核密度分析的天然染色质沉淀测序文库的生成
2017年12月12日
我们提出了一个改良的本地染色质沉淀测序 (芯片-seq) 的方法, 以生成序列数据集适合核密度芯片-seq 分析框架集成 micrococcal 核酸 (MNase) 可及性组蛋白修饰测量。
该程序的总体目标是生成用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库。这种方法可以回答表观遗传学中的问题，例如在单个核小体水平上揭示细胞群中的表观基因组特征，并将异质染色质特征解析为其连续元件。该技术的主要优点是利用 MNase 优先进入开放染色质区域的特性来生成将 MNase 可及性与组蛋白修饰相结合的测量。
通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们无法获得最佳的 MNase 消化。如文本方案中所述，从细胞制备开始此方案。第一天，在 37 摄氏度的水浴中解冻每个细胞沉淀 10 秒。
然后，将细胞转移到冰中。对于每个细胞沉淀，立即加入冰冷的 one-X 裂解缓冲液和 one-X PIC，最终浓度为每 20 μL 10， 000 个细胞。通过上下吹打混合 10 次，不产生气泡。
在冰上工作，将每孔 20 μL 所得裂解物分装到 96 孔板中。在冰上孵育 20 分钟之前，用塑料密封盖住板。将板标记为 MNase 并将孔记录到模板密钥中。
在 20 分钟裂解完成之前，用 MNase one 稀释缓冲液将 MNase one 酶稀释至终浓度为 20 单位/μL，并将其保存在冰上。在冰上工作，按照文本方案中的说明制备 MNase one 消化预混液。然后，每行样品分装 20 μL 预混液，外加 5 μL 额外体积的预混液放入 96 孔储液板中。
裂解物孵育完成后，从冰中取出 MNase 消化板。使用多通道移液器，向每行样品中加入 20 微升 MNnase one 消化预混液，并通过上下吹打 10 次进行混合。更改行之间的提示。
然后，将板在室温下孵育整整 5 分钟。要在 5 分钟后停止反应，请使用多通道移液器向每行样品中加入 6 微升 250 微摩尔 EDTA，并上下混合几次。确保在行之间更改提示。
添加 EDTA 后，将移液器的设置切换到 20 微升，并像以前一样混合 10 次，以确保消化反应完全停止。最后，向每行 MNase 消化样品中加入 6 μL 10X 裂解缓冲液，上下吹打 10 次，充分混合。用塑料密封盖住板，并在冰上孵育 15 分钟。
按照文本方案中的说明准备抗体珠复合物板和预透明板。以 200 次 G 离心 10 秒，快速离心两个板，然后将抗体珠复合物板放在板磁铁上，等待 15 秒，让溶液变澄清。使用移液管小心取出并丢弃上清液，不要干扰珠子。
然后，从板磁铁中取出板并将其保存在冰上。将预清除反应板放在板磁铁上，等待 15 秒，让磁珠分离，让溶液变得透明。在不干扰磁珠的情况下，使用移液器小心地将上清液转移到保存在冰上的抗体珠复合物板的相应孔中。
通过上下吹打 15 次，轻轻混合每个孔。用铝板盖将板充分密封，并在旋转平台上于 4 摄氏度孵育过夜。孵育后，重新标记板 IP 反应。
第二天，将加热混合器设置为 65 摄氏度，然后在冰上制备低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液。将 IP 反应板以 200 次 G 的速度快速旋转 10 秒，将 IP 反应板放在板磁铁上，等待 15 秒，让溶液变澄清。使用多通道移液器，在不干扰珠子的情况下，小心地取出并丢弃上清液。
将板从板磁铁上取下，放在冰上。向 IP 反应板中的每行样品中加入 150 微升冰冷的低盐洗涤缓冲液，并缓慢上下混合 10 次，以完全重悬珠子。将 IP 反应板放回板磁铁上，并像以前一样去除上清液。
然后，将板放回冰上并重复洗涤步骤，总共洗涤两次。在冰上工作，向 IP 反应板中的每行样品中加入 150 微升高盐洗涤缓冲液。通过上下吹打 10 次缓慢混合样品，以完全重悬珠子。
像以前一样去除上清液后，将 IP 反应板放在冰上，并在其旁边预冷一个新的 96 孔板。向 IP 反应板中的每一行样品中，加入 150 微升高盐洗涤缓冲液，并通过上下吹打缓慢混合 10 次，以完全重悬珠子。重悬后，将每行样品转移到新的预冷 96 孔板的相应行中。
丢弃旧板。将新的 IP 反应板放在板磁铁上，并像以前一样弃去上清液。将板保持在室温下。
向 IP 反应板中的每一行样品中，加入 30 μL ChIP 洗脱缓冲液，并通过上下吹打 10 次缓慢混合。注意防止气泡形成。用 PCR 盖密封板，并在 65 摄氏度的加热混合器中以 1， 350 RPM 的混合速度孵育 1 1/2 小时。
孵育 1 1/2 小时后，在 4 摄氏度下以 200 倍 G 离心 IP 反应板 1 分钟。然后，将 IP 反应板放在板磁铁上，等待溶液澄清。使用多通道移液器，在不干扰磁珠的情况下，小心地将 20 μL 上清液转移到新的 96 孔板中，每行使用新鲜吸头。
标记板 IP Reaction 并将其保存在室温下。继续进行蛋白质消化，然后按照文本方案中的说明进行文库构建。此处显示的是文库生成前最佳、消化不足和过度消化的 MNase 消化染色质的代表性结果。
最佳酶解谱由单个核小体片段大小主导，同时未过度酶解以允许回收更高阶的核小体片段。染色质的次优消化在 IP 材料生成的测序文库的概况中也很明显。为了通过 qPCR 验证文库，针对阳性和阴性靶标评估了 IP 文库相对于输入文库的倍数富集。
此外，与输入文库相比，在基因组浏览器上检查具有高 qPCR 评估倍数富集的文库的比对读数应显示视觉上可检测到的富集。成功的核小体密度 ChIP 测序文库将包含高度相关的重复，其中很大一部分比对读数位于 MACS2 鉴定的富集峰内。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。
观看此视频后，您应该对如何生成用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库有很好的了解。在尝试此程序时，请务必记住确保染色质得到最佳消化，并且仅使用与目标表位具有高亲和力且与其他表位几乎没有交叉反应性的抗体。按照此程序，可以执行 MNase 可及性的计算建模，以回答由于细胞群内异质性而导致的表观遗传特征等问题。
该方法提供了对核小体位置和局部密度的组合效应以及其组蛋白亚基的翻译后修饰的见解，并且可以应用于任何系统，例如人或小鼠、原代细胞和冷冻组织。
概览
本文介绍了一种修改后的天然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方法，旨在生成用于核小体密度分析的序列数据集。该方法将微球菌核酸酶（MNase）可及性与组蛋白修饰测量相结合，提供了关于单个核小体水平的表观遗传特征的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观遗传学
- 染色质生物学
- 基因组测序
背景
- 天然ChIP-seq对于研究染色质结构和功能至关重要。
- 了解核小体密度对于表观基因组分析很重要。
- MNase优先消化开放染色质，有助于组蛋白修饰的研究。
- 在实现准确结果的最佳MNase消化方面存在挑战。
研究目的
- 开发一个用于核小体密度分析的精细化ChIP-seq协议。
- 将MNase可及性与组蛋白修饰测量相结合。
- 促进异质染色质特征的分辨。
使用的方法
- 使用冰冷缓冲液进行细胞制备和裂解。
- 通过MNase消化评估染色质可及性。
- 使用抗体珠复合物进行染色质的免疫沉淀。
- 用于测序分析的文库构建。
主要结果
- 成功生成用于核小体密度分析的ChIP-seq文库。
- 将MNase可及性数据与组蛋白修饰谱结合。
- 在核小体水平上增强染色质特征的分辨。
- 优化协议以改善MNase消化结果。
结论
- 修改后的ChIP-seq方法为染色质动力学提供了宝贵的见解。
- 这种方法可以显著推进对表观遗传调控的理解。
- 未来应用可能包括更广泛的染色质相关现象研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Native chromatin immunoprecipitation sequencing (ndChIP-seq) enables high-resolution mapping of nucleosome density and histone modifications in rare or primary cell populations. This combinatorial measurement advances predictive confidence in epigenetic target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. The approach supports portfolio decisions by clarifying chromatin-driven regulatory mechanisms relevant to transcriptional control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin state and histone modification at single nucleosome resolution.
- Supports mechanistic de-risking by resolving heterogeneous chromatin signatures into continuous elements.
- Facilitates functional target validation in rare or primary cell systems inaccessible to cross-linking ChIP-seq.
- Improves predictive confidence for transcriptional regulation hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin profiles for downstream epigenetic screening workflows.
- Standardizes MNase digestion and immunoprecipitation for reproducible, quantitative outputs.
- Enables robust assay development for histone modification and nucleosome accessibility.
- Supports reliable compound evaluation targeting chromatin modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin state measurements with disease-relevant transcriptional biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in primary or frozen tissue samples.
- De-risks advancement decisions by clarifying epigenetic mechanisms in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
ndChIP-seq integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution chromatin analysis in systems where traditional cross-linking ChIP-seq is impractical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin regulation and transcriptional control.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative nucleosome and histone modification data for assay readiness.
- Analytics: Provides genome-wide measurements and statistical enrichment outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Extends applicability to primary cells and frozen tissues for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse cell types and sample sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Operational Value: Standardizes chromatin profiling for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying chromatin-driven regulatory mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology and immunoprecipitation techniques.
- Needs access to MNase digestion, high-throughput sequencing, and computational analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of digestion and antibody validation protocols.
- Adaptable to various model systems, including human, mouse, and frozen tissues.
- Optimal MNase digestion and antibody specificity are critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Cell Lysis and Chromatin Digestion for Nucleosome Density ChIP-se
3:21
Immunprecipitation Reaction for Nucleosome Density ChIP-seq
4:33
Washes and Elution for Nucleosome Density ChIP-seq
7:31
Results: Evaluation of Nucleosome Density ChIP-seq Libraries
8:50
Conclusion
