筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

本筛选流程的总体目标是鉴定出能够抑制Toll样受体信号通路的新型生物活性纳米颗粒。该方法可帮助您从物理层面鉴定靶向先天免疫细胞中Toll样受体信号通路的新型纳米抑制剂。该技术的主要优势在于快速、稳健且易于利用报告细胞系统进行操作。

该技术的应用可拓展至多种炎症性疾病的治疗，因为已发现Toll样受体信号通路参与了这些疾病的发病机制。尽管该方法可用于金纳米颗粒的高通量筛选，也可应用于其他纳米颗粒体系以及治疗性小分子和生物制剂。开始此实验步骤前，请按照文本方案中所述准备培养基。

接下来，向一个洁净的 125 毫升玻璃烧瓶中加入 100 毫升超纯无内毒素水。加入一袋分泌型胚胎碱性磷酸酶底物粉末，轻轻旋转溶液直至完全溶解。在 37 摄氏度下孵育一小时，以确保底物完全溶解。

使用0.2微米滤膜过滤该溶液，并在4°C下保存至使用前。接下来，将一袋荧光素酶底物粉末加入含有25毫升超纯无内毒素水的50毫升离心管中。

待粉末完全溶解后，于4°C保存，可存放至多一周，待用。随后，按照文本方案配制所有其他试剂的储备液。细胞培养并制备完成后，将其从培养瓶转移至离心管中。

以300 × g离心细胞5分钟。随后，将细胞重悬于R-10培养基中，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。向细胞悬液中加入PMA溶液的等分试样，使终浓度为50 纳克/毫升。

将细胞悬液倒入无菌试剂储液槽中。使用多通道移液器，将100 µL细胞悬液转移至96孔平底培养板的每个孔中。于37 °C细胞培养箱中孵育24小时。

此后，使用真空抽吸装置小心吸除培养基。在倒置显微镜下观察细胞，确认所获得的巨噬细胞已贴附于孔板底部。每次用每孔 100 µL 的 PBS 轻柔洗涤细胞，共洗涤两次。

然后，向每个孔中加入 100 µL 新鲜的 R-10 培养基。将细胞置于 37°C 培养箱中静置两天，然后进行报告基因检测。首先，按照文本方案中所述确定最佳 LPS 剂量。

接下来，向新的96孔平底板的每孔中加入180微升预热的Quanti-Blue溶液。然后，将每个样品的20微升上清液转移至该板中。在37摄氏度孵育1至2小时，使颜色由粉红色变为深蓝色。

当光密度值超过1后，使用酶标仪测定655纳米处的吸光度。为开始分析IRF激活情况，将每个样品的10微升新鲜上清液转移至新的96孔透明平底白色板中。通过自动进样器，向每个孔中加入50微升荧光素酶溶液。

然后立即逐孔收集发光信号，绘制剂量反应曲线，以确定用于纳米颗粒筛选的最佳LPS浓度。接着，将20倍体积的肽-GMP杂合溶液加入1.5毫升Eppendorf离心管中，在18,000 × g条件下离心30分钟，小心弃去上清液。

将杂交体转移至一个新鲜的离心管中，用一毫升磷酸盐缓冲液洗涤两次。随后，将洗涤后的杂交体重悬于一体积的R-10培养基中。取浓缩的杂交体与含LPS的R-10培养基等体积混合，使杂交体和LPS的终浓度分别为100纳摩尔和每毫升10纳克。

接下来，从巨噬细胞培养板中移除培养基。每孔加入100微升杂交LPS混合物，每种条件设三个重复。设置阴性对照和LPS对照。

在37摄氏度下孵育24小时。然后，将每个孔中的培养基转移至单独的离心管中。在4摄氏度下，以18,000 ×g离心30分钟。

将上清液转移至新的96孔圆底板中。为开始对这些样品进行报告基因检测，向新的96孔平底板的每孔中加入180 µL预热的Quanti-Blue溶液。然后，将各样品的20 µL上清液转移至该平底板中。

在37摄氏度孵育一至两小时，直至深蓝色显色，光密度超过1。随后，使用酶标仪在655纳米处记录吸光度。接下来，将每个样品的10微升新鲜上清液转移至96孔透明平底白色板中。

使用自动加样器向每个孔中加入 50 µL 荧光素酶溶液，并立即逐孔记录发光信号。随后，验证潜在候选化合物的抑制作用，并按照文本方案中所述评估 TLR 特异性。在本研究中，NF-κB AP1 的激活通过 SEAP 比色法检测，其中 LPS 对 TLR-4 的激活可导致 NF-κB AP1 激活并产生 SEAP。

释放的SEAP可转化底物，导致颜色变化，其程度与刺激后释放的SEAP量成正比。通过测定655纳米处的吸光度来定量该变化。接下来，LPS介导的IRF激活导致荧光素酶表达，催化底物产生发光。

根据这些剂量反应结果，确定了用于筛选先前建立的肽-磷酸甘油酯杂合物文库的最佳脂多糖（LPS）浓度为每毫升10纳克。由此鉴定出一组杂合物，其能够有效抑制LPS触发的NF-κB、AP1和IRF的激活。验证该抑制活性显示，随着LPS浓度的增加，杂合物的抑制效应相应减弱，符合预期。

随后进行免疫印迹以确认抑制活性。结果显示，先导杂合分子能够降低p65的磷酸化水平，抑制I-κBα的降解，并延迟IRF3的磷酸化，证实该先导杂合分子P12能够抑制LPS介导的TLR-4信号通路。进一步研究表明，P12还可减弱TLR-2和TLR-5介导的NF-κB/AP1信号传导，以及TLR-3介导的IRF激活，提示P12对多种TLR通路均具有较强的抑制活性。

在完成该实验步骤后，还需进行免疫印迹和细胞毒性检测等其他检测，以验证筛选结果并避免假阳性发现。该技术建立后，为纳米医学领域的其他研究人员探索作为下一代信息治疗剂的Toll样受体信号通路中的纳米抑制剂铺平了道路。