Name: 使用唾液酸多糖微阵列测定在人血清中分析抗Neu5Gc IgG (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解唾液酸多糖微阵列测定技术，用于高通量分析人血清中的抗Neu5Gc IgG抗体。该方法有助于研究糖免疫学及癌症等疾病的诊断应用。

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本工作部分由以色列癌症研究基金的研究职业发展奖、以色列国家纳米技术倡议项目资助、赫尔姆斯利慈善信托基金资助的“个性化诊疗纳米药物焦点技术领域”项目（V.P-K）以及美国国立卫生研究院资助项目R01GM076360（授予X.C.）共同支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

成功的糖芯片制备需要周密的规划，并包含方案中的多个关键步骤，包括：（1）设计定义所有后续参数的区块和板布局例如， 距离、间距、样本量和打印）；（2）清洁点样针并确保针具完整性，这对控制点样均一性至关重要；（3）在打印过程中维持高湿度环境，以避免长时间打印过程中样本蒸发，从而影响点样均一性；（4）选择合适的对齐与分析参数，这些参数可能影响实验结果例如， 背景减除方法、阈值和斑点大小的灵活性）
该方法可进一步修改以满足特定的实验设计和目标。例如，可调整预点样次数，以更好地适应每种需打印到芯片上的材料类型。打印过程中的探针清洗步骤可根据不同的打印材料进行优化，采用更短或更长的清洗周期。此外，每次蘸取后探针打印的点样数量也可调整，以增加或减少点样数目，但需针对芯片上使用的每种材料分别进行校准。荧光标记物的类型及其浓度也可根据需要进行修改，前提是该标记物含有适合偶联反应的化学基团即， 用于环氧涂层载玻片的伯胺）。标准曲线的浓度和类型可进一步扩展（例如， 人/小鼠/其他生物 IgG、IgM、IgA 等等。...

唾液酸（Sias）是一类酸性糖，覆盖在脊椎动物细胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖链上。在癌细胞中，唾液酸的表达会发生改变1，并与肿瘤进展和/或转移相关2,3。哺乳动物中两种主要的唾液酸形式是 Neu5Ac 及其羟基化形式 Neu5Gc2。由于编码 CMAH 酶的基因发生特异性失活，人类无法合成 Neu5Gc。这种非人类来源的唾液酸可通过富含 Neu5Gc 的饮食（例如红肉）进入人体，并在代谢过程中整合到人类细胞中，表现为&#34;自身&#34;成分4,5。Neu5Gc 在人体上皮和内皮细胞表面以低水平存在，但在癌组织中尤其富集。人体体液免疫系统可识别 Neu5Gc 为外来抗原2,6。Neu5Gc-聚糖的抗原复杂性可能在多个层面产生，包括 Neu5Gc 的修饰方式、连接类型、基础聚糖结构与支架，以及其密度，这些均反映在人类抗-Neu5Gc 抗体反应的复杂性上6。其中部分抗体可作为癌组织的生物标志物，并具有潜在的免疫治疗价值7。化学-酶法合成不同唾液酸聚糖技术的发展8，结合聚糖微阵列技术的应用9,10，为深入分析此类抗体提供了可能。因此，随着大量天然和合成碳水化合物库的制备与操作变得更加便捷，聚糖微阵列已成为研究碳水化合物与多种生物分子相互作用的强大高通量技术10,11,12,13。在微阵列格式中，仅需极少量样品，且通过多价展示具有生物学意义的聚糖，可在单次实验中检测数千种结合相互作用。重要的是，该技术还可用于生物标志物的发现，以及监测各类样本中的免疫应答7,12。
成功的糖芯片制备需要考虑三个关键因素：打印机器人类型、糖链偶联化学方法以及检测光学系统。在打印仪器的选择方面，目前有两种技术可用：接触式和非接触式打印机。在接触式打印中，1-48根钢制针头浸入含有糖溶液的多孔源板中，通过直接接触功能化玻片表面的方式将溶液点样到玻片上。点样到玻片上的溶液量取决于针头在玻片表面停留的时间。通常，样品首先预点样于玻璃块上（以获得均一的点样斑点），然后再转移至玻片表面进行正式打印。在非接触式打印机（例如，压电式打印机）中，糖分子通过玻璃毛细管并在可控电信号作用下完成打印。电信号可精确调节，从而实现比接触式打印更精确的点样效果。所得斑点的尺寸和形态也相对更加均一。另一个优点是打印后样品可回收至源板中。然而，压电式打印机的主要缺点是打印喷头数量有限（4或8个），导致打印时间非常长，因此必须特别关注玻片的稳定性、温度、湿度以及样品蒸发问题。非接触式喷墨打印机需要较大的样品体积14。
与有限的打印方法可选性相比，聚糖偶联化学更为复杂，具有多种选择。所选用的固定化化学方法必须同时考虑聚糖上的活性基团以及载玻片表面的反应性。无论是化学合成还是天然分离的聚糖，在固定到特定微阵列表面时，均需具有相同的反应性基团。此外，聚糖必须纯净且均一。另一方面，固定化表面及化学方法应能提供可重复性和可靠的结合密度。目前已开发出多种固定化方法，包括共价结合和非共价（物理吸附）结合10,11,12,13。对于初次接触聚糖微阵列技术的研究人员，可参考这些优秀的综述文章13,15。尤为重要的是，近期提出的聚糖组学实验最低信息要求（MIRAGE）倡议，为样品制备16以及聚糖微阵列分析数据的报告17提供了指导原则，以提升这一快速发展领域的标准化水平。
本文介绍了一种使用特定接触式纳米打印机以16孔板格式制备唾液酸聚糖微阵列的详细方案。每种聚糖均含有一个伯胺基团，可通过该基团共价连接至环氧活化的玻片表面。我们还描述了利用多种人血清样本、抗体以及唾液酸结合植物凝集素对一张微阵列玻片进行检测与分析的过程。唾液酸聚糖微阵列实验主要包括微阵列制备、处理、显色及数据分析等关键步骤。微阵列的制备需预先设计阵列布局，准备聚糖样品及源板，编程控制纳米打印机，并完成玻片打印。随后，对玻片进行后续处理、显色反应和数据分析（图1）。

<table><tbody><tr><td>含伯胺的唾液酸糖链</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>化合物需求请联系 info@glycohubusa.com</td><td>打印用糖链</td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>打印缓冲液组分</td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>打印缓冲液组分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>打印缓冲液/孵育/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>载玻片封闭试剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>打印缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>载玻片封闭试剂</td></tr><tr><td>卵清蛋白（V级）</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>载玻片封闭蛋白</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>载玻片洗涤去垢剂</td></tr><tr><td>Alexa 555-酰肼</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>芯片标记物</td></tr><tr><td>ChromPure人IgG全分子</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>打印组分</td></tr><tr><td>生物素化SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>植物凝集素 &amp;ndash; 结合Sia-alpha2&amp;ndash;6连接</td></tr><tr><td>生物素化MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>植物凝集素 &amp;ndash; 结合Sia-alpha2&amp;ndash;3连接</td></tr><tr><td>鸡抗Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>一抗检测</td></tr><tr><td>Cy3-链霉亲和素</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>生物素结合</td></tr><tr><td>Cy3-抗人IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>针对人IgG的二抗检测</td></tr><tr><td>Cy3-抗鸡IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>针对鸡IgY的二抗检测</td></tr><tr><td>人血清样本</td><td>以色列血库</td><td></td><td>一抗检测</td></tr><tr><td>压缩氮气（5级）</td><td></td><td></td><td>通用除尘/干燥工具</td></tr><tr><td>环氧涂层载玻片</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>载玻片</td></tr><tr><td>环氧涂层载玻片</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>载玻片。此类载玻片表面更疏水（相较于Corning载玻片），因此糖链打印缓冲液需添加0.005% Tween-20，以获得100 &amp;micro;m大小的点样斑点。</td></tr><tr><td>384孔微孔板</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>打印用微孔板</td></tr><tr><td>VWR实验标记笔</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>载玻片标记</td></tr><tr><td>染色管</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>载玻片显色工具</td></tr><tr><td>染色缸</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>载玻片显色工具</td></tr><tr><td>载玻片玻璃支架</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>载玻片显色工具</td></tr><tr><td>GenePix扫描仪</td><td>Molecular devices</td><td>4000B</td><td>载玻片扫描仪</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>芯片打印机</td></tr><tr><td>点样针</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>打印用针</td></tr><tr><td>ProPlate模块</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>载玻片显色模块</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>阵列仪和加湿器所需</td></tr><tr><td>电子多通道移液器，8通道，体积范围2-125 &amp;mu;L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>用于向384孔板中分配样品的多通道移液器</td></tr></tbody></table>

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗neu5gc igg

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

细胞表面覆盖着一层碳水化合物链（聚糖），这种聚糖在癌症中常发生改变，其中包括唾液酸（Sia）表达的变化。唾液酸是一类具有9个碳骨架的酸性糖，位于脊椎动物细胞表面聚糖的末端。哺乳动物中两种主要的唾液酸形式是 N-N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其羟基化形式， N-N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。由于编码胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac）羟化酶（CMAH）的基因失活，人类无法内源性合成Neu5Gc。人体细胞通过摄入红肉和乳制品获得外源性Neu5Gc，并将其整合至细胞表面多种糖链上，尤其在癌组织中大量积累。因此，人体内存在循环抗Neu5Gc抗体，这些抗体在癌症及其他慢性炎症相关疾病中发挥多种作用，并正成为潜在的诊断与治疗靶点。本文介绍一种高通量唾液酸糖微阵列检测方法，用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体。含有Neu5Gc的糖链及其对应的对照糖链（含Neu5Ac的糖链），每种均带有核心伯胺基团，共价连接于环氧基修饰的玻片表面。我们以特定纳米点样仪为例，展示在16孔板格式下打印56张玻片的过程，每次打印最多可生成896个微阵列。每张玻片可用于同时筛查16份不同的人血清样本，以评估抗Neu5Gc抗体的特异性、强度及多样性。本方案详述了该稳定检测工具的操作复杂性，并为拟在微阵列平台上研究不同临床样本对Neu5Gc饮食性碳水化合物抗原免疫应答的研究者提供基本操作指南。

芯片打印、孵育与分析：
使用多种糖样本和人IgG标准曲线在16个不同区块内打印唾液酸糖微阵列，需要进行彻底的校准，以确保所有样本在每张芯片的16个区块中以及同一批次打印的所有芯片之间尽可能均匀地打印。因此，在确定具体的打印参数之前，必须进行多次校准实验，包括每种样本的缓冲液组成、芯片类型及生产厂家、384孔板类型、湿度水平、384孔板中的样本体积、每种样本的预打印量、人IgG标准曲线浓度以及标记物类型。此类打印的唾液酸糖微阵列芯片的稳定性已验证可在避光、室温、真空密封盒中保存长达10个月。在每次打印实验中，还通过使用Sia结合凝集素和抗体的质量控制实验进一步监测和验证其均匀性。显色与扫描方案经过优化，通过比较同一批次内及批次间芯片上的样本，以实现一致性和准确性。芯片使用16孔分隔器进行显色，确保各区块之间的适当分离，并采用优化的封闭条件（化学和生物）、洗涤步骤及孵育时间。一抗和二抗检测经过广泛校准，以确保最大检测信号的同时将背景和非特异性结合降至最低。芯片扫...

唾液酸聚糖微阵列检测可用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，因此有望成为一种用于癌症及其他慢性炎症介导的人类疾病的高通量诊断检测方法。

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

细胞表面覆盖着一层碳水化合物链（聚糖），这层结构在癌症中常发生改变，其中包括唾液酸（Sia）的变异……

唾液酸糖阵列检测的总体目标是以高通量方式评估人血清中针对多种唾液酸糖的抗Neu5Gc IgG抗体。该方法有助于解答糖免疫学领域的关键问题，例如抗Neu5Gc抗体如何参与包括癌症、心脏病和异种移植在内的多种人类疾病。该技术的主要优势在于，能够对针对大量唾液酸糖抗原的抗Neu5Gc抗体进行高通量分析。演示该实验操作的是我实验室的硕士生 Sharon Yehuda。在芯片制备和布局方面进行细致周密的规划对于确保实验成功至关重要。该过程在文本方案和补充信息中有详细说明。将每种糖类用微离心管中的糖芯片打印缓冲液稀释至100微摩尔，总体积为100微升。接着，用标记缓冲液将含伯胺的荧光染料配制成每毫升含1毫克的溶液，然后将其稀释至每毫升含1微克，总体积为1毫升。按照文本方案中的说明配制人IgG标准曲线稀释液。将384孔板置于冰上。使用电子多通道移液器，根据文本方案中提供的板式布局，向各孔中加入7 µL的每种聚糖、标记物和标准曲线IgG。用封口膜覆盖培养板，在12°C、250 ×g 条件下离心2分钟。打印必须在湿度为60%至70%的无尘环境中进行。此处所有步骤均在洁净室中进行，并佩戴适当的防护手套和服装。打开纳米打印机和加湿器。按照文本方案中所述设置好打印仪后，将含有分装样品的384孔板放置到点样仪载台的指定位置，并移除封口的帕拉膜。此时开始进行打印。使用耐酒精溶剂的标记笔为载玻片编号，并将其置于避光的真空密封盒中保存。处理芯片时，首先从真空密封盒中取出一张载玻片，将其放入化学通风橱中，芯片面朝上放置五分钟，以挥发多余的液体。接着，将载玻片置于盛有去离子水的染色管中进行水化。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育五分钟。为了封闭载玻片上的活性环氧基团，将载玻片浸入装有预热的乙醇胺封闭液的50毫升染色管中。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育30分钟。将乙醇胺封闭液弃入适当的生物危害废弃物容器中。然后，将玻片放入装有50摄氏度去离子水的新且洁净的染色管中。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育10分钟。弃去水溶液，将玻片转移至玻璃染色架中。将装置放入摆动板架中，离心使载玻片干燥。接着，将载玻片置于16孔分隔板上。在预润湿各孔后，使用多通道移液器向载玻片的各孔中加入200 µL PBST。然后，将它们放入一个加盖的湿盒中，振荡孵育5分钟。轻弹并轻轻拍打于干净的纸巾上以去除PBST。随后，每孔加入200 µL PBS-牛血清白蛋白封闭缓冲液。将切片置于湿盒中，在室温下轻轻振荡孵育一小时。接着，按照文本方案所述，用 PBS-OVA 封闭缓冲液稀释制备一抗。轻弹去除切片上的 PBS-OVA 封闭缓冲液，每孔加入 200 微升一抗。将切片置于湿盒中孵育两小时。然后轻轻甩去切片上的初免检测试剂，并用PBST洗涤三次。最后用PBST洗涤一次前，将切片在湿盒中用PBST孵育五分钟。然

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使用唾液酸多糖微阵列测定在人血清中分析抗Neu5Gc IgG

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本视频展示了用于分析小鼠血清中循环抗糖抗体的打印糖阵列技术。血清中的抗体与芯片上的特定糖类发生相互作用，通过免疫染色后进行荧光扫描来确认该相互作用。...

利用打印的聚糖芯片检测循环抗聚糖抗体

采用打印的聚糖微阵列策略，将传统的96孔板检测方法微型化，用于分析甲型流感病毒血凝素对含唾液酸受体的结合强度和特异性。...

一种用于评估甲型流感病毒血凝素亲和力与特异性的微型化聚糖微阵列检测方法

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。...

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。...

打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

采用亲水相互作用色谱超高效液相色谱法（UPLC）对免疫球蛋白G（IgG）N-糖链进行表征。此外，IgG...

基于超高效液相色谱的免疫球蛋白G N-糖链分析

抗体的糖基化模式决定了其临床表现，因此工业界和学术界一直在努力控制糖基化过程。由于典型的糖基工程实验耗时且劳动密集，建立一种通过瞬时沉默技术快速表征糖基化相关基因影响的实验方案将具有重要意义。...

中国仓鼠卵巢细胞中快速抗体糖工程改造

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。...

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

神经肌肉疾病临床试验的主要结局指标通常是改善肌肉功能。因此，在小鼠模型中对潜在治疗化合物对肌肉功能的影响进行临床前评估具有重要意义。本文将介绍几种用于实现这一目的的功能性检测方法。...

评估 Mdx 小鼠模型中的功能表现

了解唾液酸多糖微阵列测定技术，用于高通量分析人血清中的抗Neu5Gc IgG抗体。该方法有助于研究糖免疫学及癌症等疾病的诊断应用。

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

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