囊性纤维化患者生物流体中依伐卡托、其主要代谢物和鲁马卡托的高效液相色谱-串联质谱法高通量分析优化方法

这是血浆检测样本制备的操作步骤。请注意，在样本采集和处理过程中，为确保其完整性，所有样本和标准品均应保存在2至8摄氏度。操作完成后，将所有样本储存在-20摄氏度。

对于标准品的制备，分别用甲醇独立配制每种苯胺类化合物、艾伐卡夫托、M1 代谢物、M6 代谢物和鲁马卡夫托的标准储备液，浓度分别为 100 微克每毫升和 10 微克每毫升。请注意，这些化合物在室温放置超过 10 天后即失效。对于标准品溶液，将 100 微升人源血浆转移至 1.5 毫升聚丙烯微量离心管中。

对所有其他样品重复上述操作。然后向每个试管中加入内标物。例如，我们从已配制的标准品中选择每毫升含 0.01 微克的浓度。

现在此离心管中含有添加了内标物的血浆。对所有其他标准品也按此步骤操作。取您的标准品，短暂离心数秒，以确保所有液体均位于离心管底部。

对所有40个标准品重复此操作。对于患者样本，将100微升患者样本管中的液体转移至微量离心管中。真实的患者样本未添加内标物。

将患者样本短暂离心数秒，确保所有液体均位于管底。以下步骤同时适用于样本和标准品。向每支样本管中加入200 µL含0.1%甲酸的乙腈溶液，以沉淀血浆蛋白。

对所有标准品和患者样本均进行同样操作。每份样本剧烈涡旋振荡约15秒。对所有标准品和加标样本均继续进行同样操作。

将样品置于冰箱中静置10分钟，以促进沉淀。为演示目的，我将仅对一个样品和一个标准品进行离心。我们使用Eppendorf Centrifuge 5430在4°C条件下以10,000 rpm离心10分钟。

现在我们将上清液过滤至Phenomenex小瓶中。此过程使用直径为13毫米、带有0.45微米尼龙Grace滤膜（购自美国）的一次性注射器滤器，将滤液收集至可容纳1.5毫升的HPLC小瓶中。过滤完成后，将100微升上清液转移至LC/MS小瓶中，用于LC/MS分析。

此样品现已准备好进行分析。现在只需将所有样品放入样品瓶架中。我们使用的是岛津8030液相色谱/质谱系统，并配备三重四极杆质谱仪。

在分析前让系统平衡。平衡约需15分钟，平衡完成后只需按下“开始”按钮。针对每种代谢物，通过绘制苯胺衍生物的峰面积比相对于校准标准品的标称浓度，绘制校准曲线。

使用校准曲线的回归方程计算加标样品中乙酰苯胺类化合物的浓度。本图显示了一个典型的色谱图。采用Phenomenex Kinetex C8色谱柱，以乙腈-水（含0.1%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，获得优化的色谱分离效果。

液相色谱保留时间如下：M6 为 1 分钟，M1 为 1.3 分钟。

对于艾伐卡夫托，1.55 分钟；对于鲁马卡夫托，2.3 分钟。在所有空白血浆样本中，均未观察到任何苯甲酰胺类物质保留时间的干扰，也未检测到艾伐卡夫托与鲁马卡夫托联用时产生干扰。

通过对大量患者样本进行高通量分析，我们优化了已报道的方法，采用孔径更小的反相色谱柱（Phenomenex C8 柱）和梯度洗脱溶剂系统，取代现有的等度洗脱方式。该改进将每个样本的运行时间（包括清洗阶段）缩短至六分钟。这一可靠且新颖的方法为伊伐卡夫托（ivacaftor）及伊伐卡夫托-鲁马卡夫托（ivacaftor-lumacaftor）联合用药的治疗药物监测提供了简单、灵敏且快速的生物流体分析手段。

鉴于需要建立暴露-效应关系以最大化药物疗效并控制医疗成本，有必要开发并验证更为敏感的工具，以协助临床医生对囊性纤维化患者采用循证治疗和高通量分析技术。通过将所提出的分析方法应用于临床药代动力学和药效动力学研究，有望在更大规模的患者群体中进一步探究依伐卡托或依伐卡托-鲁马卡托联合制剂的药代动力学参数。