使用唾液酸多糖微阵列测定在人血清中分析抗Neu5Gc IgG

唾液聚糖微阵列检测的总体目标是以高通量方式评估人血清中的抗 Neu5Gc IgG 与多种唾液聚糖的对比。这种方法可以帮助回答糖免疫学领域的关键问题，例如抗 Neu5Gc 抗体如何与各种人类疾病（包括癌症、心脏病和异种移植）有关。该技术的主要优点是它允许对针对多种唾液聚糖抗原的抗 Neu5Gc 抗体进行高通量分析。

演示该程序的是我实验室的硕士生 Sharon Yehuda。仔细而详细地规划阵列制造和布局对于确保成功非常重要。此过程在 text protocol 和 supplementary information 中有详细说明。

在微量离心管中，将每种游离寡糖稀释至 100 μmol，总体积为 100 μL 游离寡糖打印缓冲液。接下来，用标记缓冲液将含有荧光染料的伯胺制备至每毫米 1 毫克。然后，以 1 毫升的总体积稀释至 1 微克/毫升。

按照文本方案中的说明制备人 IgG 标准曲线稀释液。将 384 孔板置于冰上。使用电动多移液器，根据文本方案中的板布局，分装 7 μL 的每种聚糖、标志物和标准曲线 IgG。

用封口膜盖住板，在 250 倍 g 和 12 摄氏度下旋转 2 分钟。印刷必须在湿度为 60% 至 70% 的无尘区域进行在这里，所有步骤都在洁净室中进行，并佩戴适当的手套和防护服。打开 nano 打印机和加湿器。

按照文本协议中的说明对打印机进行编程后，将装有等分样品的 384 孔板定位到阵列仪甲板上的位置，然后取下封口膜盖。此时，开始打印。用耐酒精溶剂记号笔对载玻片进行编号，并将它们存放在避光的真空密封盒中。

要处理阵列，首先从真空密封盒中取出载玻片，将其置于化学罩中 5 分钟，阵列朝上，以蒸发多余的液体。接下来，将载玻片放入装满去离子水的染色管中，使其水合。用箔纸盖住试管，在室温下缓慢轻柔地摇动孵育 5 分钟。

为了封闭载玻片上的反应性环氧基团，将载玻片浸入装有预热乙醇胺封闭溶液的 50 毫升染色管中。用箔纸盖住试管，在室温下缓慢轻柔地摇动孵育 30 分钟。将乙醇胺封闭溶液丢弃到适当的生物危害垃圾桶中。

然后，将玻片放入装满 50 摄氏度去离子水的新、干净的染色管中。用箔纸盖住试管，在室温下缓慢轻柔地摇动孵育 10 分钟。倒掉水，将玻片转移到玻璃染色架上。

将设备放入摆动板支架中，并将载玻片离心干燥。接下来，将载玻片放在 16 孔分隔器上。预润湿孔后，使用多移液器将 200 微升 PBST 分装到玻片孔中。

然后，将它们放入有盖的潮湿腔室中摇晃 5 分钟。轻弹并轻轻敲击干净的纸巾，以去除 PBST。然后，将 200 微升 PBS-Ovalbumine 封闭缓冲液分装到每个孔中。

将玻片置于潮湿的腔室中，在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。接下来，按照文本方案中的说明在 PBS-OVA 封闭缓冲液中稀释，准备初级检测。将 PBS-OVA 封闭缓冲液从载玻片上弹开，每孔加入 200 μL 一抗。

将玻片在潮湿室中孵育 2 小时。然后，将初级检测从载玻片上弹开，并用 PBST 洗涤 3 次。在潮湿的试验箱中将玻片在 PBST 中孵育 5 分钟，然后用 PBST 最后一次洗涤。

然后，用 PBS 洗涤一次。接下来，按照文本方案中的说明在 PBS 中制备二抗。将 PBS 从载玻片上弹开，加入 200 μL 二抗。

二抗从载玻片上弹开，并像以前一样用 PBST 洗涤四次。小心地取下框架，然后将载玻片放入装满 PBS 的 50 毫升载玻片染色管中，摇动 5 分钟。接下来，用去离子水填充两个玻片染色槽。

将玻片放入玻片支架中，然后将玻片浸入第一个浴槽中。快速浸入玻片 10 次。然后，将玻片转移到第二个浴槽中，再浸泡 10 次。

浸渍后，将玻片在室温下振荡孵育 10 分钟。孵育后，弃掉水并将载玻片转移到玻璃染色支架上。将玻璃染色支架放入摆动板支架中，并将载玻片离心干燥。

打开扫描仪门，将载玻片放入其中，阵列朝下。此时，开始扫描。将扫描的幻灯片另存为 TIFF 文件。

要准备用于分析的载玻片，请选择 Load Array List"并上传相应的 GAL 文件，该文件映射载玻片上每个块中的阵列。玻片具有 16 个不同的初级检测部分，每个模块一个。植物凝集素 SNA 结合 a2-6 连接的唾液酸。

而植物凝集素 MALII 结合 a2-3 连接的唾液酸。多克隆抗 Neu5Gc IgY 结合含 Neu5Gc 的唾液聚糖，但不结合含 Neu5Ac 的唾液聚糖。为了分析抗 Neu5Gc IgG，在打印的唾液聚糖微阵列上分析来自健康人供体的 12 份血清，并使用标准化至纳克/微升的荧光标记的抗人 IgG 显影。

所有测试的人血清都含有不同水平的抗 Neu5Gc IgG，几乎没有识别出匹配的含 Neu5Ac 的唾液聚糖对。此外，这 12 种不同血清之间的抗 Neu5Gc IgG 识别模式在强度和多样性水平上都高度多样化。观看本视频后，您应该对如何使用聚糖微阵列系统以高通量方式分析各种人样品中的抗 Neu5Gc 抗体有很好的了解。