一种用于异源蛋白复合物- DNA 相互作用研究的改良酵母单杂交系统

本实验的总体目标是在常规实验室条件下，于异源系统中研究并验证异源蛋白复合物与DNA之间的相互作用，以服务于各种功能基因组学研究。该方法有助于解答功能基因组学领域中的关键问题，例如计划性基因组学。该技术的主要优势在于能够检测涉及多个蛋白质或转录因子的蛋白质-DNA相互作用。

从指定为第一天的下午开始此操作。从新划线的培养皿中，在不含尿嘧啶的合成定义培养基（SD培养基）中接种5毫升培养物。在30°C摇床中过夜培养。

次日下午，取500微升过夜培养物接种于10毫升YPDA培养基中，于30°C摇床中过夜培养。次日清晨，取2毫升过夜培养物接种于100毫升YPDA培养基中，在30°C下培养至600纳米处的光密度达到0.4至0.8。

在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟。弃去上清液。加入10 mL无菌水，通过涡旋振荡重悬沉淀。

在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，加入2 mL TE醋酸锂溶液，通过涡旋振荡重悬沉淀。在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟。

弃去上清液。加入4毫升TE醋酸锂溶液和400微升鲑鱼精子DNA，用移液器吹打重悬沉淀。细胞现已被制备完毕，可用于转化，如下一节所示。

在96孔U型底混合板中进行细胞的共转化。首先，向96孔板的每孔中加入20微升感受态细胞。然后，向各孔中分别加入150纳克的两种质粒以及归一化对照。

该示意图展示了将目的蛋白共转化至酵母细胞时平板的常规设置。可根据实验需求以及所检测的DNA区域或片段数量对平板设置进行调整。每孔加入100 µL TE缓冲液、醋酸锂和聚乙二醇，通过移液吹打混匀三次。

用透气封膜封住培养板，在30摄氏度下孵育20至30分钟。在42摄氏度下精确热激20分钟。热激结束后，在21摄氏度下以1000 × g离心5分钟。

使用多通道移液器去除上清液。加入110 µL TE缓冲液并混匀。再次离心5分钟。

从每个孔中移除 100 微升上清液。将打孔器浸入 100% 乙醇中，用火焰灼烧，等待一分钟使打孔器针头冷却，然后使用无菌打孔器重悬沉淀。将细胞转移至缺乏色氨酸和亮氨酸的 SD 液体培养基平板上。

将平板在30摄氏度下孵育两天。第五天下午，从培养箱中取出螺旋平板。向无菌96孔U型底混合板的每孔中加入50 µL TE缓冲液。用TE缓冲液预润湿无菌打孔器，从SD色氨酸和亮氨酸缺失平板上打取菌落，并将其重悬于盛有TE缓冲液的孔板中。

将菌落转移至新的SD色氨酸和亮氨酸缺失琼脂平板上，以获得最佳的表面覆盖。在30°C条件下培养平板2天。第7天下午，从培养箱中取出琼脂平板。

向无菌的96孔U型底混样板的每个孔中加入50微升SD色氨酸和亮氨酸缺失培养基。向无菌的96深孔板的每个孔中加入180微升SD色氨酸和亮氨酸缺失培养基。对打孔器进行灭菌，用培养基预润湿打孔器，并将菌落从平板转移至各含有50微升培养基的孔中。

将20微升酵母转移至180微升SD色氨酸和亮氨酸缺失培养基中。用透气封膜密封板孔，于30°C振荡培养36小时。第九天上午，将100微升培养物转移至已灭菌的96深孔板中含500微升YPDA培养基的孔内。

用透气封膜封盖，于30摄氏度、200 rpm振荡培养3至5小时。3至5小时后，重新混匀菌液，从每个孔中转移125微升至分光光度计检测板中。在600纳米处测定光密度，确保其值介于0.3至0.6之间。

将深孔板中的剩余细胞在3000 × g、21 °C条件下离心10分钟。通过倒置去除上清液。向每孔中加入200 µL Z缓冲液，并涡旋混匀。

在3000 ×g、21 °C条件下离心5分钟。通过倒置去除上清液。向每孔加入21 µL Z缓冲液，并涡旋振荡。

用能够耐受冻融循环的密封膜覆盖酶标板。在通风橱中，使用液氮和42摄氏度水浴进行4次冻融循环。向每个孔中加入200 µL新配制的Z缓冲液-β-巯基乙醇-ONPG溶液。

在30摄氏度下孵育17至24小时，或直至颜色显现。第10天早晨检查颜色是否已显现。每孔加入110微升1摩尔碳酸钠以终止反应。

记录时间并涡旋混匀酶标板。在21摄氏度下以3000 × g离心10分钟。使用多通道移液器将每孔125微升上清液转移至分光光度计检测板。

在420纳米处测定光密度。按照文本方案中所述，在电子表格中计算β-半乳糖苷酶活性。本研究中，从转录起始位点上游2600个碱基对的启动子区域被划分为六个区域或片段。

此照片是实验方案第五天后生长良好且结果为阳性的平板示例。在此代表性结果中，DNA 片段一和片段四显示出与蛋白 A 和 B 复合物的阳性相互作用。通过测定β-半乳糖苷酶活性，片段一的报告基因活性显示出四倍的诱导。

需要牢记的是，该实验步骤仅在确认了目标蛋白质-蛋白质相互作用之后，才被推荐用于获取DNA区域的相关信息，而并不适用于确定靶位点。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法（如染色质免疫沉淀实验和Msar）来回答更多问题，例如在体内鉴定靶位点。

观看本视频后，您应能充分理解如何检测并验证多聚体蛋白复合物结合共同DNA靶标的生物学作用。