Name: 利用胶囊对生物达标中病毒样品的阴性染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习利用胶囊处理技术在生物安全二级至四级实验室中对病毒样品进行透射电镜负染的方法。该技术简化了电镜载网的操作流程，可清晰观察病毒形态与超微结构，为病毒学研究提供安全可靠的解决方案。

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我们谨向 John Carra 博士和 Rowena Schokman 致以感谢，感谢他们提供纯化的埃博拉病毒纳米样病毒颗粒（nano-VLPs）；向 Rajini Mudhasani 博士致谢，感谢其提供基孔肯雅病毒；并向 Charles（Jason）Shoemaker 博士致谢，感谢其提供表达埃博拉病毒糖蛋白的鼠白血病病毒样颗粒（Murine Leukemia VLPs）。我们还要感谢 Carl Soffler 少校在暑期实习项目（Summer Internship Program, SIP）和科学与工程学徒项目（Science and Engineering Apprenticeship Program, SEAP）中提供的支持，以及 Catherine Wilhelmsen 博士提供的实验室安全培训。

1. 在处理病毒样本前于BSL-2环境中的实验准备工作
<ol>
	<li>制备或购买覆有Formvar和碳膜的透射电镜铜网，通常为200-400目。</li>
	<li>将包被好的透射电镜铜网插入胶囊中。
	<ol>
		<li>使用放大镜以方便操作。每个胶囊中可插入一个或两个铜网。如需要，可直接购买预装铜网的胶囊，以省去此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有包被铜网的胶囊连同其他耗材和试剂一并转移至生物 containment 环境，用于病毒的负染操作。</li>
</ol>
2. 使用水性戊二醛和1%四氧化锇蒸气灭活在生物安全条件下进行负染色的胶囊法
<ol>
	<li>在生物安全柜内，用移液器吸取40 µL病毒悬液至其连接的胶囊中。 
	注意：移液器在操作完成前始终与胶囊保持连接。病毒制备方法参见我们之前的发表文献14。</li>
	<li>将移液器侧放10分钟，使网格保持水平方向，以促进病毒颗粒在包被网格上的均匀分布。</li>
	<li>在生物安全柜内的胶囊中对病毒进行灭活。
	<ol>
		<li>拿起移液器，按压推杆，将病毒溶液排入废液容器中。</li>
		<li>向胶囊中吸取40 µL的2%戊二醛固定液。 
		注意：戊二醛为危险化学品，操作时需采取适当防护措施。戊二醛可在普通生物安全柜中短时间使用，但若需长时间敞口操作，则必须在带管道的生物安全柜或化学通风橱中进行。</li>
		<li>将移液器侧放20分钟，以确保样品充分固定。</li>
		<li>排出固定液，向胶囊中吸取40 µL去离子水以清洗残留固定液。重复此清洗步骤，共进行3次漂洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向胶囊中吸取40 µL的1%醋酸铀（UA）或1%磷钨酸钾（PTA），静置30秒。 
	注意：染色时间可根据病毒样品在10秒至1分钟之间调整。 
	注意：UA为α射线发射体，具有累积毒性，操作时需采取适当防护措施。</li>
	<li>从移液器上取下胶囊，保持网格仍在胶囊内，用滤纸轻触网格边缘，吸干网格上的液体。</li>
	<li>四氧化锇蒸气灭活程序。
	<ol>
		<li>将打开盖子的胶囊放入一个50 mL离心管中，管内放置浸有1%四氧化锇溶液的滤纸。 
		注意：四氧化锇具有极高毒性且蒸气压低，必须在带管道的生物安全柜或化学通风橱中使用，操作时需采取适当防护措施，并在工作区域张贴警示信息。</li>
		<li>将50 mL离心管密封1小时，使四氧化锇蒸气充分渗透。随后对管体进行去污处理，并转移至生物安全二级（BSL-2）电镜设施中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从胶囊中取出透射电镜（EM）网格。
	<ol>
		<li>在BSL-2电镜设施中，将胶囊从离心管中取出并安装到移液器上。</li>
		<li>向胶囊中吸取40 µL去离子水，并将水排入废液容器中，重复三次。</li>
		<li>将胶囊从移液器上取下，用滤纸轻触网格边缘，吸干液体。</li>
		<li>待网格自然干燥后，妥善保存以备后续透射电镜（TEM）成像使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用2%戊二醛在生物安全防护条件下进行灭活的胶囊法，随后在BSL-2实验室中进行负染色
<ol>
	<li>病毒灭活程序。
	<ol>
		<li>在生物安全柜内，将病毒悬液与等体积的4%戊二醛充分混合，使戊二醛终浓度为2%。 
		注意：戊二醛为危险化学品，操作时需采取适当防护措施。戊二醛可在普通生物安全柜中短时间使用，但若需长时间敞口操作，应在带管道的生物安全柜或化学通风橱中进行。</li>
		<li>使用固定剂对病毒灭活至少24小时，之后进行包装、去污染，并转移至BSL-2电镜设施。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在BSL-2电镜设施中，将病毒与固定剂的混合液吸入连接于移液器、内含两张透射电镜（TEM）载网的胶囊中。</li>
	<li>将移液器水平放置10分钟，确保载网处于水平方向。 
	注：此步骤旨在促进病毒颗粒在TEM载网上均匀分布。</li>
	<li>拿起移液器，按压推杆将病毒溶液排入废液容器。向胶囊中吸入40 µL去离子水，排出至废液容器，重复此清洗步骤共3次。</li>
	<li>向胶囊中吸入40 µL的1%醋酸铀（UA）或1%磷钨酸（PTA），染色30秒。 
	注：染色时间可根据病毒样本在10秒至1分钟之间调整。 
	注意：醋酸铀（UA）为α射线发射体，且具有累积毒性，操作时需采取适当防护。</li>
	<li>将胶囊从移液器上取下，用滤纸边缘轻触载网边缘以吸去多余液体，使载网自然晾干，随后保存以备后续透射电镜成像使用。</li>
</ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
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</ol>

本文中表达的观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国陆军或美国国防部的立场。

负染色是一种有价值的透射电子显微镜（TEM）技术，用于评估和测定病毒、蛋白质复合物及纳米颗粒的大小。半个多世纪以来，通过手动将载网从试剂转移至负染液中制备液滴样本一直是经典的操作方案。该方法虽然简单，但需要经过培训获得熟练技巧才能成功完成。目前，高质量的负染色技术仍被视为先进技能，在许多透射电镜实验室中备受青睐。与传统的手动液滴法相比，胶囊法具有若干明显优势，尤其是在生物安全防护实验室中。首先，手动液滴法需要大量培训和实践经验才能熟练掌握，而胶囊法操作简便，初级技术人员仅需通过移液即可完成。手动液滴法在生物安全三级（BSL-3）和四级（BSL-4）个人防护装备条件下最大的挑战是使用镊子操作TEM载网时触觉感知和灵活性显著下降。涂覆层脆弱的TEM载网极易被镊子损坏或刺穿，而这种损伤通常直到在透射电镜下观察时才会被发现。胶囊法的第二个优势在于，TEM载网仅在插入胶囊和取出送入电子显微镜时被直接操作。无论是在生物安全防护实验室还是在BSL-2级别的电镜设施中工作，均无需直接接触载网。胶囊法的第三个优势是载网的两面均可附着病毒和染色剂。当样本浓度较低时，这一特点尤为有用；但如果样本浓度过高，则可能导致样本过多，或需在使用前对样本进行稀释。</p...

透射电子显微镜（TEM）是一种有效的工具，可用于观察生物样本的形态和超微结构，这些样本过于微小，无法通过传统的光学显微镜观察1,2,3,4。TEM 将电子束穿过非常薄的样本，由于电子的波长比光短得多，因此可产生更高分辨率的图像。样本中使电子发生偏转或阻挡电子的区域呈现为暗色，而允许电子通过的区域则呈现为亮色。
由于缺乏电子致密物质，病毒在透射电子显微镜（TEM）下难以观察，因为它们无法有效散射电子。负染色法是最常用的增强对比度以在TEM下观察病毒的方法。最早的负染色技术由Brenner和Horne于1959年提出，其依据是Hall（1955年）和Huxley（1957年）的一项实验，他们发现当生物结构浸入电子致密物质中时，会呈现出反向对比的影像5。在过去半个世纪中，负染色技术几乎未发生改变。负染色过程包括将重金属盐溶液短暂地施加到TEM载网上的样品，目的是使致密物质包围病毒颗粒，但不渗入病毒内部6。这样可形成深色轮廓，从而揭示颗粒的形态5。本研究采用两种负染试剂：醋酸铀酰（UA）和磷钨酸钾（PTA）。这两种染色剂均常用于对病毒、蛋白质复合物和纳米颗粒等小型生物样品进行负染色7,8,9。
传统的负染色技术是手工液滴负染色技术7。该方法需要使用镊子精确操作脆弱的透射电镜（TEM）载网，以施加少量病毒样品、染色剂和进行洗涤。典型的制样流程包括将样品悬液的液滴加到覆有支持膜的TEM载网上（图1A）。待样品附着于膜表面后，用滤纸从载网边缘吸去多余液体，并用铀酸（UA）或磷钨酸（PTA）染色数秒至一分钟，具体时间取决于样品类型。随后通过将滤纸接触载网边缘的方式吸除多余的液体。
手动液滴法要求每个载网均需单独制备。若操作不慎，包被的透射电镜（TEM）载网极易被刺破、弯曲或污染。处理多个样品时，可能导致载网追踪困难，并难以确保每个样品染色的一致性。由于需要穿戴个人防护装备（PPE），该手动染色操作在生物安全等级（BSL）-3 和 -4 的生物 containment 实验室中实施时更为困难。PPE 笨重，且生物 containment 环境的气流扰动远高于普通实验室。在 BSL-3 生物 containment 实验室工作的人员必须佩戴两副手套，并在生物安全柜（BSC）内操作。双层手套会降低触觉敏感性，并限制精细的运动操作。BSC 内用于保护操作者并防止样品污染的气流可能导致样品和染液过快干燥，从而影响染色质量。BSC 内强烈的湍流气流还可能迅速吹走未固定牢固的载网。在 BSL-4 生物 containment 实验室中，安全要求更为严格。工作人员必须穿着正压防护服，这进一步限制了身体活动能力以及清晰观察和操作载网的能力。在 BSL-4 实验室工作的技术人员同样需佩戴至少两副手套，外层手套通常较厚，显著降低了操作灵活性和触觉感知。最后，用于操作 TEM 载网的镊子较为尖锐，存在刺穿手套的风险，对技术人员构成安全隐患。使用含有载网的胶囊可避免使用镊子，从而为生物 containment 环境下的载网操作提供一种安全、无需镊子的替代方案。此外，胶囊还为载网在处理过程、锇蒸气去污以及储存期间提供了有效的保存方式，确保载网有序且免受损坏。
在本报告中，我们介绍了一种在生物安全实验室中用于负染透射电镜（TEM）载网的新方法，该方法利用mPrep/g胶囊——一种基于胶囊的载网操作与染色装置10,11,12。该胶囊可容纳两个TEM载网，最大限度减少直接操作，并降低载网损坏的风险。胶囊可直接连接到单通道或多通道移液器上，方式与移液器吸头相同，从而可将各种液体施加至胶囊内的载网上。这使得多个样本可同时制备，并拥有重复的载网（图1B）。使用胶囊进行负染时，先将病毒样品吸入胶囊中并保持10分钟，使病毒吸附到载网表面。随后用去离子水（dI水）洗涤吸附了病毒的载网，并用铀酸（UA）或磷钨酸（PTA）染色数秒至1分钟。该过程所使用的操作步骤和试剂与手动液滴法相同，不同之处在于所有操作均在胶囊内完成，无需直接接触载网（图1C、1D）。
本研究旨在评估胶囊法作为在生物安全防护环境中对病毒样本进行负染色的新方法。本研究还考察了采用胶囊法进行两种不同病毒灭活程序后所获得的透射电镜（TEM）图像质量：1）快速灭活，使用1%四氧化锇蒸气；2）24小时灭活，使用2%戊二醛。最后，我们评估了两种常用于胶囊法的负染剂——醋酸铀（UA）和磷钨酸（PTA）的应用效果。13

<table><tbody><tr><td>Formvar/碳膜包被透射电镜载网</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200目铜网，每包100个</td></tr><tr><td>mPrep/g胶囊</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>盒装</td></tr><tr><td>mPrep/f连接器</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>标准型，每包16个</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>50%溶液，电镜级</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>4%水溶液</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>粉末</td></tr><tr><td>磷钨酸钾</td><td>EMS</td><td>19500</td><td>粉末</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>50号</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

在生物安全 containment 环境中利用胶囊进行病毒样本的负染色

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

透射电子显微镜（TEM）可用于以纳米级分辨率观察病毒及其他微生物病原体的超微结构。大多数生物材料不含能够散射电子以形成图像的致密元素，因此需要使用负染法，即利用致密的重金属盐包裹样品周围。为了在透射电子显微镜下观察悬浮状态的病毒，必须将样品加载到覆盖有仅数纳米厚透明支持膜的小网格上。由于这些网格尺寸微小且易碎，操作困难，容易受到气流影响而移动。其表面薄膜极易受损，导致样品难以甚至无法成像。具有感染性的病毒必须在生物安全柜（BSC）中操作，某些病毒还需在生物 containment 实验室环境中处理。在生物安全等级（BSL）-3 和 -4 条件下对病毒进行染色尤为困难，因为这些环境气流更紊乱，且技术人员必须穿戴个人防护装备（PPE），从而降低了操作灵活性。
本研究评估了一种用于生物安全防护环境中病毒负染的新装置。该装置是一种胶囊式结构，可作为专用的移液器吸头使用。将载网装入胶囊后，用户只需将试剂吸入胶囊内，即可将病毒和染液递送至胶囊内的载网上，从而避免了对载网的直接人工操作。尽管该技术最初专为生物安全三级（BSL-3）或四级（BSL-4）防护环境设计，但它也可在任何实验室环境中简化样品制备过程，实现便捷的病毒负染。该方法同样适用于纳米颗粒、大分子及其他类似样品的负染透射电镜（TEM）标本制备。

荚膜法可制备高质量的负染样品用于透射电镜成像：
首先，我们评估了采用手动液滴法和胶囊法对扎伊尔埃博拉病毒进行负染色所生成图像的质量。埃博拉病毒与马尔堡病毒同属于Filoviridae科。埃博拉病毒直径通常为80至100 nm，长度可达1,000 nm以上。埃博拉病毒必须在生物安全四级（BSL-4） containment 环境中操作。图2展示了采用手动液滴法和胶囊法进行负染色所获得的图像。图2A（手动液滴法）和图2B（胶囊法）显示，埃博拉病毒样本具有清晰的细节，病毒颗粒中心可见核衣壳结构，表面可观察到明显的埃博拉病毒糖蛋白。因此，胶囊法和液滴法均能够产生相似质量的透射电镜（TEM）图像。
<p class="jove_step" fo:keep-toget...

本方案提供了对病毒样本进行负染色的操作说明，可轻松应用于生物安全二级、三级或四级实验室。方案中包括使用一种创新的处理胶囊，该胶囊可保护透射电子显微镜载网，并在生物 containment 环境中更复杂的操作条件下为使用者提供更便捷的操作体验。

透射电子显微镜（TEM）可用于以纳米级分辨率观察病毒及其他微生物病原体的超微结构。大多数……

本方法的总体目标是在生物安全 containment 条件下，为病毒样本提供一种简单且有效的透射电子显微镜（TEM）负染色操作流程。该方法有助于解答病毒学研究中的关键问题，例如待研究病毒的形态学特征与结构特点。该技术的主要优势在于，能够在生物安全 containment 环境中简便、高效地处理电子显微镜载网。由于该技术可广泛适用于各类实验环境中的病毒样本，因此在未知病毒的 TEM 诊断中具有重要应用价值。尽管我们主要将该方法用于辅助病毒的透射电镜研究，但其应用范围更为广泛，亦可用于大多数纳米颗粒的电镜分析。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为将载网装入和取出胶囊时需经过一定练习，才能确保载网不被损坏。当我们遇到在生物 containment 环境中处理小型透射电镜载网的困难时，首次提出了这一方法的想法。 开始此操作前，准备或购买 Formvar 和碳支持膜的透射电镜铜网。将包被好的透射电镜铜网插入样品胶囊中。随后，将装载好的胶囊连同其他耗材和试剂转移至生物安全 containment 环境中。首先，将胶囊连接至移液器上。吸取 40 µL 病毒悬液进入胶囊中。将移液器侧放，使铜网保持水平方向孵育 10 分钟。接着，拿起移液器，将病毒溶液排入废液容器中。向胶囊中吸入 40 µL 2% 戊二醛固定液。再次将移液器侧放，孵育 20 分钟。之后，排出固定液，并向胶囊中吸入 40 µL 去离子水以洗涤去除残留固定液。重复此洗涤步骤三次。接着，将40微升的1%醋酸铀或1%磷钨酸钾吸入胶囊中。让胶囊静置30秒。然后，将胶囊从移液器上取下。用一片滤纸接触载网边缘以吸去多余液体。将滤纸转移至一个15毫升离心管中。接着，将滤纸浸入1%四氧化锇溶液中。 将胶囊打开盖后放入管中。密封管子一小时，使四氧化锇蒸气充分渗透。之后对管子进行去污染处理，并将其从生物 containment 转移至 BSL-2 电镜实验设施。从离心管中取出胶囊，然后将其放在移液器上。吸取40微升去离子水进入胶囊，随后将水排入废液容器中。重复此水洗步骤三次。接下来，从移液器上取下套头。使用滤纸将载网吸干。让载网自然晾干，然后放入载网盒中保存，待进行透射电子显微镜（TEM）成像时使用。首先，将病毒悬液与等体积的4%戊二醛混合，使戊二醛的终浓度为2%。使用固定剂在至少24小时内灭活病毒。对离心管进行去污染处理，并将其转移至生物安全二级（BLS-2）电镜实验设施。随后，将载有捕获网格的吸头连接至移液器。将混合液吸入胶囊中。将移液器侧放，使网格保持水平方向放置10分钟。接下来，拿起移液器，将病毒混合液排入废液容器中。向枪头中吸入 40 微升去离子水，然后将水排入废液容器。重复此清洗步骤三次。此后，将 40 微升 1% UA 或 1% PTA 吸入胶囊中，保持 30 秒。将胶囊从移液器上取下。使用滤纸将载网吸

utilization-capsules-for-negative-staining-viral-samples-within

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用胶囊对生物达标中病毒样品的阴性染色

来源：Feltwell, T., 等. 利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌。J. Vis. Exp.

培养与分离形成荚膜的致病性细菌菌株

来源：Moore, M. D., 等．用于测定病毒衣壳结构完整性的体外替代方法．J. Vis.

使用透射电子显微镜观察热处理的病毒衣壳

来源：Blancett, C. D.，等．生物安全条件下利用胶囊对病毒样本进行负染色的方法．J. Vis. Exp.

安全的病毒样本制备用于透射电子显微镜观察

在本视频中，我们演示了在生物安全防护环境中利用处理胶囊对包膜病毒样本进行负染色的方法。通过透射电子显微镜观察经负染色处理的病毒，可对病毒的结构与形态进行纳米级分辨率的研究。...

基于胶囊的病毒样本负染技术在透射电镜载网上的应用：一种用于观察包膜病毒超微结构的重金属染色技术

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

该技术描述了一种用于测量多糖荚膜和菌体半径的自动化批量图像处理程序。尽管该程序最初是为Cryptococcus...

Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

荚膜多糖是新型隐球菌（Cryptococcus...

大小很重要：Cryptococcus neoformans 荚膜直径的测量

我们展示了利用不连续密度梯度根据细菌荚膜产生情况分离细菌群体的方法。该方法可用于比较不同培养物之间的荚膜含量、分离具有特定荚膜表型的突变株，或鉴定荚膜调控因子。本文描述了该检测方法的优化及操作流程。...

利用不连续密度梯度按荚膜含量分离细菌

本文介绍了一种用于分离感染性变形虫的单细胞微吸吮方法。为了分离感染了福斯托病毒（Faustoviruses）及未知巨型病毒的Vermamoeba...

单细胞微吸法作为荧光激活细胞分选的替代策略用于巨型病毒混合物的分离

为深入分析呼吸道合胞病毒（RSV）RNA合成的分子机制，我们报告了一种利用分子伴侣磷酸化蛋白（P）共表达无RNA的核蛋白（N）的实验方案0用于后续 体外...

呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

学习利用胶囊处理技术在生物安全二级至四级实验室中对病毒样品进行透射电镜负染的方法。该技术简化了电镜载网的操作流程，可清晰观察病毒形态与超微结构，为病毒学研究提供安全可靠的解决方案。

在生物安全 containment 环境中利用胶囊进行病毒样本的负染色

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