论选择何种方案并确定为最优条件，均需对超声分散程序的总体方案及逐步操作流程进行详细记录。这对于提高实验结果的可解释性和可比性至关重要。本方案的应用之一是促进不同实验室之间的数据可比性，从而为未来研究建立统一且标准化的操作方法。当前的方法和控制参数也可用于除水以外的其他分散介质，并可根据具体情况逐案进行比较分析。

超声处理是指产生空化现象的过程，该过程涉及在高强度超声辐照下液体中形成的气泡（常称为热点）的生成、生长和破裂1在实验室环境中，超声处理法使用超声仪进行。存在多种不同类型的超声仪，其共同功能均为将颗粒解团聚，使其在液相介质中分散为单个（或初级）颗粒。通过施加超声处理，样品的均一性可得以改善，并可能实现更窄的粒径分布。在分散过程中需考虑的一个重要方面是最终分散体系的稳定性。此处，悬浮液的稳定性定义为：颗粒在分散状态下不发生沉降或沉淀，且在此期间（约10分钟）连续五次重复测量所得的平均流体动力学直径变化不超过10%。2,3测量分散稳定性的方法有多种，包括通过测定颗粒的电泳迁移率来估算其Zeta电位（ZP），另一种方法是测量纳米颗粒在紫外光谱范围内的特征吸收。4.
在纳米毒理学领域，能够有效控制分散质量至关重要，因为分散步骤将决定关键的理化特性，例如粒径/粒径分布、形状、聚集/团聚、表面电荷等。 等等。 这最终将影响颗粒与测试介质的相互作用以及各种实验结果 体外 和 体内 实验，以推断纳米材料的潜在危害。
超声处理通常采用探头式（直接）超声、超声波清洗机或配备小瓶振子的超声探头（间接超声）进行。各类超声设备均提供不同强度和输出功率的设置，有时还可根据特定工艺或需求配备不同类型的声能探头，适用于2至250 mL范围内的液体体积。尽管探头式超声由于局部强度较高而被认为比浴式超声效果更优5，但在制备毒理学测试悬浮液时，浴式超声通常更受青睐，原因在于探头尖端可能带来污染风险、钛制探头尖端在长期使用后发生腐蚀，以及探头浸入深度不一致等问题。同样，配备小瓶振子的超声探头相较于直接探头具有优势，既避免了上述污染风险，也提高了设备操作的便捷性。多个小瓶可同时在相同强度下进行超声处理，不仅节省时间，而且确保所有样品接受一致的处理，从而使样品间的结果更具可靠性和可比性。在纳米材料的安全性研究中，始终需避免污染。然而，探头式超声仪不符合这一要求，且尚未经过相关验证。已知探头式超声仪会引起一些不可避免的副作用，例如因探头腐蚀导致的样品污染，以及能量输出降低进而引起分散条件改变，从而影响数据的可重复性6,7,8。此外，样品通常在未加盖容器中运行，易因蒸发造成液体损失，同时也可能引入灰尘沉积。为避免这些非预期的干扰，近期研究推荐采用基于高效能量传递和悬浮液纯度保障的替代性间接超声设备6。
未优化的超声处理可能对实验结果产生不利影响。它可能会改变纳米材料的关键物理和化学性质，如粒径、粒径分布、形貌和表面电荷2,9。已有文献报道，由于未能有效控制超声过程，导致纳米颗粒参数发生变化，例如纳米二氧化钛（nano-TiO2）5,10,11、纳米氧化锌（nano-ZnO）6 和纳米铜（nano-copper）12。此外，以往研究还表明，超声过程不仅会改变颗粒特性，还会影响毒理学测试的结果12,13。
为了控制分散过程，重要的是监测并理解不同类型超声波破碎仪、仪器功率和作用时间、体积等因素的影响， 等等。，可能影响分散液的质量。因此，有必要建立一种系统化的方法，用于分析分散液中颗粒在超声处理不同时间点的关键理化特性。尽管已有少数研究人员考虑了这些因素，但该领域的研究仍较为有限。Bihari 等 研究了使用不同超声能量和各种分散稳定剂制备的不同纳米材料分散液的分散稳定性14哈特曼最近的一篇综述 等 强调了尽管已开展研究以理解影响纳米材料分散质量的各种因素 例如超声波破碎仪型号、超声时间 等等。目前仍没有明确定义且被普遍接受的超声处理程序来支持纳米毒理学测试与研究7,15.
多种分析表征技术可用于监测分散体系的质量，包括动态光散射（DLS）、盘式离心法、电泳光散射（ELS）、紫外-可见（UV-vis）光谱法和透射电子显微镜（TEM），这些方法分别用于测量粒径/粒径分布、zeta电位、分散稳定性以及形貌特征。DLS常用于测定纳米材料分散体系中颗粒的流体动力学直径（Z-平均值）和多分散指数（PdI）。当DLS检测到多峰粒径分布时，所得Z-平均值可能与强度加权的粒径分布不一致，此时可引用强度加权粒径分布的平均值。PdI反映粒径分布的宽窄程度，其数值范围为0至1，其中0表示单分散样品，1表示高度多分散样品16。盘式离心法是一种利用液体介质中离心沉降来测定粒径分布的分离技术。颗粒在光学透明且旋转的圆盘内发生沉降，当颗粒到达圆盘边缘时，其散射光强度被记录，并通过斯托克斯定律（Stokes' law）转换为粒径分布。对于多峰粒径分布的解析，盘式离心法等具有内置分离机制的仪器更为适用。颗粒的zeta电位（ζ-电位）定义为剪切面或滑移面处的电势，该面是双电层中的一个假想边界，将表现出正常黏性行为的主体液体与主要由反离子组成、并随颗粒一起运动的斯特恩层（Stern层）分隔开来。zeta电位与颗粒表面电荷直接相关，因此决定了颗粒间的静电相互作用（即，排斥或吸引）。该参数被认为是纳米材料分散体系稳定性的主要指标。根据惯例，zeta电位值低于-25 mV或高于25 mV时被认为具有良好的稳定性17,18。离子的浓度和类型以及溶液pH值对zeta电位有显著影响19。ELS用于测量分散体系中颗粒的电泳迁移率，并通过亨利方程（Henry equation）结合Smoluchowski或Hückel模型将迁移率转换为zeta电位。紫外-可见光谱法是一种用于量化样品在特定波长下吸收和散射光强度的技术，常用于通过测量纳米材料在紫外区的特征吸收来监测分散稳定性。最后，透射电子显微镜（TEM）常用于观察和分析纳米颗粒的尺寸、粒径分布、团聚状态及形状5,14,15,20。
我们对使用超声波清洗槽和配备小瓶探头的超声探头仪制备的六种不同纳米材料分散液进行了比较研究。本方案中详细说明了实验所用的颗粒浓度、温度、超声设备类型及参数设置，以便推断类似探头和超声波清洗槽的实验条件。所用的纳米材料包括：银（Ag）、氧化铈（CeO2）、氧化锌（ZnO，亲水性NM110和疏水性NM111）以及碳基纳米材料，如碳纳米管（A32和A106，参见材料表）。
在超声处理过程中的不同时间点，采用多种表征技术评估分散体系的质量，包括动态光散射（DLS）用于测定粒径/粒径分布，盘式离心法用于粒径分布，电泳光散射（ELS）用于测定Zeta电位，紫外-可见光谱法（UV-vis）用于评估稳定性，以及透射电子显微镜（TEM）用于观察颗粒形貌和均一性。研究评估了多种不同类型的纳米材料，范围涵盖金属氧化物到碳基材料。作为对照，同时使用市售的柠檬酸盐包覆稳定的银纳米颗粒（Ag NPs）水悬浮液，以推断相关商业化悬浮液预期的长期稳定性。显然，该Ag NPs模型与任何具体的分散方法无直接关联，仅用于提示在储存一段时间后，由于可能发生再团聚等变化，有必要对悬浮液重新进行超声处理或再稳定化。该悬浮液在冰箱中保存两个月，在此期间对其进行表征，以识别颗粒是否发生潜在的团聚现象。初步结果显示该悬浮液不稳定（如结果部分所述）。随后，该分散体系也像研究中其他纳米材料一样，接受不同的超声处理。本研究的目的是验证通过相同的超声处理方案可实现对该悬浮液的去团聚。因此，Ag NPs模型可作为长期研究的基准，代表以优化形式实现颗粒再分散的效果。
本文所采用的分散方案与早期文献中发表的方法具有相似之处，并整合了以往研究人员提出的少量建议7,21,22,23,24,25。本研究采用系统化、分步式的方法，在整个分散过程中持续监测分散质量。该方法对纳米材料分散液进行实时表征，以确定最佳的实验分散条件（图1）。
<img alt="金属氧化物纳米材料超声处理流程图；用于颗粒分散分析的超声装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56074/56074fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 分散方案的流程图及逐步操作序列示意图。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56074/56074fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>二氧化铈纳米粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544841</td><td>&amp;lt;25&amp;nbsp;nm 粒径（BET）</td></tr><tr><td>氧化锌</td><td>欧洲委员会联合研究中心（JRC）</td><td>NM110</td><td>亲水性</td></tr><tr><td>氧化锌</td><td>欧洲委员会联合研究中心（JRC）</td><td>NM111</td><td>疏水性</td></tr><tr><td>多壁碳纳米管</td><td>NanoMile 项目（欧盟第七框架计划下的大型合作项目）</td><td>A32 (MWCNT1)</td><td>长度为 3.0&amp;plusmn;1.8 &amp;micro;m，O/C 比例为 4.5%</td></tr><tr><td>多壁碳纳米管</td><td>NanoMile 项目</td><td>A106 (MWCNT2)</td><td>长度为 3.3&amp;plusmn;2.4 &amp;micro;m，O/C 比例为 7%</td></tr><tr><td>银分散液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730785</td><td>粒径 10&amp;nbsp;nm（TEM），浓度 0.02&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Zetasizer 纳米粒度电位仪</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>用于粒径和Zeta电位测量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心式盘式离心机</td><td>CPS Instruments Inc.</td><td>Model DC 24000</td><td>通过离心沉降法测定粒径分布</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL USA</td><td>Jeol 1200EX TEM</td><td>明场图像、粒径、形貌、团聚情况分析</td></tr><tr><td>配备小瓶振荡器的超声探头</td><td>Hielscher</td><td>UIS250V</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>超声波清洗槽</td><td>Branson&amp;nbsp;</td><td>Model 1510</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>Eppendorf 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>2236411-1</td><td>容量 1.5 ml</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Jenson flight deck</td><td>Model 6800</td><td>表面等离子体共振（SPR）峰、悬浮液稳定性检测</td></tr><tr><td>一次性折叠毛细管池</td><td>Malvern Instruments</td><td>DTS 1070</td><td>用于电位测量</td></tr><tr><td>Zeta电位标准品</td><td>Malvern Instruments</td><td>DTS 1235</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Jasco</td><td>1103-0042</td><td>矩形石英池 10 x 100&lt;br/&gt; Spectrosil 石英带盖，适用波长范围 190–2700 nm</td></tr></tbody></table>

纳米材料在水相介质中的分散：迈向方案优化

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

超声处理过程常用于在水基介质中解团聚和分散纳米材料，这对于提高悬浮液的均一性和稳定性至关重要。本研究采用系统性的逐步方法，以确定实现稳定分散所需的最优超声条件。该方法已被采纳并证明适用于多种纳米材料（如二氧化铈、氧化锌和碳纳米管）在去离子（DI）水中的分散。然而，当纳米材料种类或分散介质发生任何改变时，均需通过调整超声时间、功率、超声设备类型以及过程中温度升高等因素，对基本方案进行优化。该方法详细记录分散过程，这对于识别超声过程中可能出现不良变化（例如颗粒表面损伤从而影响表面性质）的时间点及其他上述条件至关重要。我们的目标是提供一种协调统一的方法，以控制最终所制备分散液的质量。此类指南对于确保纳米科学界，特别是在纳米毒理学领域内分散质量的可重复性具有重要意义。

本文介绍了一种在水相介质中分散纳米材料的逐步操作方案，结合实时表征，以确定最佳的超声处理条件、强度和时间，从而在不破坏样品完整性的前提下，提高纳米粒子分散体系的稳定性和均匀性。

超声处理过程常用于在水基介质中解聚和分散纳米材料，这对于提高均匀性是必要的……

本实验的总体目标是利用实时表征技术，确定在水相介质中获得稳定且均一纳米材料分散液的最佳超声条件、强度和持续时间。该方法有助于解答纳米科学领域，特别是纳米毒理学领域中的关键问题，即如何在不损害样品完整性的前提下优化纳米颗粒的分散效果。该优化策略的主要优势在于能够提高对最终分散液质量的控制，从而确保实验的可重复性。开始实验前，校准配备有小瓶阻断式探头的探头式超声仪。然后使用洁净的金属刮勺，将两毫克选定的纳米粉末分别称量至三个洁净的10或20毫升玻璃小瓶中，并将小瓶编号为1至3。沿每个小瓶的内壁加入一毫升去离子水。对于疏水性样品，应使用一毫升体积分数为0.5%的乙醇水溶液。将每个样品混合成浓稠的糊状物，然后向糊状物中加入足够的去离子水，使最终样品浓度达到0.2毫克/毫升。水平旋转小瓶，使附着在内壁上的任何纳米粉末脱落。将每种纳米粉末分散液各1.5毫升转移至已标记相应编号的洁净微量离心管中。牢固封闭管盖，并轻轻旋转混匀，以使内壁上的纳米粉末完全脱落。然后，将样品放入超声探头中。以1.1瓦的功率对样品进行超声处理，脉冲设置为开启1秒、关闭1秒，持续2分钟。随后，从模块中取出样品一。从分散液顶部转移一毫升至另一干净的微量离心管中。向管中加入去离子水，使样品浓度达到每毫升0.02毫克。立即开始样品表征。在第一次超声处理结束10分钟后，使用相同的振幅和脉冲设置，对剩余样品进行4分钟的超声处理。用去离子水将样品二稀释至0.02毫克/毫升，并开始表征。第二次超声处理结束后10分钟，以相同的参数对样品三再进行4分钟的超声处理。将样品稀释至三到 0.02 毫克每毫升，并开始表征。首先，根据浴槽传感器校准超声波清洗仪。接着，使用洁净的刮勺将两毫克选定的纳米粉末分别放入四个洁净的玻璃小瓶中，编号为四至七。沿每个小瓶的管壁加入一毫升去离子水，并将粉末混匀成浓稠的糊状。添加去离子水，使每个小瓶中的样品浓度达到0.2毫克/毫升。盖紧小瓶后轻轻旋转混匀，以使附着在内壁上的纳米粉末脱落。将小瓶置于校准过的超声波清洗槽中央，确保液面高度达到小瓶的一半。在室温下以80瓦功率超声处理样品15分钟。然后，取一份样品四的等分试样转移至一个洁净的小瓶中。用去离子水将该等分试样稀释至 0.02 毫克/毫升，并开始表征。更换超声水浴中的水为新鲜的室温水，以避免热量积聚而影响分散液的性质。开始使用动态光散射评估粒径时，打开仪器软件并创建一个粒径测量文件。填写平衡时间、温度、比色皿类型和实验模式。保存粒径测量文件。然后，对粒径标称为100纳米的标准乳胶微球样品进行动态光散射（DLS）验证测量，确认仪器性能符合相应标准。接着，缓慢地将一毫升稀释的纳米粉体分散液用移液器加入洁净的低体积一次性比色皿中，注意避免产生气泡。将比色皿插入仪器并开始采集数据。每个样品至少测量五次。然后，选择所有测量值，并计算每个样品的平均值。将测量数据导出至电子表格程序以进行进一步分析。接下来，为了使用紫外-可见分光光度法开始样品表征，打开仪器软件并新建一个检测方法。用移液器吸取2至3毫升稀释的纳米粉体分散液，加入一支洁净的标准石英比色皿中。然后，将仪器的波长范围设置为从700纳米到200纳米。采集溶剂空白以进行背景扣除。每个样品至少采集三个光谱，并导出数据以供进一步分析。接下来，为了使用透射电子显微镜开始样品表征，将一滴稀释的纳米粉末分散液置于洁净的300目带孔碳膜上。在避免空气中污染物的条件下，让样品在常温下自然干燥。然后，用超纯水洗涤载网，以去除不均匀干燥带来的影响。获取透射电子显微镜（TEM）图像并导出以进行进一步分析。在分散之前，具有亲水或疏水表面特性的氧化锌纳米材料均表现出较大的颗粒平均尺寸和较高的多分散性。亲水性氧化锌在超声浴中超声处理15分钟后，颗粒尺寸和多分散性降低，但随着超声处理时间的延长，颗粒尺寸和多分散性又有所增加。透射电子显微镜（TEM）图像证实，颗粒在持续超声处理后发生再团聚。对疏水性氧化锌颗粒进行超声浴处理后，其粒径和多分散性减小，并在30分钟时趋于稳定。在疏水性氧化锌的TEM图像中观察到干燥效应，表明预先用乙醇润湿会导致粉末在碳载网上固定困难。超声探头处理亲水性粉末两分钟后，得到均匀且稳定的分散液。继续超声处理则导致快速再团聚。疏水性粉末也表现出类似行为。根据多分散性数值，亲水性和疏水性氧化锌粉末的最佳分散条件分别为在超声波清洗器中处理 60 分钟和 30 分钟。超声处理常用于在水相介质中解聚和分散纳米材料。然而，当纳米材料类型或分散介质发生任何改变时，优化策略必须重新进行优化。在进行该操作时，请务必校准超声设备，以确定其传递至悬浮液的有效声能。务必记录所评估的所有超声参数及时间点。一旦掌握，该技术可通过单独调整超声类型、时间和功率，并考虑过程中温度的上升，用于纳米材料在水或其他介质中的分散。

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纳米材料在水介质中的分散: 对协议优化的研究

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纳米材料在水相介质中的分散：迈向方案优化

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