Name: 经优化的 LC/ms 方法对囊性纤维化患者 Ivacaftor 及其主要代谢物和 Lumacaftor 的高通量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 了解优化后的HPLC-MS方法用于囊性纤维化患者Ivacaftor及其主要代谢物和Lumacaftor的高通量分析。该技术可同时检测多种化合物，为治疗药物监测提供简单、灵敏且快速的解决方案。

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J.L. 和 T.V. 由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）下属的国家过敏与传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID）资助（项目编号：R01 AI111965）。本内容仅由作者负责，不代表国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。MC 是澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）首席研究员。J.L. 是澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）高级研究员，T.V. 是澳大利亚 NHMRC 产业职业发展二级研究员。E.K.S. 被任命为 2017 年美国微生物学会（ASM, American Society for Microbiology）青年大使，并获得澳大利亚研究生奖学金（Australian Postgraduate Award）资助。 
本工作的部分内容曾在第12届th 澳大利亚和新西兰囊性纤维化会议在墨尔本（5-8th 2017年8月

伦理批准由莫纳什大学人类研究伦理委员会（MUHREC）获得。
1. 检测方法的应用：患者样本采集
<ol>
	<li>记录患者服用标准剂量150 mg ivacaftor或125 mg ivacaftor / 200 mg lumacaftor的时间。</li>
	<li>记录患者血液样本采集的确切时间。 
	注意：建议在24小时时间内采集4-5个样本。若仅能采集一个样本，建议在连续治疗&#62;5天达到稳态后，于服用ivacaftor或ivacaftor-lumacaftor联合药物后2.5-4小时采集，此时可测得Cmax浓度。</li>
	<li>使用市售的未加添加剂的蓝色采血管采集4-5 mL血液。</li>
	<li>采集全血后，将血液在室温下静置，使其自然凝固。 
	注意：通常需要15-30分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用冷冻离心机以1,000-2,000 × g离心10分钟，去除血凝块。将所得上清液标记为血浆。</li>
	<li>离心后，立即使用巴斯德吸管将上清液（血浆）转移至洁净的聚丙烯管中。在血浆管上标注患者编号（例如，患者1）、所用药物（例如，ivacaftor-lumacaftor联合用药）以及样本采集时间（例如，给药后2.5小时）。</li>
	<li>处理过程中保持样本温度在2-8 °C。处理完成后，将样本储存于–20 °C。</li>
	<li>如有需要，使用经批准的运输服务将样本运送至分析机构。 
	注意：样本应使用干冰运输直至送达，并在分析前保存于–80 °C。</li>
</ol>
2. 实际样品和标准品的制备与处理
注意：来自未接受过伊法韦托/鲁马卡托治疗的健康供体的血浆由澳大利亚红十字会提供。为确保样本完整性，在采集和处理过程中，所有样本/标准品均应保存在 2-8 °C 环境下。操作完成后，应将样本储存在 –20 °C。
<ol>
	<li>称取异缬草酸（IVA）、异缬草酸羧酸盐（IVA-carboxylate）、羟甲基异缬草酸（hydroxymethyl-IVA）和LUMA，作为内标物的参考标准品。</li>
	<li>分别用LC-MS级甲醇配制每种分析物（IVA、M1、M6和LUMA）的两种独立储备液，浓度分别为100 µg/mL和10 µg/mL。 
	注意：化合物在室温下放置超过10天后失效。</li>
	<li>每次分析运行前，将校准储备液用人体血浆稀释，新鲜配制LC-MS校准标准品，获得以下浓度：0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 µg/mL。这些样品称为标准品。</li>
	<li>为沉淀蛋白质，配制含0.1%甲酸（FA）的乙腈（ACN，LC-MS级）溶液，并置于冰箱中冷藏，待用时取出。</li>
</ol>
3. 实际样品和标准品的预处理
<ol>
	<li>让患者样本和空白血浆样本均平衡至室温。</li>
	<li>涡旋振荡每份血浆样本，每份样本混合15秒。</li>
	<li>将100 µL的空白血浆（用于标准品）或患者样本（用于分析）转移至1.5 mL聚丙烯微量离心管中。</li>
	<li>将内标 IVA 加入每个标准管中（例如，0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 和 10.0 µg/mL，以覆盖可能的浓度范围），盖紧盖子，涡旋混匀 2–3 秒。注意仅在空白血浆中加入内标，患者样本中不加入内标。</li>
	<li>对其他内标 M1、M6 和 LUMA 重复步骤 3.4。</li>
	<li>短暂离心每个管子，以确保管盖上无液滴残留。</li>
	<li>向每根试管中加入200 µL含0.1%甲酸的乙腈溶液，以沉淀血浆蛋白。</li>
	<li>剧烈涡旋混合约15秒。</li>
	<li>将离心管置于冰箱中静置10分钟。</li>
	<li>在 10,000 x g 条件下离心 g 4 °C下离心10分钟，条件允许时。</li>
	<li>将200 µL上清液通过13 mm注射器滤器过滤至1.5 mL HPLC小瓶中。</li>
	<li>将100 µL上清液转移至LC-MS小瓶中，用于HPLC-MS分析。</li>
</ol>
4. HPLC-MS 分析
注意：HPLC-MS 分析采用配备三重四极杆质谱仪的液相色谱-质谱联用系统进行（表1）。
<ol>
	<li>开启液相色谱-质谱联用（LC-MS）系统，将装有样品的样品盘放入自动进样器中。</li>
	<li>将色谱柱连接至保护柱，并接入 LC-MS 系统。</li>
	<li>连接两种流动相储液瓶（A 瓶：100% 乙腈；B 瓶：含 0.1% 甲酸的水溶液），并平衡 LC-MS 系统。</li>
	<li>将以下参数纳入 LC-MS 检测方案。
	<ol>
		<li>在流动相进入质谱仪之前，以 2:1 的比例分流（废液:质谱进样口）。</li>
		<li>采用由 100% 乙腈和含 0.1% 甲酸的水溶液组成的流动相，在 0.5 mL/min 的流速下进行梯度洗脱（起始比例为 40:60，v/v）。注意，分析过程中流动相的体积百分比会发生变化。</li>
		<li>使质谱仪在正离子电喷雾电离模式下运行。</li>
		<li>确保 LC-MS 的设置如下：离子喷雾电压 4.5 kV，碰撞能量 295.9 V，雾化气：氮气，流速 3 L/min；碰撞气：氩气；干燥气流速 20 L/min，Q3 透镜电压：-22 V，去溶剂化温度 250 °C，加热块温度 400 °C。</li>
		<li>每份样品进样体积为 10 µL。</li>
		<li>采用多反应监测（MRM）模式检测分析物。分别监测 IVA、IVA-M1、IVA-M6 和 LUMA 的离子跃迁：m/z 392.49 → 393、m/z 408.49 → 409、m/z 422.47 → 423 和 m/z 452.40 → 453。 
		注：该新优化的方法尚未依据美国食品药品监督管理局（FDA）标准完成全面验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 校准曲线
<ol>
	<li>每次分析运行前，在液相色谱-质谱（LC-MS）设置程序中，利用四种分析物与内标物的峰面积比值与艾伐卡夫托（ivacaftor，IVA-M1、IVA-M6 或 LUMA）校准标准品标称浓度之间的关系，绘制 LC-MS 校准曲线。 
	注意：校准曲线的具体构建步骤取决于所使用的 LC-MS 仪器型号，相关信息可能在仪器手册中提供。</li>
	<li>采用浓度倒数的平方（1/C2）作为权重，进行线性最小二乘法回归分析。</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如先前报道，本课题组首次建立并验证了一种高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS），用于快速检测和定量囊性纤维化（CF）患者血浆和痰液中的艾伐卡夫托（ivacaftor）及其主要代谢产物羟甲基艾伐卡夫托 M1（IVA-M1，具有活性）和艾伐卡夫托羧酸盐 M6（IVA-M6，无活性），以及鲁马卡托（lumacaftor）14。本课题组此前报道的方法已成功用于定量接受稳态标准治疗的CF患者血浆和痰液中鲁马卡托（LUMA）、艾伐卡夫托（IVA）、IVA-M1和IVA-M6的浓度，治疗方案为每12小时一次口服艾伐卡夫托150 mg或200 mg（拉丁术语：quaque 12 h；即每12小时一次），联合每12小时一次口服鲁马卡托125 mg与艾伐卡夫托14。为了实现对大量患者样本的高通量分析，我们对既往方法进行了优化，采用更小孔径的反相色谱C8柱（2.6 µm；100 Å；50 x 2.1 mm2）以及梯度洗脱溶剂体系，替代原有的等度洗脱模式，使每个样本的运行时间缩短至6分钟。
<p...

囊性纤维化（CF）是一种常见的遗传性疾病，累及肺、肝、胰腺和肠道的外分泌黏液腺，导致进行性多器官功能衰竭，例如肺功能下降和胰腺功能不全1,2,3。伊伐卡托（Ivacaftor，IVA）是首个获得美国食品药品监督管理局（FDA-US）和欧洲药品管理局（EMA）批准的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）增效剂药物，临床疗效明确，在携带G551D-CFTR[第551位甘氨酸（G）被天冬氨酸（D）取代]&#160;错义突变（约占CF患者群体的4-5%）的一小部分CF患者中，其改善肺功能的效果显著优于安慰剂4,5。该口服药物可增加CFTR通道的开放概率，从而增强氯离子流动，作用于导致CF临床表现的根本缺陷4,6。遗憾的是，对于更常见的纯合F508del突变[CFTR基因的框内缺失导致第508位苯丙氨酸（F）缺失]&#160;患者，单用IVA治疗无效，该突变导致CFTR蛋白错误折叠，在约50%的CF患者中可见7,8。
最近，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准将IVA与CFTR校正药物lumacaftor联合使用。这种联合策略巧妙地结合了一种CFTR校正剂（lumacaftor，LUMA），可将F508del-CFTR转运至细胞表面，以及一种CFTR调节剂（IVA），可增强CFTR通道活性，从而有效扩大治疗范围，使大多数囊性纤维化（CF）患者受益5。然而，这些药物是否能实现其临床承诺仍存在疑问，因为已有若干相互矛盾的报道对其临床疗效提出了质疑9,10。此外，与携带G551D突变的患者使用IVA单药治疗所取得的显著疗效（10.6–12.5%）相比，联合治疗在肺功能改善方面仅表现出有限的效果（ivacaftor-lumacaftor联合治疗为2.6–4%）8。IVA与LUMA之间潜在的拮抗性药物相互作用可能限制ivacaftor-lumacaftor联合疗法的临床疗效，这源于其不够理想的药代动力学特性7,11。IVA主要通过细胞色素P450酶（CYP）广泛代谢，生成一种活性代谢物羟甲基-IVA（IVA-M1，M1）和一种无活性形式的IVA-羧酸盐（IVA-M6，M6）7,12。另一方面，作为CYP3A4诱导剂的LUMA本身并不被广泛代谢，主要以原形经粪便排泄11。由于CYP3A4诱导剂可增强细胞色素P450的代谢活性，作为CYP3A4底物的ivacaftor的血药浓度可能因此降低。此外，IVA和LUMA均为高度疏水性分子，约99%与血浆蛋白结合，这显著限制了游离（活性）药物的浓度1,13。
综合来看，这些因素可能共同限制了伊伐卡夫托-鲁马卡夫托联合疗法的临床疗效。目前尚不清楚在现有的伊伐卡夫托-鲁马卡夫托联合用药剂量方案下是否能够达到最佳血浆浓度，或是否能够维持治疗阈值8。目前关于伊伐卡夫托或伊伐卡夫托-鲁马卡夫托的药代动力学参数（如峰浓度和稳态血浆浓度）的信息仍然十分有限。鉴于伊伐卡夫托和鲁马卡夫托已知的代谢特性，监测药物暴露-效应关系对于确定伊伐卡夫托或伊伐卡夫托-鲁马卡夫托治疗的最佳剂量方案至关重要。我们课题组近期发表了首个用于监测IVA和LUMA暴露-效应关系的高效液相色谱/液相色谱-质谱（HPLC/LC-MS）方法14。迄今为止，尚未有其他技术被报道可用于测定伊伐卡夫托、其代谢产物及鲁马卡夫托的浓度。为了实现对更大患者群体的高通量分析，并显著缩短分析时间，我们课题组通过采用更小孔径的反相色谱柱和梯度溶剂系统，对已有方法进行了优化，从而降低了成本并缩短了运行时间。

<table><tbody><tr><td>IVA（货号 S114）&amp;nbsp;</td><td>SelleckChem（美国）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA（货号 S1565）&amp;nbsp;</td><td>SelleckChem（美国）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-羧酸盐（货号 510242247CS）&amp;nbsp;</td><td>Clearsynth（加拿大）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羟甲基-IVA（货号 510240849CS）&amp;nbsp;</td><td>Clearsynth（加拿大）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇（MeOH，LC-MS 级）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈（ACN，LC-MS 级）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸（FA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三重四极杆 Shimadzu 8030 LC-MS&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex（2.6 &amp;micro;m C8 100 &amp;Aring;；50 &amp;times; 2.1 mm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>（KrudKatcher Ultrea HPLC 在线过滤器，0.5 m 深度过滤器 × 0.004 in ID）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 聚丙烯微量离心管（VWR）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 mm 注射器滤器（0.45 &amp;micro;m 尼龙，GRACE，美国）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX，9 mm，聚丙烯，300 &amp;micro;L，PTFE/硅胶隔垫]&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

囊性纤维化患者生物流体中依伐卡托、其主要代谢物和鲁马卡托的高效液相色谱-串联质谱法高通量分析优化方法

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的缺陷是囊性纤维化（CF）的病因，该疾病具有危及生命的肺部表现。伊伐卡夫托（ivacaftor，IVA）和伊伐卡夫托-鲁马卡夫托（lumacaftor，LUMA）联合疗法是两种新型突破性CF药物，可直接调节有缺陷的CFTR蛋白的活性和转运过程。然而，目前对伊伐卡夫托和鲁马卡夫托的药代动力学/药效动力学参数及其药理学特性仍缺乏充分了解。我们课题组此前已建立了一种高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术，用于同时检测接受标准伊伐卡夫托或伊伐卡夫托-鲁马卡夫托联合治疗的患者生物体液中伊伐卡夫托、羟甲基伊伐卡夫托、伊伐卡夫托羧酸代谢物及鲁马卡夫托的浓度，并已部分按照美国食品药品监督管理局（FDA）标准完成方法学验证。然而，为了实现对更多患者样本的高通量分析，本课题组通过采用更小孔径的反相色谱柱（2.6 µm，C8 100 Å；50 × 2.1 mm）以及梯度洗脱体系（0–1 分钟：40% B；1–2 分钟：40–70% B；2–2.7 分钟：保持70% B；2.7–2.8 分钟：70–90% B；2.8–4.0 分钟：90% B 洗脱；4.0–4.1 分钟：90–40% B；4.1–6.0 分钟：保持40% B），替代原有的等度洗脱方式，对已有方法进行了优化。本研究的目标是将每份样本的HPLC-MS分析时间从约15分钟显著缩短至仅6分钟，这对于大量患者样本的分析至关重要。该高效方法将极大促进针对这些突破性CF药物暴露-效应关系的研究。

我们近期报道了一种部分符合美国食品药品监督管理局（FDA）标准的方法，该方法在三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）和高效液相色谱（HPLC）检测系统上进行，采用C8色谱柱（5 µm，3.9 mm × 50 mm 内径），流动相为乙腈（ACN）与含0.1%甲酸的水溶液（体积比40:60），流速为1 mL/min。在人血浆中，所有代谢物——艾伐卡夫托（ivacaftor）、Iva-M1、Iva-M6 和鲁米卡夫托（lumacaftor）——在浓度范围0.01至10 µg/mL内均表现出良好的峰面积线性相关性14。本文对该方法进行了优化，显著缩短了液相色谱的保留时间，从而大幅减少整个检测的运行时间，这对于大量临床样本的高通量分析至关重要。通过采用更小孔径的反相色谱柱以及梯度洗脱溶剂系统替代等度洗脱，每份样品的分析时间从约15分钟缩短至仅6分钟。分析物在电喷雾正离子模式下通过多反应监测（MRM）进行检测。该检测程序在使用前应进行实验室内部验证，具体方法我们已在先前文献中详细描述14。
该...

Ivacaftor 和 ivacaftor-lumacaftor 联合制剂是两种新型的囊性纤维化药物。然而，目前对其药代动力学/药效学（PK/PD）及药理学的认识仍然不足。本文介绍了一种经过优化的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术，可用于同时分析 ivacaftor 及其主要代谢产物以及 lumacaftor。

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的缺陷是囊性纤维化（CF）的致病原因，该疾病具有危及生命的……

这是用于血浆检测的样本制备方案。请注意，在采集和处理过程中，为确保样本和标准品的完整性，所有样本和标准品均应保存在 2 至 8 摄氏度。操作完成后，将所有样本储存在 -20 摄氏度。标准品制备时，分别用甲醇独立配制每种苯甲酰胺类化合物、依伐卡托、M1代谢物、M6代谢物和鲁米卡托的两种储备液，浓度分别为100微克/毫升和10微克/毫升。请注意，这些化合物在室温放置超过10天后即失效。对于标准品溶液，取100微升人血浆转移至1.5毫升聚丙烯微量离心管中。对所有其他样品重复上述操作。然后向每根试管中加入内标物。例如，我们选择加入已制备的标准品中浓度为 0.01 微克/毫升的溶液。现在此离心管中含有添加了内标物的血浆。对所有其他标准品也按此步骤操作。取您的标准品，短暂离心数秒，以确保所有液体均位于离心管底部。对所有40个标准品重复此操作。对于患者样本，将100微升患者样本管中的液体转移至微量离心管中。真实的患者样本未添加内标物。将患者样本短暂离心数秒，确保所有液体均位于管底。以下步骤同时适用于样本和标准品。向每支样本管中加入200 µL含0.1%甲酸的乙腈溶液，以沉淀血浆蛋白。对所有标准品和患者样本均重复上述操作。每份样本剧烈涡旋振荡约15秒。对所有标准品和加标样本均重复上述操作。在冰箱中静置10分钟，以促进沉淀。为演示目的，我将仅对一个样品和一个标准品进行离心。使用Eppendorf Centrifuge 5430，在4℃条件下以10,000 rpm离心10分钟。现在我们将上清液过滤至Phenomenex小瓶中。此过程使用直径为13毫米、带有0.45微米尼龙Grace滤膜（购自美国）的注射器滤器，将滤液收集至可容纳1.5毫升的HPLC小瓶中。过滤后，我们将转移100微升上清液至LC/MS小瓶中，用于LC/MS分析。此样品现已准备好进行分析。现在只需将所有样品放入样品瓶架中。我们使用的是岛津8030 LC/MS系统，配备三重四极杆质谱仪。在分析前让系统平衡。平衡约需15分钟，之后只需按下“开始”按钮。针对每种代谢物，通过绘制苯胺衍生物的峰面积比与校准标准品的标称浓度的关系曲线，构建校准曲线。使用校准曲线的回归方程计算实际样品中苯胺类化合物的浓度。本图显示了一个典型的色谱图。采用 Phenomenex Kinetex C8 柱，以乙腈-水（含 0.1% 甲酸）为流动相进行梯度洗脱，获得优化的色谱分离效果。LC 保留时间如下：M6 为 1 分钟，M1 为 1.3 分钟。对于ivacaftor为1.55分钟，对于lumacaftor为2.3分钟。在所有空白血浆样本中，均未观察到任何苯甲酰胺类物质在保留时间上的干扰，也未检测到ivacaftor与lumacaftor联用时产生干扰。通过对大量患者样本进行高通量分析，我们优化了已报道的方法，采用孔径更小的反相色谱柱（Phenomenex C8柱）以及梯度洗脱溶剂系统，取代现有的等度洗脱方式。该改进使每个样本的运行时间缩短至六分钟（包括清洗阶段）。这一可靠且新颖的方法为伊伐卡托及其与鲁马卡托联合用药的治疗药物监测，以及生物流体分析提供了简单、灵敏且快速的检测途径。鉴于需要建立暴露-效应关系以最大化药物疗效并控制医疗成本，有必要开发并验证更为敏感的工具，以协助临床医生对囊性纤维化（CF）患者采用循证治疗和高通量分析技术。通过将所提出的分析方法应用于临床药代动力学和药效动力学研究，有望在更大规模的患者群体中进一步探究依伐卡托或依伐卡托-鲁马卡托联合制剂的药代动力学参数。

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经优化的 LC/ms 方法对囊性纤维化患者 Ivacaftor 及其主要代谢物和 Lumacaftor 的高通量分析

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。...

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

基于质谱与发光检测的方法表征I相代谢能力 体外 细胞培养

本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。...

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

本文介绍一种高通量的全面药物监测方法，该方法可提高对多种滥用药物及其代谢物的分辨率和检测能力，并基于多段进样-毛细管电泳-质谱技术进行质量控制。...

高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

将诊断性碎裂过滤技术应用于MZmine，是一种优雅的采集后方法，可用于筛查液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中的已知和未知天然产物的整个类别。该工具会搜索二级质谱（MS/MS）谱图中由分析人员预先定义为表征该类化合物特征的产物离子和/或中性丢失片段。...

天然产物发现中的LC-MS/MS诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。...

采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

目前用于分析患者对耐药结核病（DR-TB）复杂治疗方案依从性的方法可能存在不准确且资源消耗大的问题。我们的方法利用易于采集和保存的毛发样本，检测其中11种DR-TB药物的浓度。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可测定低至亚纳克水平的药物含量，从而更准确地评估患者的用药依从性。...

经验证的LC-MS/MS检测面板用于定量小份毛发样本中11种耐药结核病药物

本文介绍了一种检测癌细胞培养上清液中犬尿氨酸通路产生的四种不同色氨酸代谢物（犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、黄尿酸、3-羟基邻氨基苯甲酸）的实验方案，该方法采用液相色谱串联单四极杆质谱法进行分析。...

利用液相色谱-质谱法同时定量分析癌细胞培养液中选定的犬尿氨酸类物质

本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。...

液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

了解优化后的HPLC-MS方法用于囊性纤维化患者Ivacaftor及其主要代谢物和Lumacaftor的高通量分析。该技术可同时检测多种化合物，为治疗药物监测提供简单、灵敏且快速的解决方案。

囊性纤维化患者生物流体中依伐卡托、其主要代谢物和鲁马卡托的高效液相色谱-串联质谱法高通量分析优化方法

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