用于异构蛋白复合物 - DNA相互作用研究的修饰的酵母一杂交系统

这里描述的修饰的酵母单杂交测定法是经典酵母单杂交（Y1H）测定法的扩展，以研究和验证异源蛋白复合物 - DNA异构体系中任何功能基因组学研究的相互作用。

本实验的总体目标是研究和验证异源系统中异聚蛋白复合物-DNA 相互作用，用于常规实验室环境中的任何功能基因组研究。该方法可以帮助回答功能基因组学领域的关键问题，例如计划基因组学。该技术的主要优点是它可以检测涉及多种蛋白质或转录因子的蛋白质 DNA 相互作用。

在被指定为第一天的下午开始此程序。在新鲜划线的培养皿中，在不含尿嘧啶的合成成分确定或 SD 培养基中开始 5 mL 培养。在 30 摄氏度的摇床中孵育过夜。

第二天下午，用 500 微升过夜培养物接种 10 毫升 YPDA 培养基，并在 30 摄氏度摇床中孵育过夜。第二天清晨，用 2 毫升过夜培养物接种 100 毫升 YPDA 培养基。在 30 摄氏度下培养这种新鲜培养物，直到 600 纳米的光密度达到 0.4 至 0.8。

在 1000 倍 G 和 21 摄氏度下离心 5 分钟。丢弃上清液。加入 10 毫升无菌水，涡旋重新配制沉淀。

以 1000 倍 G 和 21 摄氏度离心 5 分钟。弃去上清液，加入 2 毫升 TE 醋酸锂，涡旋复溶沉淀。以 1000 倍 G 和 21 摄氏度离心 5 分钟。

丢弃上清液。加入 4 毫升 TE 醋酸锂和 400 微升鲑鱼精子 DNA，并通过上下吹打重悬沉淀。细胞现在已准备好进行转化，如下一段所示。

细胞的共转化在 96 孔 U 形底混合板中进行。首先，在 96 孔板中每孔分配 20 μL 感受态细胞。然后，向孔中加入两个质粒和标准化对照各 150 ng。

该示意图显示了用于酵母细胞与目标蛋白质共转化的通用板。孔板设置可以根据实验的需要和测试的 DNA 区域或片段的数量进行修改。每孔加入 100 微升 TE 醋酸锂聚乙二醇，并通过移液混合 3 次。

用透气密封盖住板，并在 30 摄氏度下孵育 20 到 30 分钟。42 摄氏度的热休克正好持续 20 分钟。热休克后，在 1000 倍 G 和 21 摄氏度下离心 5 分钟。

使用多通道移液器去除上清液。加入 110 微升 TE 并混合。再次离心 5 分钟。

从每个孔中取出 100 微升上清液。将打孔机浸入 100% 乙醇中，燃烧，等待 1 分钟让打孔针冷却，然后使用无菌打孔机重悬沉淀。将细胞转移到 SD 色氨酸和蛋黄缺失螺旋板上。

将板在 30 摄氏度下孵育两天。第五天下午，从培养箱中取出螺旋板。用 50 微升 TE 填充无菌 96 孔 U 形底混合板的每个孔。在 TE 中预润湿无菌穿刺器，从 SD 色氨酸和蛋黄脱落板中打孔菌落，然后将它们重悬于 TE 填充板中。

将菌落转移到新的 SD 色氨酸和蛋黄缺失螺旋板上，以实现最佳表面覆盖。将板在 30 摄氏度下孵育 2 天。第 7 天下午，从培养箱中取出螺旋板。

用 50 微升 SD 色氨酸和蛋黄脱落培养基填充无菌 96 孔 U 形底混合板的每个孔。用 180 μL SD 色氨酸和蛋黄碱脱落培养基填充无菌 96 深孔块的每个孔。对穿刺器进行消毒，预润湿穿刺器和培养基，并将菌落从板转移到每个含有 50 μL 培养基的孔中。

将 20 微升酵母转移到 180 微升 SD 色氨酸和蛋黄溶出培养基中。用透气密封条密封块，并在 30 摄氏度下摇动孵育 36 小时。第 9 天早上，将 100 微升培养物转移到 500 微升 YPDA 培养基中，置于灭菌的 96 深孔块中。

盖上透气密封件，在 30 摄氏度下以 200 rpm 的速度搅拌孵育 3 到 5 小时。3 到 5 小时后，重悬培养物，并将 125 μL 从每个孔转移到分光光度计板中。测量 600 纳米处的光密度，以确保其在 0.3 到 0.6 之间。

将深孔板中剩余的细胞以 3000 倍 G 和 21 摄氏度离心 10 分钟。倒置除去上清液。向每个孔中加入 200 微升 Z 缓冲液并涡旋。

在 3000 G 和 21 摄氏度下离心 5 分钟。倒置除去上清液。向每个孔中加入 21 微升 Z 缓冲液并涡旋。

用耐冻融循环的密封膜覆盖板。在通风橱中，使用液氮和 42 摄氏度的水浴进行 4 次冻融循环。向每个孔中加入 200 微升新鲜制备的 Z 缓冲液 β 巯基乙醇 ONPG 溶液。

在 30 摄氏度下孵育 17 至 24 小时或直到出现颜色。第 10 天早上，检查颜色是否已显现。向每个孔中加入 110 微升 1 摩尔碳酸钠以终止反应。

记录时间并涡旋板。在 3000 倍 G 和 21 摄氏度下离心 10 分钟。使用多通道移液器将 125 μL 上清液从每个孔转移到分光光度计板中。

测量 420 纳米处的光密度。按照文本方案中的说明计算电子表格中的 β 半乳糖苷酶活性。在本研究中，将转录起始位点开始上游 2600 个碱基对的启动子区域分割成 6 个区域或片段。

这张照片是方案第五天后生长良好的阳性板的一个例子。在这个代表性结果中，DNA 片段 1 和 4 显示出与蛋白 A 和 B 复合物的正相互作用。在测量 β golactisidase 活性时，片段 1 显示报告基因活性的四倍诱导。

重要的是要记住，只有在确认所提出的蛋白质蛋白质相互作用后，才建议使用此程序来获取有关 DNA 区域的信息，而不是旨在提供靶位点的信息。按照此程序，可以执行其他方法，例如芯片测定和 Msar 以回答其他问题。例如，识别体内的目标位点。

观看本视频后，您应该对如何测试和验证与共同 DNA 靶标结合的多聚体蛋白复合物的作用有很好的了解。