3维球形共培养胰腺癌细胞和成纤维细胞的制备及代谢试验

本文介绍了一种制备3维 (3D) 椭球共培养胰腺癌细胞和成纤维细胞的方法, 其次是利用细胞外流量分析仪测量代谢功能。

该方法的总体目标是使用细胞外通量分析仪从胰腺癌细胞和成纤维细胞中共培养三维肿瘤 strumous 球体，用于它们的代谢评估。这种方法可以帮助回答有关肿瘤真菌对细胞代谢和药物敏感性影响的问题。这些技术的主要优点是它快速、相对容易且高度可重复，并且可以很容易地适应其他细胞排列情况。

演示该程序的将是 Pawan Noel 和 Ruben Munoz。使用标准无菌组织培养技术，在适当的生长培养基中的 T75 培养瓶中培养目标癌细胞和成纤维细胞。当细胞达到 70% 至 80% 汇合时，用 5 mL PBS 洗涤培养物 1 次，然后将细胞从培养瓶表面分离，每个培养瓶用 2 mL 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，在 37 摄氏度下洗涤 5 分钟。

在显微镜下确认分离后，每个培养瓶用 8 毫升生长培养基灭活胰蛋白酶，并移液细胞几次，以生成用于计数的单细胞悬液。通过离心收集细胞，并在新鲜生长培养基中以 1 x 10 至每毫升浓度的第六个细胞重悬沉淀。为了磁化细胞，在生长培养基中加入 10 微升纳米穿梭机，pe 100 微升细胞并轻轻搅拌溶液。

轻轻倒置试管几次，然后将细胞纳米穿梭混合物转移到 24 孔板的各个孔中。将细胞在室温下孵育 2 小时，轻轻摇动，以促进纳米穿梭物与细胞表面结合。在结合孵育结束时，用移液器轻轻混合每个磁化细胞悬液，并将浓度调节至每 150 μL 培养基中第四个磁化癌细胞或成纤维细胞的浓度为 1.5 x 10。

2：1 的比例混合成纤维细胞和癌细胞，每孔总共 150 μL 接种细胞。将细胞驱避剂 96 孔板放在带有较薄磁铁的 96 孔磁性球体驱动器的顶部，并将 150 微升细胞混合物接种到每个孔中。当所有细胞都铺板后，将板在 37 摄氏度和 5%CO2 下孵育过夜，磁性球体驱动器仍然连接。

第二天早上，取下磁力驱动器，将细胞放回培养箱中最多 7 天。在代谢测定前一天，在提供的工具板中用每孔 200 μL 的分析口径水合探针柱，并在加湿的 37 摄氏度非 CO2 培养箱中将工具板孵育过夜。第二天早上，在光学显微镜下观察生长板中的球体，以检查它们的形态和整体均匀性。

将生长板转移到磁性固定驱动器上，小心吸出约 120 μL 生长培养基/孔。用 120 微升加热的测定培养基轻轻洗涤球体 3 次。最后一次洗涤后，再次在显微镜下检查球体，以确认球体没有被洗走，并向每个孔中加入 180 微升加热的测定培养基。

使用宽口径尖端小心地从细胞排斥生长板中吸出单个预洗的球状体，然后轻轻地将球状体直接转移到球状体分析板的一个孔的中心，使球状体在重力作用下落入孔的中央微室。转移完所有球体后，将检测板放入非 CO2 37 摄氏度加湿空气培养箱中 1 小时。在孵育过程中，调整传感器探针板的方向，使 A 行到 H 行位于左侧，并在探针板顶部放置一个加载导板，使与要加载的端口相对应的字母位于左上角。

如果板已均匀加载，请打开分析软件并单击 templates。双击 blank template，然后单击 generate groups。在板图选项卡下，将组分配给与实验设计相对应的测定板，并选择四个角孔作为背景孔。

在仪器方案选项卡下，选中校准、平衡和基线测量周期。单击 injections 并定义每个端口的化合物。将测量周期更改为 6 个，查看实验步骤和组摘要，然后保存分析设计模板。

以分析设计为指导，使用多通道移液器将每种试剂直接分配到进样口，用指尖将上样导板固定到位。加载完所有试剂后，取下加载导板并将卡夹与眼睛齐平，以目视检查进样口是否均匀加载。将工具板上的小柱转移到细胞外通量分析仪上，并开始分析前校准。

校准后，用含有 3D 球体的预热检测板更换工具板，然后开始检测。检测完成后，将数据导出到相应的数据分析软件中。在典型的实验中，球体的直径从第 2 天的 400 微米左右增加到第 7 天的近 600 微米，打印后，第 7 天后没有观察到显著增加。

所有三种类型的球状体培养物都表现出对糖酵解应激测定的生物功能反应，以响应于注射饱和浓度的葡萄糖，其细胞外断言率的增加证明了这一点。一般来说，与来自相对较小的 PS1 成纤维细胞衍生球体的信号相比，来自肿瘤细胞衍生球体的细胞外断言率信号更高，这可能归因于癌细胞对糖酵解的固有代谢倾向。在肿瘤成纤维细胞球体的代表性线粒体负荷试验中，观察到响应 ATP 合酶抑制剂的线粒体呼吸减少，这与用于细胞 ATP 产生的线粒体呼吸分数相关。

第二次注射解偶联剂，刺激球体的最大耗氧量，线粒体呼吸相应地增加。第三次注射电子传递链复合物 1 和 3 抑制剂，阻断线粒体呼吸，观察到耗氧率急剧下降。这些参数和基础呼吸速率可用于计算球体的质子泄漏和备用呼吸能力，从而提供磁化球体的多参数代谢分析。

一旦掌握，如果计划得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在进行代谢测定前 4 至 16 小时在 37 度培养箱中对探针进行水合。在球状体培养程序之后，可以进行其他分析，如剂量反应实验，以回答有关药物疗效、毒性、渗透性和敏感性的其他问题。

经过开发，该技术为胰腺癌领域的研究人员在模拟体内肿瘤生物学及其特征的三维模型中探索肿瘤微环境内的肿瘤基质相互作用铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何培养三维球状体有很好的了解，从培养的胰腺肿瘤和成纤维细胞开始，到下游的细胞代谢功能分析。