筛选生物活性纳米颗粒在噬菌体免疫细胞中的Toll样受体信号传导抑制剂
2017年7月26日
Toll样受体（TLR）信号在许多人类炎性疾病的病理生理学中起着重要作用，并且预期在许多炎症状态下调节生物活性纳米颗粒的TLR应答是有益的。基于THP-1细胞的报道细胞提供了一个通用和强大的筛选平台，用于鉴定TLR信号传导的新型抑制剂。
该筛选程序的总体目标是确定可以抑制 toll 样受体信号传导的新型生物活性纳米颗粒。该方法可以帮助您物理识别先天免疫细胞中靶向 toll 样受体信号传导的新型纳米抑制剂。该技术的主要优点是它快速、稳健且易于使用报告细胞系统进行。
该技术的应用扩展到许多炎症性疾病的治疗，因为发现 toll 样受体信号传导参与这些疾病的发病机制。虽然这种方法可以提供对金纳米颗粒的高筛选，但它也可以应用于其他纳米颗粒系统以及治疗性小分子和生物学。要开始此过程，请按照文本方案中的概述准备培养基。
接下来，将 100 毫升无内毒素的超纯水加入干净的 125 毫升玻璃瓶中。加入一袋分泌的胚胎碱性磷酸酶底物粉末，轻轻旋转溶液直至完全溶解。在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以确保底物完全溶解。
使用 0.2 微米膜过滤溶液。在 4 摄氏度下储存直至准备使用。接下来，将一袋荧光素酶底物粉末加入装有 25 毫升超纯无内毒素水的 50 毫升离心管中。
粉末完全溶解后，在 4 摄氏度下储存长达一周，直到准备好使用。然后，按照文本方案中的概述制备所有其他试剂的储备液。培养和制备细胞后，将它们从培养瓶转移到离心管中。
以 300 倍 G 的浓度离心细胞 5 分钟。然后，将它们重悬于 R-10 培养基中，浓度为 1 X 10 至 6 个细胞/毫升。将 PMA 溶液的等分试样添加到细胞悬液中，使最终浓度为 50 ng/mL。
将细胞悬液倒入无菌试剂储液槽中。使用多通道移液器，将 100 μL 细胞悬液转移到 96 孔平底培养板的每个孔中。在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育 24 小时。
在此之后，使用真空抽吸器小心地去除培养基。使用倒置显微镜检查细胞以确保衍生的巨噬细胞粘附在孔的底部。每次洗涤使用每孔 100 μL PBS 轻轻洗涤细胞两次。
然后，向每个孔中加入 100 微升新鲜 R-10 培养基。在进行报告基因测定之前，让细胞在 37 摄氏度的培养箱中静置两天。首先，按照文本方案中概述确定最佳 LPS 剂量。
接下来，将 180 μL 预热的 Quanti-Blue 溶液添加到新的 96 孔平底板的每个孔中。然后，将每个样品中的 20 μL 上清液转移到板中。在 37 摄氏度下孵育 1 到 2 小时，让颜色从粉红色变成深蓝色。
光密度大于 1 后，使用读板器确定 655 纳米处的吸收。要开始分析 IRF 活化，请将每个样品中的 10 微升新鲜上清液转移到新鲜的 96 孔透明平底白板中。使用自动进样，向每个孔中加入 50 微升荧光素酶溶液。
然后立即逐井收集发光以产生剂量反应曲线，以确定纳米颗粒筛选的最佳 LPS 浓度。接下来，将 20 体积的肽-GMP 杂化溶液放入 1.5 mL的 Eppendorf 管中，以 18， 000 倍 G 离心 30 分钟。小心丢弃上清液。
将杂交体转移到单个新试管中，并用 1 毫升 PBS 洗涤两次。在此之后，将洗涤的杂交体重悬于一体积的 R-10 培养基中。混合等体积的浓缩杂交体和含有 R-10 的 LPS 培养基，使得杂交体和 LPS 的最终浓度分别为 100 纳摩尔和 10 纳克/毫升。
接下来，从巨噬细胞培养板中取出培养基。向每个孔中加入 100 μL 杂交 LPS 混合物，每种条件重复 3 次。包括一个阴性对照和一个 LPS 对照。
在 37 摄氏度下孵育 24 小时。然后，将每个孔的培养基转移到单独的离心管中。将试管在 18， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 30 分钟。
将上清液转移到新的 96 孔圆底板中。要开始对这些样品进行报告基因分析，请在新的 96 孔平底板的每个孔中加入 180 μL 预热的 Quanti-Blue 溶液。然后，将每个样品中的 20 微升上清液转移到该板中。
在 37 摄氏度下孵育 1 到 2 小时，直到深蓝色发展到光密度超过 1 小时。在此之后，使用读板器记录 655 纳米处的吸收。接下来，将每个样品中的 10 微升新鲜上清液转移到 96 孔透明平底白板中。
使用自动进样器，向每个孔中加入 50 微升荧光素酶溶液，并立即逐孔记录发光。然后，验证潜在候选药物的抑制作用，并评估文本方案中概述的 TLR 特异性。在本研究中，通过 SEAP 比色法检测 NF-Kappa B AP1 的激活，其中 LPS 激活 TLR-4 导致 NF-Kappa B AP1 的激活和 SEAP 的产生。
释放的 SEAP 会转化底物，导致颜色变化与刺激时释放的 SEAP 量成正比。这可以通过测量 655 纳米处的吸光度来量化。接下来，LPS 介导的 IRF 激活导致荧光素酶的表达，催化底物产生发光。
从这些剂量反应中确定 10 ng/mL 的最佳 LPS 浓度，以筛选先前建立的肽-GMP 杂交体库。由此，确定了一组杂交体，因为它们具有抑制 NF-Kappa B AP1 和 IRF 的 LPS 触发激活的强大能力。这种抑制活性的验证表明，随着 LPS 浓度的增加，杂交种的抑制作用会降低，正如预期的那样。
然后进行免疫印迹以确认抑制活性。观察到先导杂交体减少 p65 磷酸化，抑制 I-Kappa B α 降解，并延迟 IRF3 磷酸化，证实先导杂交体 P12 能够抑制 LPS 介导的 TLR-4 信号传导。进一步研究表明，P12 还减少了 TLR-2 和 TLR-5 介导的 NF-Kappa B AP1 信号传导，以及 TLR-3 介导的 IRF 激活，表明 P12 对多个 TLR 通路具有有效的抑制活性。
在此程序之后，将执行其他措施，如免疫印迹和细胞毒性测定，以验证筛查结果并避免假阳性发现。开发后，这项技术为纳米医学领域的其他研究人员探索 toll 样受体信号转导中的纳米抑制剂作为下一代和信息疗法铺平了道路。
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概述
本文讨论了一种筛选程序，旨在识别抑制 Toll-like 受体 (TLR) 信号传导的新型生物活性纳米颗粒。该方法利用基于 THP-1 细胞的报告系统，这些系统快速、稳定且易于操作，使其适用于炎症性疾病的治疗应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 纳米技术
背景
- Toll-like 受体信号传导与各种炎症性疾病有关。
- 生物活性纳米颗粒可能通过调节 TLR 反应提供治疗益处。
- THP-1 细胞作为筛选潜在抑制剂的多功能平台。
- 这种技术可以适应各种纳米颗粒系统和治疗性小分子。
研究目的
- 识别靶向 TLR 信号传导的新型纳米抑制剂。
- 开发用于潜在治疗应用的稳健筛选方法。
- 增强对先天免疫细胞中 TLR 信号传导的理解。
使用的方法
- 按照协议准备培养基。
- 利用基于 THP-1 细胞的报告系统进行筛选。
- 该方法应用于各种纳米颗粒系统。
- 评估生物活性纳米颗粒在抑制 TLR 信号传导中的有效性。
主要结果
- 筛选方法快速且稳定。
- 可以用金纳米颗粒实现高通量筛选。
- 该技术可以适应其他纳米颗粒系统和小分子。
- 识别了在治疗炎症性疾病中的潜在应用。
结论
- 该方法提供了识别 TLR 信号传导抑制剂的有价值工具。
- 生物活性纳米颗粒在炎症治疗应用中具有前景。
- 需要进一步研究以探索该筛选方法的全部潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This screening method enables rapid identification of bioactive nanoparticles that modulate Toll-like receptor signaling in phagocytic immune cells, addressing a critical gap in anti-inflammatory therapeutic development. By providing a high-throughput, reporter-based assay for dual-pathway TLR inhibition (NF-κB/AP-1 and IRF), it supports early target de-risking and lead identification in immunology-focused discovery programs. The approach is directly applicable to nanoparticle library screening and can be extended to small molecules, offering a scalable platform for mechanistic validation of immunomodulatory candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by measuring nanoparticle effects on both MyD88-dependent and TRIF-dependent TLR signaling pathways.
- Operational Value: Uses stable THP-1 reporter lines to enable consistent, quantitative readouts of SEAP and luciferase activity across screening campaigns.
- Predictive Value: Identifies leads with broad inhibitory spectra (e.g., TLR2, 3, 4, 5) to support pathway de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares nanoparticle-LPS complexes via centrifugation and washing to remove free ligands and ensure accurate dosing.
- Quantitative Output: Generates colorimetric (SEAP) and luminescent (luciferase) signals proportional to pathway activation, enabling dose-response profiling.
- Scalability: Compatible with 96-well formats and multi-channel pipetting for high-throughput screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Validated hits show inhibition across multiple TLRs implicated in inflammatory diseases, supporting translational continuity.
- Mechanistic De-risking: Confirms inhibition via immunoblotting of p65 phosphorylation, IκBα degradation, and IRF3 activation to rule out assay artifacts.
- Preclinical Alignment: Uses phagocytic immune cells (THP-1-derived macrophages) to model human innate immune responses relevant to in vivo efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions before investing in lead optimization or preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying nanoparticle-mediated suppression of TLR-driven transcription factor activation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (OD655 and luminescence) that enable comparison of nanoparticle efficacy and potency.
- Analytics: Generates dose-response curves from SEAP and luciferase readouts to determine inhibitory concentration (IC50) and selectivity across TLR pathways.
- Translational Research: Connects nanoparticle effects in human immune cells to disease-relevant TLR signaling cascades involved in chronic inflammation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform adaptable to diverse nanoparticle compositions, core formulations, and therapeutic small molecules.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by confirming inhibition of both NF-κB and IRF arms of TLR signaling, reducing false positives in immunomodulator screening.
- Operational Value: Employs robust, easy-to-perform reporter assays with minimal hands-on time and standardized reagent preparation (Quanti-Blue, luciferase substrate).
- Strategic Value: Enables early identification of broad-spectrum TLR inhibitors, improving capital efficiency by filtering out pathway-specific compounds with limited therapeutic utility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by validating hits with orthogonal methods (immunoblotting) and assessing cytotoxicity to avoid false positives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, reporter assay optimization, and nanoparticle handling to maintain reproducibility.
- Dependent on access to plate readers capable of absorbance (655 nm) and luminescence detection for dual-readout analysis.
- Necessitates standardized nanoparticle purification (centrifugation, washing) to eliminate free LPS or contaminants that could confound results.
- Requires adaptation of LPS dosing and nanoparticle concentration ranges based on particle size, charge, and aggregation behavior in R-10 medium.
- Practical limitation: Assay sensitivity may be affected by nanoparticle quenching or interference with colorimetric/luminescent substrates, requiring counter-screening controls.
