Name: 筛选生物活性纳米颗粒在噬菌体免疫细胞中的Toll样受体信号传导抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解利用THP-1细胞报告系统筛选抑制Toll样受体信号传导的生物活性纳米颗粒的方法。该技术快速、稳健，适用于炎症性疾病治疗研究。

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作者感谢上海高校特聘教授（东方学者）计划（H.Y.）、上海市第一人民医院启动基金（H.Y.）、上海交通大学医学院高峰临床医学 grant 支持（H.Y.），以及加拿大克罗恩病和结肠炎基金会（CCFC）（S.E.T. 和 H.Y.）提供的资助。

1. 细胞培养基和试剂的准备
<ol>
	<li>通过向RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠，配制完全细胞培养基R10。
	<ol>
		<li>通过向 R10 培养基中添加抗生素 Zeocin（200 μg/mL）配制筛选培养基 R10-Z，以维持在 NF-κB/AP-1 激活调控下 SEAP 的表达。为筛选同时表达 SEAP 和荧光素酶报告基因的细胞，向 R10 培养基中添加 Zeocin（100 μg/mL）和 blasticidin（10 μg/mL）（即 R10-ZB）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将一袋底物粉末（e例如。，将QUANTI-Blue加入100 mL无内毒素的超纯水中，置于洁净的125 mL玻璃烧瓶中。
	<ol>
		<li>轻轻混匀溶液，并在37 °C下孵育1小时，以确保底物完全溶解。</li>
		<li>使用0.2 μm滤膜过滤溶液以确保其无菌性（可选），并于4 °C保存，可在2周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将一袋底物粉末溶解于适当溶剂中来配制荧光素酶底物溶液（例如，将QUANTI-Luc加入25 mL无内毒素的超纯水中，置于无菌50 mL离心管内。
	<ol>
		<li>完全溶解粉末后，应立即使用该溶液。或者，可将溶液于4 °C保存（最多一周）或于-20 °C保存（最多一个月），使用前取出。 
		注意：两种底物溶液均对光敏感，应尽可能避免光照。溶液的多次冻融循环可能导致底物不稳定，缩短其保质期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）溶于分子生物学级别的二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为500 μg/mL的储存液。取储存液分装（每管500 μL，含10 μL储存液），于-20 °C保存。</li>
	<li>用无菌无内毒素的水配制LPS（E-coli K12）储存液，浓度为5 mg/mL，并分装后于-20 °C长期保存。使用时将储存液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制成100 μg/mL的工作浓度LPS溶液，并于-20 °C保存备用。 
	注意：用于培养的试剂配制应在生物安全柜中进行，所有容器在使用前均需灭菌。应避免PMA和LPS溶液反复冻融。</li>
</ol>
2. THP-1 报告细胞来源的巨噬细胞的培养
<ol>
	<li>使用两种 THP-1 报告细胞系：THP-1-XBlue 和 THP-1-Dual 细胞。前者的 SEAP 报告基因受 NF-κB/AP-1 调控，后者的双报告基因系统包含相同的 SEAP 报告基因以及受 IRF 调控的荧光素酶基因。除筛选培养基不同外，两者的培养流程完全相同。
	<ol>
		<li>将工作细胞储备液（约 5 × 106 个细胞）在 10 mL R10 培养基中解冻，于 300 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 10 mL R10 培养基中，并转移至 T75 培养瓶中。每 2–3 天更换一次培养基，直至细胞密度达到 1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>当细胞生长达到饱和时，传代细胞以将密度降至 2–5 × 105 个细胞/mL 范围内，使细胞能够继续生长。</li>
		<li>至少传代一次后，开始在筛选培养基中培养细胞：THP-1-XBlue 使用 R10-Z 培养基，THP-1-Dual 使用 R10-ZB 培养基。在筛选培养基中至少传代一次后，细胞即可用于实验。 
		警告：细胞过度生长可导致显著的细胞死亡；细胞活力应保持在 &#62;98%。记录传代次数，因为细胞在多次传代后（&#62; 20 次）行为可能发生变化。 
		注：为节约成本，细胞培养瓶可重复使用多次；但此操作可能增加总体污染风险以及不同培养瓶之间的交叉污染风险（若同时处理不同细胞系）。在换液和传代过程中，离心条件设定为 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行报告基因检测，将细胞接种至 96 孔平底细胞培养板中，并将其分化为巨噬细胞。具体步骤如下所述。
	<ol>
		<li>将细胞从培养瓶转移至离心管中，于 300 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 R10 培养基中，调整细胞浓度至 1 × 106 个细胞/mL。向细胞悬液中加入 PMA 溶液，终浓度为 50 ng/mL。</li>
		<li>使用多通道移液器将 100 μL 细胞悬液加入 96 孔板的每个孔中。将培养板置于 37 °C（细胞培养箱中）孵育 24 小时。</li>
		<li>孵育结束后，使用真空抽吸装置（或移液器）小心吸除培养基，用 PBS 轻柔洗涤细胞两次（每次 100 μL/孔）；每孔加入 100 μL 新鲜 R10 培养基。在进行报告基因检测前，将细胞在培养箱中静置 2 天。 
		警告：静置步骤至关重要，可使细胞在 PMA 刺激后恢复至正常的静息状态，从而显著降低未刺激条件下报告基因的本底信号。 
		注：经 PMA 刺激 24 小时后，细胞分化为类巨噬细胞表型，表现为贴壁生长以及具有伪足的形态特征。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用报告细胞筛选潜在的 TLR4 纳米抑制剂
注意：由于 TLR4 信号通路同时利用 MyD88 依赖性和 TRIF 依赖性途径，因此被选为主要靶点，以涵盖广泛的 TLR 信号通路。THP-1-XBlue 报告细胞主要用于检测 NF-κB/AP-1 的激活，而 THP-1-Dual 细胞则用于检测 TRIF 依赖性信号转导中的 IRF 激活。
<ol>
	<li>通过在筛选前绘制剂量-反应曲线来确定最佳LPS剂量。
	<ol>
		<li>将工作浓度的LPS溶液用R10培养基稀释至终浓度为0.01 - 100 ng/mL（按10的对数倍进行梯度稀释）。根据实验板设计，在96孔圆底培养板中进行稀释操作。确保稀释后每孔溶液体积不少于110 μL。</li>
		<li>使用真空吸液器小心地从接种细胞的培养板（来自2.2.3）中移除培养基。</li>
		<li>将稀释板（3.1.1）中制备的含LPS的R10培养基按照样品布局转移至培养板中。将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育24 h。</li>
		<li>在24小时时，小心将上清液（80 μL/孔）转移至新的96孔圆底板中。立即对这些溶液进行比色法和/或荧光素酶发光检测，或在检测前于4 °C保存数小时，或于-20 °C保存数天。 
		注意：平板布局设计应简洁明了，便于实验操作与数据分析。每种实验条件应设置2-4个重复孔。务必包含阴性对照组（LPS空白组）。建议使用THP-1-XBlue细胞检测NF-κB/AP-1激活，因为Dual细胞在分化为巨噬细胞后NF-κB/AP-1激活背景相对较高。然而，Dual细胞也可用于同时报告NF-κB/AP-1和IRF的激活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开发用于NF-κB/AP-1活化的比色法检测以及用于IRF活化的荧光素酶发光检测。
	<ol>
		<li>为评估 NF-κB/AP-1 的激活情况，将每个样品的上清液 20 μL 转移至新的 96 孔平底培养板中，每孔加入 180 μL 预热的 SEAP 底物溶液。在 37 °C 孵育 1–2 小时，使颜色充分显色（由粉红色变为深蓝色）。使用酶标仪在 655 nm 处读取吸光度值。 
		注意：孵育时间可根据显色情况调整（30分钟至过夜孵育）。建议等待至颜色最深孔的光密度（O.D.）值超过1，同时避免显色饱和（O.D.） &#62;3).</li>
		<li>为分析IRF激活情况，将每个样本的上清液10 μL转移至96孔透明平底白色板中。加入荧光素酶溶液50 μL，并立即逐孔收集发光信号。 
		注意：强烈建议使用带有自动加样功能的发光检测仪，以确保孔间及板间发光读数的一致性。若手动加入底物溶液，请确保操作一致 &#160;孵育时间及每孔的读数设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有10 ng/mL LPS刺激的条件下，对多种肽-GNP杂合物进行筛选实验（依据3.1节）。按照3.2节中的相同步骤进行报告基因检测的建立。
	<ol>
		<li>将肽-GNP 杂交物用离心法浓缩至 R10 培养基中浓度为 200 nM。取 20 倍体积的杂交溶液（10 nM），在 18,000 × g 条件下离心 30 分钟，小心弃去上清液。收集管底的杂交物至新管中，用 PBS 洗涤两次，再将其重悬于 1 体积的 R10 培养基中。</li>
		<li>将等体积的浓缩杂合体与含LPS（20 ng/mL）的R10培养基混合，使杂合体和LPS的终浓度分别为100 nM和10 ng/mL。</li>
		<li>从培养板（2.2.3）中移除培养基，每孔加入 100 μL 混合溶液（每种条件设 3 个重复）；设置阴性对照组（仅培养基）和 LPS 对照组（10 ng/mL LPS，不含杂交体）。</li>
		<li>37 °C孵育24小时后，将每孔培养基转移至离心管中，在18,000 × g、4 °C条件下离心30分钟。收集上清液（每管50–80 μL）至96孔圆底板中，并按照3.2节所述方法进行报告基因检测。 
		注意：离心后弃去上清液时，切勿晃动管底的杂交物。 
		注意：步骤 3.3.4 中的离心操作对于从培养基中去除未被细胞内化的纳米粒子杂合体至关重要，可避免这些杂合体对比色法/发光检测信号的干扰。这是因为金纳米粒子会根据其尺寸和聚集状态吸收较宽范围的光波长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 验证潜在候选物的抑制作用
注意：为了验证筛选出的潜在候选化合物的抑制作用，采用两种方法。一种是固定杂合物浓度（或反之），检测刺激剂（LPS）的剂量反应；另一种是通过免疫印迹直接观察对NF-κB/AP-1和IRF3信号通路的抑制情况。
<ol>
	<li>在第一种方法中，使用100 nM的先导杂合分子，并在1 ng/mL和10 ng/mL两个LPS浓度下，按照3.3节所述相同步骤进行报告基因检测。同时包括一种无活性的杂合分子（基于筛选结果）作为杂合分子对照，用于比较。</li>
	<li>对于免疫印迹实验，请遵循标准的实验操作流程。
	<ol>
		<li>将THP-1细胞在R10培养基中培养，接种至12孔板（每孔2 × 106个细胞），并通过添加50 ng/mL PMA处理24小时使其分化为巨噬细胞，随后静置培养2天。</li>
		<li>细胞分化完成后，使用10 ng/mL LPS刺激细胞，同时或不同时加入杂合分子（100 nM），在不同时间点（0、5、15、30、60、120和240分钟）收集细胞裂解液用于免疫印迹分析。设置无活性杂合分子作为对照。</li>
		<li>检测IκBα、磷酸化p65和磷酸化IRF3的信号，以评估先导杂合分子对NF-κB和IRF3激活的抑制作用。以β-actin和总IRF3信号作为内参对照。 
		注意：信号转导通常发生较快（数小时内），而报告酶SEAP和荧光素酶的表达则需要较长时间（24小时）。建议同时在24小时时间点对测试的杂合分子进行细胞活力检测，作为另一种验证方法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 评估 TLR 特异性
注意：为了研究先导肽-GNP 杂合物对 TLR 的特异性，需检测其他 TLR 信号通路，包括 TLR2、TLR3 和 TLR5。TLR7、8 和 9 被排除在外，因为 THP-1 来源的巨噬细胞对这些 TLR 的刺激反应较差，原因是巨噬细胞不表达 TLR7、8 和 934。
<ol>
	<li>采用3.1和3.2节所述相同步骤，测试TLR2特异性配体（Pam3CSK4）、TLR3特异性配体（poly I:C）和TLR5特异性配体（flagellin）在1 ng/mL至25 μg/mL范围内不同浓度对两种报告细胞来源巨噬细胞的作用，以确定最佳浓度。</li>
	<li>用先导杂合分子（100 nM）与5.1步骤中确定浓度的各TLR配体混合物处理细胞，按照3.3节所述实验步骤评估先导杂合分子的抑制特异性。以无活性的杂合分子作为对照进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Beutler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLRs+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TLRs and innate immunity.</a> Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).</li>
<li>Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+localization+of+Toll-like+receptor+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes.</a> Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).</li>
<li>Palm, N. W., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptors+and+control+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity.</a> Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).</li>
<li>Kawasaki, T., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signaling pathways.</a> Front Immunol. 5, 461(2014).</li>
<li>Uematsu, S., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+Type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and Type I interferons.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).</li>
<li>Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signaling+in+primary+immune+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).</li>
<li>Drexler, S. K., Foxwell, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+toll-like+receptors+in+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of toll-like receptors in chronic inflammation.</a> Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).</li>
<li>O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+Toll-like+receptors+for+infectious+and+inflammatory+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).</li>
<li>Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+toll-like+receptor-2+and+-4+on+leukocytes+from+patients+with+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis.</a> Shock. 22 (5), 403-409 (2004).</li>
<li>Roger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+lethal+gram-negative+bacterial+sepsis+by+targeting+Toll-like+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).</li>
<li>Tsujimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Toll-like+receptors+in+the+development+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Role of Toll-like receptors in the development of sepsis.</a> Shock. 29 (3), 315-321 (2008).</li>
<li>Blohmke, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+as+an+anti-inflammatory+target+and+modifier+gene+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis.</a> J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).</li>
<li>Hartl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in cystic fibrosis lung disease.</a> J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).</li>
<li>Celhar, T., Fairhurst, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+in+systemic+lupus+erythematosus%3A+potential+for+personalized+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment.</a> Front Pharmacol. 5, 265(2014).</li>
<li>Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+Pathways+in+Autoimmune+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Rev+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases.</a> Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).</li>
<li>Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Toll-like+receptors%3A+emerging+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).</li>
<li>Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Toll-like+receptors%3A+a+decade+of+progress+in+combating+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases.</a> Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+DNA+nanoparticles+as+immunomodulatory+reagents+that+activate+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells.</a> J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).</li>
<li>Lemos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+STING+adaptor+attenuates+experimental+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis.</a> J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).</li>
<li>Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyplexes+assembled+from+self-peptides+and+regulatory+nucleic+acids+blunt+toll-like+receptor+signaling+to+combat+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity.</a> Biomaterials. 118, 51-62 (2017).</li>
<li>Tostanoski, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+Polyelectrolyte+Multilayers+to+Promote+Immunological+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance.</a> ACS Nano. , (2016).</li>
<li>Foit, L., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+potently+inhibit+cell+signaling+and+production+of+inflammatory+mediators+induced+by+lipopolysaccharide+binding+Toll-like+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4.</a> Biomaterials. 100, 67-75 (2016).</li>
<li>He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+particle+size+and+surface+charge+on+cellular+uptake+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).</li>
<li>Hirn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size-dependent+and+surface+charge-dependent+biodistribution+of+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration.</a> Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Arvizo, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+pharmacokinetics%2C+tumor+uptake+and+biodistribution+by+engineered+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles.</a> PLoS One. 6 (9), e24374(2011).</li>
<li>Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+the+pharmacokinetics%2C+biodistribution+and+intratumoral+penetration+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles.</a> J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).</li>
<li>Lin, P. J., Tam, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+pharmacokinetic%2Fpharmacodynamic+properties+of+therapeutic+nucleotides+using+lipid+nanoparticle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems.</a> Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).</li>
<li>Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ppsc.201300213/abstract">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li>
<li>Ospelt, C., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLRs+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TLRs and chronic inflammation.</a> Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).</li>
<li>Kuznik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+endosomal+TLR+inhibition+by+antimalarial+drugs+and+imidazoquinolines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines.</a> J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).</li>
<li>Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antimalarial+agents+in+the+treatment+of+SLE+and+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis.</a> Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).</li>
<li>Mullarkey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endotoxin+response+by+e5564%2C+a+novel+Toll-like+receptor+4-directed+endotoxin+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist.</a> J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).</li>
<li>Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+tetrasodium+%28E5564%29+treatment+for+sepsis%3A+review+of+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).</li>
<li>Rossignol, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+pharmacokinetics%2C+pharmacodynamics%2C+and+plasma+lipoprotein+distribution+of+eritoran+%28E5564%29+during+continuous+intravenous+infusion+into+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).</li>
<li>Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+pharmacodynamic+activity+of+eritoran+tetrasodium%2C+a+TLR4+antagonist%2C+during+intermittent+intravenous+infusion+into+normal+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers.</a> Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).</li>
<li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+trial+of+eritoran+tetrasodium+%28E5564%29%2C+a+toll-like+receptor+4+antagonist%2C+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis.</a> Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).</li>
<li>Opal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+eritoran%2C+an+antagonist+of+MD2-TLR4%2C+on+mortality+in+patients+with+severe+sepsis%3A+the+ACCESS+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial.</a> JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).</li>
<li>Fung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+marine+sponge+extracts+for+anti-inflammatory+agents+combined+with+chemical+genomics+identifies+girolline+as+an+inhibitor+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

由于 Toll 样受体（TLR）参与多种炎症性疾病的发病过程，它们已成为调节免疫反应和炎症状态的治疗靶点。然而，迄今为止，针对抑制 TLR 信号通路的治疗药物在临床开发中取得的成功十分有限。目前临床上使用的抗疟药物羟氯喹可抑制 TLR7 和 TLR935,36。&#160;类似地，仅有少数化合物进入临床试验，其中包括 TLR4 拮抗剂依立托兰（eritoran），其在临床前研究中对脂多糖（LPS）介导的炎症反应表现出强效抑制作用37,38，并在 I/II 期临床试验中显示出积极结果39,40,41，但最终 III 期试验未能降低重症脓毒症患者的死亡率42。该失败可能由多种因...

Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统中的关键组分之一，参与抵御感染的第一道防线。TLRs通过识别一系列病原体相关分子模式（PAMPs），并经由信号转导级联反应启动防御反应1,2。目前已鉴定出10种人类TLRs；除TLR10的配体尚不明确外，每种TLR均可识别一组独特且保守的PAMPs。例如，主要位于细胞膜表面的TLR2和TLR4分别可检测来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的脂蛋白和糖脂；而主要存在于内体区室中的TLR3、TLR7/8和TLR9则可感知病毒和细菌的RNA和DNA产物3。当受到PAMPs刺激时，TLRs通过释放促炎介质、募集并激活效应免疫细胞以及协调后续适应性免疫反应来触发重要的免疫应答4。
TLR信号转导可简单分为两条主要通路5,6。其中一条依赖于接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88），即MyD88依赖性通路。除TLR3外，所有TLR均利用此通路激活B细胞活化核因子κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-associated protein kinases, MAPKs），从而诱导促炎介质如TNF-α、IL-6和IL-8的表达。第二条通路利用含TIR结构域的接头蛋白诱导干扰素β（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β, TRIF），即TRIF依赖性或MyD88非依赖性通路，激活干扰素（interferon, IFN）调节因子（IFN regulatory factors, IRFs）和NF-κB，导致I型IFN的产生。完整的TLR信号传导对我们日常抵御微生物和病毒感染至关重要；TLR信号通路的缺陷可导致免疫缺陷，并常对人体健康造成严重危害。7
然而，TLR 信号通路是一把“双刃剑”，过度且不受控制的 TLR 激活是有害的。过度活跃的 TLR 反应参与了多种急性和慢性人类炎症性疾病的发病机制8,9。例如，脓毒症以全身性炎症和多器官损伤为特征，主要由对感染产生的急性、强烈的免疫反应所致，其中 TLR2 和 TLR4 在脓毒症的病理生理过程中起着关键作用10,11,12。此外，TLR5 被发现参与囊性纤维化患者慢性肺部炎症的发生13,14。而且，内体 TLR 信号通路的失调（如 TLR7 和 TLR9）与多种自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿关节炎（RA））的发生和发展密切相关15,16。这些汇聚的证据表明，TLR 信号通路可能是治疗多种炎症性疾病的潜在靶点17。
尽管在许多炎症性疾病中，药物对 TLR 反应的调控被认为具有治疗益处，但遗憾的是，目前临床上可用于抑制 TLR 信号通路的化合物非常有限9,17,18。这部分归因于 TLR 通路在免疫稳态和疾病病理过程中的复杂性与冗余性。因此，寻找能够靶向多个 TLR 信号通路的新型强效治疗剂，有望填补这一关键空白，并克服将 TLR 抑制剂推进临床应用所面临的挑战。
鉴于纳米科学与纳米技术的快速发展，纳米器件因其独特性质正成为新一代 Toll 样受体（TLR）调节剂19,20,23纳米级尺寸使这些纳米治疗剂具有更优的生物分布和持久的循环特性24,25,26可进一步进行功能化修饰，以满足所需的药效学和药代动力学特征27,28,29更令人振奋的是，这些新型纳米器件的生物活性源于其内在特性，这些特性可根据特定的医学应用进行定制，而不仅仅作为治疗剂的递送载体。例如，一种类似高密度脂蛋白（HDL）的纳米颗粒被设计用于通过清除TLR4配体LPS来抑制TLR4信号通路23.&#160;此外，我们开发了一种多肽-金纳米颗粒杂化系统，其中修饰的多肽可改变金纳米颗粒的表面特性，使其具备多种生物活性30,31,32,33这使得它们成为一类特殊的药物（或 &#34;纳米药物&#34;作为下一代纳米治疗剂。
在本实验方案中，我们介绍了一种用于鉴定新型肽-金纳米颗粒（peptide-GNP）杂合物的方法，这类杂合物可有效抑制吞噬性免疫细胞中的多条 Toll 样受体（TLR）信号通路32,33。该方法基于 commercially available THP-1 报告细胞系。报告细胞包含两种稳定的可诱导报告基因构建体：一种携带在 NF-κB 和激活蛋白 1（AP-1）转录因子可诱导启动子调控下的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因；另一种包含在干扰素调节因子（IRFs）可诱导启动子调控下的分泌型荧光素酶报告基因。当 TLR 被激活后，信号转导将导致 NF-κB/AP-1 和/或 IRFs 的活化，从而启动报告基因表达并分泌 SEAP 和/或荧光素酶；这些事件可通过分光光度计或发光仪使用相应的底物试剂轻松检测。利用该方法筛选我们先前建立的 peptide-GNP 杂合物文库，我们鉴定出能够强效抑制 TLR4 信号通路的候选分子。随后，我们通过免疫印迹等其他生化方法验证了这些先导 peptide-GNP 杂合物的抑制活性，并进一步评估了其对其他 TLR 通路的作用。该方法可实现对靶向 TLR 信号通路的新型分子的快速、高效筛选。

<table><tbody><tr><td>THP-1-XBlue 报告细胞</td><td>InvivoGen</td><td>thpx-sp</td><td>细胞传代次数保持在 20 代以内</td></tr><tr><td>THP-1-Dual 报告细胞</td><td>InvivoGen</td><td>thpd-nfis</td><td>细胞传代次数保持在 20 代以内</td></tr><tr><td>RPMI-1640（不含 L-谷氨酰胺）</td><td>GE Health Care</td><td>SH30096.02</td><td>使用前预热至 37 &amp;deg;C；添加补充剂配制成完全培养基 R10</td></tr><tr><td>胎牛血清（经鉴定合格）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td>热灭活处理；在 RPMI-1640 中终浓度为 10%</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>在完全培养基 R10 中终浓度为 2 mM</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>在完全培养基 R10 中终浓度为 1 mM</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（1×，不含钙、镁离子）</td><td>GE Health Care</td><td>SH30028.02</td><td>用于细胞洗涤和试剂配制</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td>SEAP 底物</td></tr><tr><td>QUANTI-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qlc2</td><td>荧光素酶底物</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td>报告细胞筛选用抗生素</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>anti-bl-1</td><td>报告细胞筛选用抗生素</td></tr><tr><td>分子生物学级二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>用于试剂配制</td></tr><tr><td>分子生物学级佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>用于细胞分化</td></tr><tr><td>大肠杆菌 K12 来源脂多糖（LPS）</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td>TLR4 配体</td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pms</td><td>TLR2/1 配体</td></tr><tr><td>高分子量 Poly (I:C)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pic</td><td>TLR3 配体</td></tr><tr><td>鼠伤寒沙门氏菌来源鞭毛蛋白（FLA-ST），超纯</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-epstfla</td><td>TLR5 配体</td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384 型酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>用于比色法检测</td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro 型带注射器多功能酶标仪</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>用于化学发光检测</td></tr><tr><td>Microfuge 22R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>温度可控微型离心机（最高可达 18,000 g）</td></tr><tr><td>Allegra X-15R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>温度可控通用离心机（适用于细胞培养）</td></tr><tr><td>Costar 96 孔检测板，白色，透明平底，经组织培养处理</td><td>Corning Costar</td><td>3903</td><td>用于发光检测</td></tr></tbody></table>

筛选吞噬性免疫细胞中抑制toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll样受体（TLR）反应的药物调节在多种炎症性疾病的治疗中具有广阔前景。然而，迄今为止可用于减弱TLR信号通路的化合物十分有限，临床上尚无获批使用的TLR抑制剂（除抗疟药羟氯喹外）。随着纳米技术的快速发展，利用纳米装置调控免疫应答可能为治疗这些疾病提供一种新策略。本文介绍一种高通量筛选方法，可用于快速鉴定可抑制吞噬性免疫细胞中TLR信号通路的新型生物活性纳米颗粒。该筛选平台基于THP-1细胞系构建的报告细胞，结合比色法和荧光素酶检测技术。报告细胞由人源单核细胞系THP-1通过稳定整合两个可诱导报告基因构建而成：其中一个在受转录因子NF-κB和AP-1诱导的启动子控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因，另一个在受干扰素调节因子（IRFs）诱导的启动子控制下表达分泌型荧光素酶报告基因。当TLR被激活时，报告细胞中的转录因子被激活，进而产生SEAP和/或荧光素酶，可通过相应的底物试剂进行检测。以我们先前研究建立的多肽-金纳米颗粒（GNP）杂合物文库为例，我们鉴定出一种能够有效抑制TLR4信号通路两条分支的多肽-GNP杂合物，该通路由其典型配体脂多糖（LPS）所激活。研究结果通过免疫印迹等标准生物化学技术得到了验证。进一步分析表明，该优势杂合物具有广谱抑制活性，可作用于包括TLR2、TLR3、TLR4和TLR5在内的多个TLR信号通路。该实验方法可快速评估某种纳米颗粒（或其他治疗性化合物）是否能够调节吞噬性免疫细胞中特定的TLR信号通路。

整体实验方案如图1所示。两种THP-1报告细胞系THP-1-XBlue和THP-1-Dual分别用于通过检测NF-κB/AP-1和IRF的激活来快速筛选TLR反应。NF-κB/AP-1的激活可通过SEAP比色法检测，而IRF的激活则通过荧光素酶发光进行监测。单核THP-1细胞可轻松诱导分化为巨噬细胞，用于筛选纳米器件对固有吞噬性免疫细胞的免疫调节活性。借助该报告系统，筛选可实现高通量进行；该方法具有良好的通用性，适用于发现新的免疫治疗药物，特别是靶向TLR等固有免疫信号通路的药物。
筛选流程及代表性结果如下所示 图2简而言之，将报告细胞接种于96孔板中，并诱导其分化为巨噬细胞（图2A 和 2B）。首先测试不同...

Toll样受体（TLR）信号通路在多种人类炎症性疾病的病理生理过程中发挥重要作用，而通过生物活性纳米颗粒调控TLR反应有望在多种炎症状态下产生有益效果。基于THP-1细胞的报告细胞系统为筛选新型TLR信号通路抑制剂提供了一个多功能且可靠的筛选平台。

筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

Toll样受体（TLR）反应的药物调控在多种炎症性疾病的治疗中具有广阔前景。然而，迄今为止……

本筛选方法的总体目标是鉴定能够抑制Toll样受体信号通路的新型生物活性纳米颗粒。该方法可帮助您从物理层面鉴定靶向先天免疫细胞中Toll样受体信号通路的新型纳米抑制剂。该技术的主要优势在于快速、稳健且易于通过报告细胞系统进行操作。该技术的应用可拓展至多种炎症性疾病的治疗，因为已发现Toll样受体信号通路参与了这些疾病的发病机制。尽管该方法可高效筛选金纳米颗粒，也可应用于其他纳米颗粒系统以及治疗性小分子和生物制剂。开始此操作前，请按照文本方案中所述准备培养基。接下来，将 100 毫升超纯无内毒素水加入洁净的 125 毫升玻璃烧瓶中。加入一袋分泌型胚胎碱性磷酸酶底物粉末，轻轻旋转混匀，直至溶液完全溶解。在 37 摄氏度下孵育一小时，以确保底物完全溶解。使用 0.2 微米滤膜过滤溶液，4 摄氏度保存备用。接下来，将一袋荧光素酶底物粉末加入含有 25 毫升超纯无内毒素水的 50 毫升离心管中。待粉末完全溶解后，于4°C保存，可存放至多一周，待用。随后，按照文本方案配制所有其他试剂的储备液。细胞培养并制备完成后，将其从培养瓶转移至离心管中。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。然后将细胞重悬于R-10培养基中，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。向细胞悬液中加入PMA溶液，使其终浓度为50 纳克/毫升。将细胞悬液倒入无菌试剂储液槽中。使用多通道移液器，将100 µL细胞悬液转移至96孔平底培养板的每个孔中。于37°C细胞培养箱中孵育24小时。此后，使用真空抽吸装置小心吸除培养基。在倒置显微镜下观察细胞，确认所获得的巨噬细胞已贴壁附着于孔底。每孔每次用100微升磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞，共洗涤两次。然后，向每个孔中加入100微升新鲜的R-10培养基。将细胞置于37摄氏度培养箱中静置两天，随后进行报告基因检测。首先，按照文本方案中所述确定最佳LPS剂量。接下来，向一个新的96孔平底板的每孔中加入180微升预热的Quanti-Blue溶液。然后，将各样本的20微升上清液转移至该板中。在37摄氏度下孵育一至两小时，使颜色由粉红色变为深蓝色。当光密度值超过1后，使用酶标仪测定655纳米处的吸光度。为开始分析IRF激活情况，将每个样品的10微升新鲜上清液转移至新的96孔透明平底白色板中。通过自动进样，向每孔加入50微升荧光素酶溶液。然后立即逐孔收集发光信号，绘制剂量反应曲线，以确定用于纳米颗粒筛选的最佳LPS浓度。接着，将20倍体积的肽-GMP杂合溶液在1.5毫升Eppendorf离心管中于18,000 × g离心30分钟。小心弃去上清液。将杂交体转移至一个新鲜的离心管中，用一毫升磷酸盐缓冲液洗涤两次。随后，将洗涤后的杂交体重悬于一体积的R-10培养基中。取浓缩的杂交体与含LPS的R-10培养基等体积混合，使杂交体和LPS的终浓度分别为100纳摩尔和每毫升10纳克。接下来，从巨噬细胞培养板中移除培养基。每孔加入 100 微升杂交 LPS 混合物，每种条件设三个重复孔。设置阴性对照和 LPS 对照。在37摄氏度下孵育24小时。然后，将每个孔中的培养基转移至单独的离心管中。在4摄氏度下，以18,000 ×g离心30分钟。将上清液转移至新的96孔圆底板中。为开始对这些样品进行报告基因检测，在新的96孔平底板的每孔中加入180 µL预热的Quanti-Blue溶液。然后，将每个样品的20 µL上清液转移至该板中。在37摄氏度孵育一至两小时，直至深蓝色显色，光密度超过1。随后，使用酶标仪在655纳米处记录吸光度。接下来，将每个样品的10微升新鲜上清液转移至96孔透明平底白色板中。使用自动加样器向每个孔中加入 50 µL 荧光素酶溶液，并立即逐孔记录发光信号。随后，验证潜在候选化合物的抑制效果，并按照文本方案中所述评估 TLR 特异性。在本研究中，NF-κB AP1 的激活通过 SEAP 比色法检测，其中 LPS 对 TLR-4 的激活可导致 NF-κB AP1 激活并产生 SEAP。释放的SEAP会转化底物，导致颜色变化，其强度与刺激后释放的SEAP量成正比。通过测定655纳米处的吸光度来定量该反应。接下来，LPS介导的IRF激活导致荧光素酶表达，催化底物产生发光信号。根据这些剂量反应结果，确定了用于筛选已建立的肽-单磷酸鸟苷（GMP）杂合物文库的最佳脂多糖（LPS）浓度为每毫升10纳克。由此鉴定出一组杂合物，其能够有效抑制LPS触发的NF-κB、AP1和IRF的激活。对该抑制活性的验证表明，随着LPS浓度的增加，杂合物的抑制作用相应减弱，符合预期结果。随后进行免疫印迹以确认抑制活性。结果显示，先导杂合分子可降低p65的磷酸化水平，抑制I-κBα的降解，并延迟IRF3的磷酸化，证实该先导杂合分子P12能够抑制LPS介导的TLR-4信号通路。进一步研究表明，P12还可减弱TLR-2和TLR-5介导的NF-κB和AP1信号通路，以及TLR-3介导的IRF激活，提示P12对多种TLR通路均具有较强的抑制活性。完成此操作后，还需进行免疫印迹和细胞毒性检测等其他检测，以验证筛选结果并避免假阳性发现。该技术建立后，为纳米医学领域的其他研究人员探索作为下一代信息治疗剂的Toll样受体信号通路中的纳米抑制剂铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

筛选生物活性纳米颗粒在噬菌体免疫细胞中的Toll样受体信号传导抑制剂

唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。...

检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

本文介绍了一种利用多光谱成像流式细胞术定量分析聚酸酐纳米颗粒或细菌被RAW...

利用多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒与细菌的细胞内化作用

取人单核细胞来源的类似小胶质细胞的培养物。将含有抗炎药物的纳米颗粒加入实验组培养物中，将游离药物加入对照组。这些纳米颗粒具有亲水性外壳和疏水性核心，可包载脂溶性药物。细胞通过内吞作用摄取纳米颗粒，纳米颗粒在细胞内释放药物，从而增强药物递送效果。游离药物通过被动扩散进入细胞，该过程受浓度梯度限制，导致细胞内浓度较低。添加一种可结合Toll样受体并触发促炎性细胞因子释放的细菌抗原。将实验组的培养物与含有纳米颗粒的新鲜培养基共同孵育，对照组则与游离药物共同孵育。第二次给药通过纳米颗粒递送确保了稳定的治疗药物浓度，从而诱导下游信号通路，抑制细胞因子的产生。游离药物摄取有限，导致细胞内浓度低于治疗水平。收集上清液以检测细胞因子水平，并评估纳米颗粒介导的药物递送所增强的治疗效果。...

纳米颗粒介导的抗炎药物在类小胶质细胞中的增强递送

本视频展示了一种基于报告细胞的检测方法，用于筛选可抑制Toll样受体（TLR）信号通路的潜在生物活性纳米颗粒。该检测方法包括将脂多糖（LPS）与肽-金纳米颗粒杂合物混合后加入报告巨噬细胞中，这些细胞表达报告蛋白——分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）和荧光素酶。通过检测报告信号的变化，评估杂合物对LPS诱导的TLR信号通路的抑制作用。...

一种用于筛选抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒的检测方法

在本实验方案中，我们描述了利用 Amaxa Nucleofector 96 孔 Shuttle 系统将 siRNA...

利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。...

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内...

聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

本方案为研究人员提供了一种快速、间接的方法，用于检测小鼠巨噬细胞系在响应多种聚合物表面及吸附蛋白层时，TLR依赖性的NF-кB/AP-1转录因子活性，这些表面和蛋白层可模拟生物材料植入物的微环境。...

一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法

了解利用THP-1细胞报告系统筛选抑制Toll样受体信号传导的生物活性纳米颗粒的方法。该技术快速、稳健，适用于炎症性疾病治疗研究。

筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

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