在生物安全 containment 环境中利用胶囊进行病毒样本的负染色

本方法的总体目标是在生物安全 containment 条件下，为病毒样本提供一种简单且有效的透射电子显微镜（TEM）负染色操作流程。该方法有助于解答病毒学研究中的关键问题，例如待研究病毒的形态学特征与结构特点。该技术的主要优势在于，能够在生物安全 containment 环境中简便、高效地处理电子显微镜载网。由于该技术可广泛适用于各类实验环境中的病毒样本，因此在未知病毒的 TEM 诊断中具有重要应用价值。尽管我们主要将该方法用于辅助病毒的透射电镜研究，但其应用范围更为广泛，亦可用于大多数纳米颗粒的电镜分析。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为将载网装入和取出胶囊时需经过一定练习，才能确保载网不被损坏。

当我们遇到在生物 containment 环境中处理小型透射电镜载网的困难时，首次提出了这一方法的想法。

开始此操作前，准备或购买 Formvar 和碳支持膜的透射电镜铜网。将包被好的透射电镜铜网插入样品胶囊中。随后，将装载好的胶囊连同其他耗材和试剂转移至生物安全 containment 环境中。首先，将胶囊连接至移液器上。吸取 40 µL 病毒悬液进入胶囊中。将移液器侧放，使铜网保持水平方向孵育 10 分钟。接着，拿起移液器，将病毒溶液排入废液容器中。向胶囊中吸入 40 µL 2% 戊二醛固定液。再次将移液器侧放，孵育 20 分钟。之后，排出固定液，并向胶囊中吸入 40 µL 去离子水以洗涤去除残留固定液。重复此洗涤步骤三次。

接着，将40微升的1%醋酸铀或1%磷钨酸钾吸入胶囊中。让胶囊静置30秒。然后，将胶囊从移液器上取下。

用一片滤纸接触载网边缘以吸去多余液体。将滤纸转移至一个15毫升离心管中。接着，将滤纸浸入1%四氧化锇溶液中。

将胶囊打开盖后放入管中。密封管子一小时，使四氧化锇蒸气充分渗透。之后对管子进行去污染处理，并将其从生物 containment 转移至 BSL-2 电镜实验设施。

从离心管中取出胶囊，然后将其放在移液器上。吸取40微升去离子水进入胶囊，随后将水排入废液容器中。重复此水洗步骤三次。

接下来，从移液器上取下套头。使用滤纸将载网吸干。让载网自然晾干，然后放入载网盒中保存，待进行透射电子显微镜（TEM）成像时使用。

首先，将病毒悬液与等体积的4%戊二醛混合，使戊二醛的终浓度为2%。使用固定剂在至少24小时内灭活病毒。对离心管进行去污染处理，并将其转移至生物安全二级（BLS-2）电镜实验设施。随后，将载有捕获网格的吸头连接至移液器。将混合液吸入胶囊中。将移液器侧放，使网格保持水平方向放置10分钟。

接下来，拿起移液器，将病毒混合液排入废液容器中。向枪头中吸入 40 微升去离子水，然后将水排入废液容器。重复此清洗步骤三次。

此后，将 40 微升 1% UA 或 1% PTA 吸入胶囊中，保持 30 秒。将胶囊从移液器上取下。使用滤纸将载网吸干。

然后，让载网自然晾干。

在本研究中，采用手动液滴法和胶囊法对扎伊尔型埃博拉病毒样本进行负染色。这两种方法获得的透射电镜图像均显示出清晰的结构细节，病毒颗粒中心可见核衣壳结构，表面可见糖蛋白。因此，胶囊法能够产生与手动液滴法质量相当的透射电镜图像。接下来，使用基孔肯雅病毒比较了不同的样本灭活方法。样本灭活可通过快速法实现，即使用2%戊二醛处理20分钟，随后用1%四氧化锇处理1小时；也可通过过夜法实现，即使用2%戊二醛处理24小时。如图所示，未使用四氧化锇但时间较长的灭活过程能够显示更丰富的超微结构细节。

然后，利用包埋法，采用醛固定的病毒样颗粒比较了两种染色方法。醋酸铀酰和磷钨酸均显示出高质量的结果，具有清晰的边界和可见的糖蛋白。

掌握该技术后，根据样本数量的不同，整个过程大约需要一个半小时。在进行该操作时，重要的是要牢记根据实验目的选择合适的固定剂和染色试剂。完成该步骤后，还可进一步采用其他方法（如颗粒计数）来计算病毒浓度，从而回答更多科学问题。

该技术改进了病毒学家研究病毒形态和结构信息的方式，使其操作更为便捷，尤其适用于生物安全三级（BLS-3）和四级（BLS-4）水平的病毒。观看本视频后，您应能够充分理解如何在生物安全 containment 环境中轻松处理用于负染的透射电镜（TEM）载网。请注意，使用醛类、四氧化锇和醋酸铀酰时具有极高危险性，操作过程中必须采取适当防护措施，例如佩戴合适的个人防护装备并在化学通风橱中进行操作。