用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库的构建

本实验的总体目标是构建天然染色质免疫沉淀测序文库，用于核小体密度分析。该方法可解答表观遗传学领域的诸多问题，例如在单个核小体水平揭示细胞群体中的表观基因组特征，并将异质性染色质信号解析为其连续组分。该技术的主要优势在于利用MNase对开放染色质区域具有优先可及性的特性，从而获得将MNase可及性与组蛋白修饰信息相结合的测量结果。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为他们无法获得最佳的MNase消化效果。按照文字版实验方案中的描述，从细胞制备开始本实验。在第一天，将每个细胞沉淀物在37摄氏度水浴中解冻10秒。

然后将细胞转移至冰上。向每份细胞沉淀中立即加入预冷的1×裂解缓冲液和1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），使终浓度为每20微升含10,000个细胞。通过上下吹打10次混匀，注意避免产生气泡。

在冰上操作，将所得裂解液每孔20微升分装至96孔板中。用塑料封膜覆盖孔板，然后在冰上孵育20分钟。将孔板标记为MNase，并在模板记录表中记录各孔位置。

在20分钟裂解即将完成前，用MNase稀释缓冲液将MNase酶稀释至终浓度为每微升20单位，并置于冰上保存。在冰上操作，按照文本方案所述配制MNase消化主混合液。然后，向96孔储液板中每排样品各分装20微升主混合液，并额外加入5微升作为补充体积。

裂解液完成孵育后，将MNase消化板从冰上取出。使用多通道移液器，向每排样品中加入20微升MNnase一步消化主混合液，通过上下吹打10次混匀。每处理一排样品之间需更换吸头。

然后，将酶标板在室温下准确孵育五分钟。五分钟后，为终止反应，使用多通道移液器向每排样品中加入6 µL 250 µmol/L EDTA，并上下吹打数次以混匀。注意每排之间更换吸头。

加入EDTA后，将移液器调至20微升，同前法吹打混匀10次，以确保消化反应完全终止。最后，向每行MNase消化样品中加入6微升10X裂解缓冲液，上下吹打10次充分混匀。用塑料封膜封板，置于冰上孵育15分钟。

按照文本方案所述，制备抗体-磁珠复合物板和预清除板。将两块板短暂离心，200 × g 离心10秒。然后将抗体-磁珠复合物板置于磁力架上，静置15秒，直至溶液变澄清。使用移液器小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。

然后，将反应板从磁力架上取下并置于冰上。将预清除反应板放在磁力架上，静置15秒，使磁珠完全沉降，溶液变澄清。在不扰动磁珠的前提下，用移液器小心地将上清液转移至置于冰上的抗体-磁珠复合物反应板的对应孔中。

用移液器轻轻吹打每个孔，上下吹打15次。用铝制板盖密封孔板，置于4摄氏度旋转平台上过夜孵育。孵育结束后，将孔板重新标记为IP反应板。

第二天，将加热振荡仪设置为65摄氏度，然后在冰上配制低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液。将免疫沉淀反应板在200 × g 条件下瞬时离心10秒。将免疫沉淀反应板置于磁力架上，静置15秒，直至溶液变澄清。使用多通道移液器，小心移除上清液并弃去，注意不要扰动磁珠。

将反应板从磁力架上取下，置于冰上。向免疫沉淀反应板的每排样品中加入150 µL预冷的低盐洗涤缓冲液，缓慢上下吹打10次，充分重悬磁珠。将免疫沉淀反应板重新放回磁力架上，静置后小心吸除上清液，操作同前。

然后，将反应板放回冰上，重复洗涤步骤，共洗涤两次。在冰上操作，向免疫沉淀反应板的每排样品中加入150 µL高盐洗涤缓冲液。用移液器轻轻吹打样品10次，使磁珠充分重悬。

按照前述方法去除上清液后，将免疫沉淀反应板置于冰上，并在其旁边预冷一个新的96孔板。向免疫沉淀反应板中的每行样品加入150 µL高盐洗涤缓冲液，通过上下吹打10次缓慢混匀，以充分重悬磁珠。重悬后，将每行样品转移至新的预冷96孔板中对应的行。

弃去旧的反应板。将新的免疫沉淀反应板置于磁板架上，弃去上清液，操作同前。将反应板置于室温下保存。

向IP反应板的每列样品中加入30微升ChIP洗脱缓冲液，通过上下吹打10次缓慢混匀。注意避免气泡产生。用PCR封板膜密封反应板，在65摄氏度下于加热振荡仪中孵育1.5小时，振荡速度为1,350 RPM。

孵育1.5小时后，在4°C条件下以200 × g离心1分钟，使免疫沉淀反应板中的样品沉降。随后将免疫沉淀反应板置于磁板架上，静置至溶液澄清。使用多通道移液器，避免触碰磁珠，为每一排更换新的枪头，小心地将20 µL上清液转移至新的96孔板中。

标记为 IP 反应的平皿，并在室温下保存。随后按照文本方案中所述进行蛋白质消化及文库构建。此处展示的是在文库构建前，经 MNase 消化的染色质在消化充分、消化不足和消化过度情况下的代表性结果。

最佳消化谱以单个核小体片段大小为主，同时避免过度消化，以保留高级核小体结构片段。染色质消化不足也会在免疫沉淀材料构建的测序文库谱型中显现。为通过qPCR验证文库，检测了免疫沉淀文库相对于输入文库在阳性与阴性靶标上的富集倍数。

此外，在基因组浏览器中检查经qPCR评估具有高倍数富集的文库的比对读段时，应能直观地观察到相较于输入文库的富集信号。成功的核小体密度ChIP-sequencing文库应包含高度相关的技术重复，且有显著比例的比对读段位于MACS2鉴定的富集峰区域内。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建天然染色质免疫沉淀测序文库以进行核小体密度分析。在实施该实验流程时，需特别注意确保染色质得到最佳消化，并仅使用对目标表位具有高亲和力且对其他表位无或仅有极低交叉反应性的抗体。完成该流程后，可进一步开展MNase可及性的计算建模分析，以探究细胞群体异质性所导致的表观遗传特征等问题。

该方法可揭示核小体定位与局部密度的组合效应，以及其组蛋白亚基的翻译后修饰情况，且可应用于任何体系，如人或小鼠、原代细胞及冷冻组织。