经优化的 LC/ms 方法对囊性纤维化患者 Ivacaftor 及其主要代谢物和 Lumacaftor 的高通量分析
October 15th, 2017
Ivacaftor 和 Ivacaftor-lumacaftor 结合是两个新的 CF 药物。然而, 在他们的 PK/PD 和药理学方面仍然缺乏了解。本文提出了一种优化的 HPLC-MS 技术, 同时分析 ivacaftor 及其主要代谢产物, 以及 lumacaftor。
这是血浆测定样品制备的方案。请注意，为确保其完整性，在采集和处理过程中，所有样品和标准品均应保持在 2 至 8 摄氏度。处理完成后，将所有样品储存在零下 20 度。
对于标准品制备，在甲醇中制备每种苯胺、依伐卡托、M1 代谢物、M6 代谢物和 lumacaftor的两种独立储备液，浓度分别为 100 μg/mL 和 10 μg/mL。请注意，化合物在台式放置 10 天后过期。对于标准品，将 100 μL 人血浆转移到 1.5 mL聚丙烯微量离心管中。
继续对所有其他样品执行此作。然后将内标添加到每根试管中。例如，我们从制备的标准品中选择每毫升 0.01 微克。
现在，该管包含加标内标的血浆。对所有其他标准进行此类作。取您的标准品并将其旋转几秒钟，以确保所有液体都在试管底部。
继续对所有 40 个标准执行此作。对于患者样品，将 100 μL 从患者样品管中转移到微量离心管中。真实患者样品未加标内标。
将患者样本向下旋转几秒钟，以确保所有液体都在试管底部。后续步骤针对样品和标准品进行设计。向每个样品管中加入 200 μL 0.1% 甲酸的乙腈溶液，以沉淀血浆蛋白。
继续对所有标准品和患者样品执行此作。将每个样品剧烈涡旋约 15 秒。继续对所有标准品和产生的样品执行此作。
在冰箱中静置 10 分钟，以利于沉淀。出于演示目的，我只离心一个样品和一个标准品。我们在 Eppendorf Centrifuge 5430 上以 10， 000 rpm 的转速在 4 度下离心 10 分钟。
我们现在将上清液过滤到 Phenomenex 样品瓶中。为此，我们使用了 13 毫米针式过滤器和从美国购买的 0.45 微米尼龙 Grace 过滤器，并过滤到可容纳 1.5 mL 的 HPLC 样品瓶中。过滤后，我们将 100 μL 上清液转移到 LC/MS 样品瓶中进行 LC/MS 分析。
该样本现在已准备好进行分析。现在只需将所有样品放入样品瓶架中即可。我们使用的是 Shimadzu 8030 LC/MS 系统，并配有三重四极杆质谱系统。
在分析之前让系统平衡。平衡后，大约需要 15 分钟，只需按下 Start（开始）按钮即可。对于每种代谢物，通过绘制苯胺类化合物的峰面积比与校准标准品的标称浓度来构建校准曲线。
使用校准曲线的回归方程来计算所产生样品中苯甲酰亚胺的浓度。典型的色谱图如图所示。使用 100% 乙腈和 0.1% 甲酸的水溶液流动相，并在 Phenomenex Kinetex C8 色谱柱上进行梯度洗脱，获得优化的色谱分离度。
LC 保留时间如下。对于 M6，为 1 分钟。对于 M1,1.3 分钟。
对于 ivacaftor，1.55 分钟。对于 lumacaftor，2.3 分钟。在所有空白血浆样品中，未观察到对任何一种苯胺类药物保留时间的干扰，也未检测到 ivacaftor 与 lumacaftor 的组合的干扰。
通过对大量患者样本进行高通量分析，我们通过使用较小孔径的反相色谱柱 Phenomenex C8 色谱柱和梯度溶剂系统代替目前的等度洗脱来优化我们报道的方法。这将每个样品的运行时间缩短到 6 分钟，包括清洗阶段。这种可靠且新颖的方法为 ivacaftor 和 ivacaftor-lumacaftor 组合和生物液的治疗药物监测提供了一种简单、灵敏和快速的方法。
鉴于需要建立暴露-反应关系以最大限度地提高药物疗效并控制医疗保健成本，需要开发和验证更敏感的工具，以帮助临床医生对患有 CF.By 的患者使用循证疗法和高通量分析技术，并将所提出的分析方法应用于临床药代动力学和药效学研究，有机会进一步研究 ivacaftor 或ivacaftor-lumacaftor 组合在更大的患者群体中。
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概述
本文介绍了一种优化的HPLC-MS技术，用于同时分析ivacaftor及其主要代谢物和lumacaftor。这些新型囊性纤维病药物的药代动力学和药效学尚未得到充分了解，这凸显了改进分析方法的需求。
关键研究组成部分
科学领域
- 药理学
- 分析化学
- 囊性纤维病研究
背景
- Ivacaftor和lumacaftor是用于治疗囊性纤维病的新药。
- 关于它们的药代动力学和药效学知识有限。
- 优化的药物分析方法对理解其效果至关重要。
- HPLC-MS是一种用于药物分析的强大技术。
研究目的
- 开发一种可靠的分析ivacaftor和lumacaftor的方法。
- 评估ivacaftor及其代谢物的药代动力学。
- 增进对药物相互作用和疗效的理解。
使用的方法
- 等离子体测定的样品制备。
- 在受控温度下存储样品。
- 在甲醇中制备原液。
- 使用HPLC-MS进行同时分析。
主要结果
- 成功开发了一种优化的HPLC-MS技术。
- 实现了ivacaftor及其代谢物的分析。
- 该方法在药代动力学研究中表现出可靠性。
- 获得了对囊性纤维病药物药理学的见解。
结论
- 优化的方法可以帮助理解药物行为。
- 需要进一步的研究来探索药效学。
- 改进的分析技术对药物开发至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accelerated pharmacokinetic profiling of CFTR modulators is critical for optimizing dosing regimens and understanding exposure-response relationships in cystic fibrosis. This high-throughput LC-MS/MS method enables rapid quantification of ivacaftor, its metabolites, and lumacaftor, supporting larger-scale clinical studies and de-risking translational development. Reduced analysis time from 15 to 6 minutes per sample enhances laboratory throughput, facilitating population PK/PD investigations and portfolio-level decision-making for CF therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of drug and metabolite concentrations to interrogate CFTR modulation mechanisms and pathway engagement.
- Operational Value: Provides reproducible quantitative outputs for assessing target exposure in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers sensitive, selective detection of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological matrices.
- Operational Value: Gradient elution on sub-2µm C8 column ensures chromatographic resolution and assay robustness for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exposure-response modeling by generating reliable PK data from CF patient samples.
- Operational Value: Enables scalable sample processing for clinical PK studies, bridging discovery to clinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translational continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and quantitative readouts for preclinical and clinical PK evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates target engagement assessment through accurate metabolite profiling in biological systems.
- Screening: Ensures assay standardization and reproducibility for reliable compound evaluation across sample sets.
- Analytics: Provides peak area ratio-based quantification and calibration curves for precise concentration determination.
- Translational Research: Connects analytical output to clinical exposure metrics, enabling PK/PD correlation in patient populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for CFTR modulator programs, reducing method redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in drug exposure assessment, reduction of PK uncertainty in CFTR modulator studies.
- Operational Value: High-throughput capability, method sensitivity, and rapid turnaround for large sample cohorts.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on exposure data, improved capital efficiency in clinical development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of CF drug candidates using robust PK/PD datasets.
Implementation Considerations
- Expertise in LC-MS/MS method development and biological sample handling.
- Access to triple-quadrupole mass spectrometry and gradient HPLC systems.
- Standardization of sample preparation, protein precipitation, and filtration protocols.
- Adaptation considerations for different biological fluids (e.g., plasma, sputum) and stability monitoring.
- Requirement for controlled storage conditions (−20°C) and fresh standard preparation within 10-day stability window.
