Name: 原发性大鼠瓣膜间质细胞的分离与鉴定: 主动脉瓣钙化的新模型研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解从大鼠主动脉瓣分离瓣膜间质细胞（VICs）的方法，用于研究钙化性主动脉瓣疾病的发病机制。该技术结合胶原酶消化和体外培养，为心血管研究提供可靠的细胞模型。

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CD31 抗体由爱丁堡大学的 Karen Tan 博士慷慨惠赠。本研究获得了生物技术和生物科学研究中心（BBSRC）的资助，资助形式包括研究所战略项目拨款（BB/J004316/1；BBS/E/D/20221657）（VEM 和 CF）、研究所职业发展研究员项目 BB/F023928/1（VEM），以及通过 BBSRC 联合培养博士生项目获得的资助 BB/K011618/1（LC）。

所有动物实验均经罗斯林研究所动物使用委员会批准，动物的饲养和管理均遵循英国国内事务部关于动物护理和使用的指南。在下述方案中，使用了5周龄的雄性Sprague Dawley大鼠。
1. 试剂配方
<ol>
	<li>制备 培养基 使用DMEM/F12培养基（DMEM与F-12营养混合物），添加10%经灭菌处理的热灭活胎牛血清（FBS）和1%庆大霉素。</li>
	<li>制备 成骨诱导培养基 使用培养基及 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi。
	<ol>
		<li>准备 1 M 氯化钙 (CaCl₂2) 通过称取 555 mg 的 CaCl2 并将其溶解于5 mL蒸馏水中，制成5 mL的1 M CaCl₂溶液2使用0.22 µm注射器滤器过滤溶液，以对溶液进行灭菌。</li>
		<li>准备 1 M 磷酸钠 通过称取710 mg无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）和600 mg无水磷酸二氢钠（NaH2PO4），分别溶于5 mL蒸馏水中。混合3,870 µL的Na2HPO4 和 1,130 µL 的 NaH2PO4并通过0.22 µm针头滤器过滤以灭菌溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 洗涤缓冲液 含 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）和 1% 庆大霉素</li>
</ol>
2. 解剖罩的准备
<ol>
	<li>所有解剖操作均应在通风橱内进行，通风橱需预先用70%乙醇消毒，以确保样本和试剂的无菌状态。</li>
	<li>解剖工具须经高压灭菌后，使用前再将工具尖端浸入盛有70%乙醇的烧杯中进行消毒。</li>
	<li>准备盛有洗涤缓冲液的烧杯，在工具接触动物或组织前，先将其浸泡于洗涤缓冲液中。洗涤缓冲液须始终置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 大鼠瓣膜间质细胞的原代提取
注意：以下实验方案使用5周龄雄性Sprague Dawley大鼠。
<ol>
	<li>根据英国英国内政部指南，通过颈椎脱位法处死大鼠（约100克）。</li>
	<li>将每只大鼠仰卧置于玻璃解剖板上，用70%乙醇喷洒皮肤进行消毒，以分离出心脏。</li>
	<li>使用解剖剪在大鼠正中线处做一个4 cm的切口，暴露腹腔，小心移除肋骨和肺组织，以暴露心脏。</li>
	<li>使用一把锋利的弹簧弯头剪刀取出心脏，并将解剖后的心脏保存在冰上预冷的洗涤缓冲液中，直至所有大鼠的粗解剖操作完成。</li>
	<li>为进行心脏显微解剖，将心脏转移至盛有洗涤缓冲液的培养皿中。使用直头弹簧剪刀（6 mm 刀刃）修剪心肌，仅保留升主动脉及主动脉根部周围的小片区域。</li>
	<li>使用相同的弹簧直剪（6 mm 刀片），小心地从升主动脉向左心室方向剪开，暴露主动脉瓣瓣叶。</li>
	<li>将打开的主动脉转移至一个盛有HBSS的新鲜无菌培养皿中。使用Vannas型囊膜切开显微剪刀（3 mm刀片），分离出位于主动脉基部、具有独特“U”形特征的主动脉瓣瓣叶。</li>
	<li>将所有叶状组织置于含有1 mL预冷洗涤缓冲液的1.5 mL微量离心管中，冰上保存，直至所有解剖操作完成。</li>
	<li>所有叶片采集完毕后，在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 1 分钟，以去除洗涤缓冲液。</li>
	<li>在细胞培养罩内进行后续步骤以确保无菌。为去除血管内皮细胞（VECs），将瓣叶置于100 µL 425 U/mL II型胶原酶中，在37 °C消化5分钟。使用200 µL移液枪头轻轻吹打，以终止消化反应。</li>
	<li>以100 × g离心30秒使小叶成团，小心弃去上清液。用500 µL洗涤缓冲液洗涤两次，每次均以100 × g离心30秒使细胞重新成团。</li>
	<li>用 100 µL 浓度为 425 U/mL 的胶原酶 II 消化 2 小时，以从瓣膜小叶中收获 VICs，然后使用 200 µL 移液枪头轻轻吹打，使 VICs 释放。</li>
	<li>将胶原酶II用19 mL培养基稀释，于670 × g离心5分钟，以沉淀VICs及残留的瓣膜小叶碎片。弃去上清液，将小叶和VICs相应转移至培养皿/培养瓶中（表1).</li>
	<li>在培养基中培养VICs 5-7天，直至在37 °C、5% CO₂条件下达到汇合2，每72小时更换一次培养基。用于后续实验时 体外 实验，融合度达到100%后传代不超过5次。</li>
</ol>
4. 大鼠VICs钙化的诱导
注意：所有实验均需使用血细胞计数板对细胞进行计数。
<ol>
	<li>在无菌操作台中进行所有原代细胞的接种和传代，以防止污染。为制备原代大鼠VICs， 体外 钙化实验，以每孔150,000个细胞的密度将细胞接种于6孔板中。在培养基中培养至细胞融合度≥90%（通常为72小时）。</li>
	<li>将VICs分别用促钙化培养基与对照培养基处理，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2，再继续培养 72 小时。</li>
	<li>为进行后续下游分析，研究钙化的原代大鼠VIC时，需移除钙化/对照培养基，并用洗涤缓冲液洗涤单层细胞，以去除未结合的Ca和Pi离子。</li>
</ol>
5. 大鼠VIC表征
<ol>
	<li>为通过免疫染色监测波形蛋白（vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等表型标志物，将大鼠VICs以每孔150,000个细胞的密度接种于6孔板中（孔内含盖玻片，细胞将在盖玻片表面生长），培养至细胞融合度达50%。</li>
	<li>吸除培养基，用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞单层10分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。 
	注意：PFA具有毒性，操作时须谨慎。</li>
	<li>将细胞单层在封闭与通透缓冲液（1× PBS，5%与二抗同源的正常血清，0.3% Triton X-100）中室温孵育1小时。</li>
	<li>将细胞单层在抗体稀释缓冲液（PBS中含1%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100）中稀释的小鼠抗波形蛋白抗体和兔抗α-SMA抗体中4 °C过夜孵育，置于摇床上轻柔振荡。 
	注：阴性对照使用非偶联的小鼠IgG和兔IgG，稀释比例与实验样本相同。</li>
	<li>次日，用PBS洗涤3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。</li>
	<li>加入荧光标记的二抗，在室温下轻柔振荡孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤3次后，用镊子小心夹出含大鼠VICs的盖玻片，置于含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的载玻片上。将载玻片在4 °C下避光静置至少24小时，随后用荧光显微镜观察。</li>
	<li>进行Western blot分析时，将大鼠VICs以每孔150,000个细胞的密度接种于6孔板中，在培养基中培养至100%融合。</li>
	<li>取8 µg蛋白进行Western blot，检测CD31表达以排除任何VEC污染。 
	注：Western blot操作按先前所述标准流程进行9。</li>
	<li>进行基因表达研究时，按照试剂盒制造商说明书，使用商用试剂盒提取核糖核酸（RNA）。</li>
	<li>通过逆转录获得cDNA，以Gapdh为内参基因，采用绿色荧光染料检测法进行聚合酶链式反应（PCR）和实时定量PCR（RT-PCR，又称qPCR）检测目的基因的表达水平，具体方法见先前报道10。
	<ol>
		<li>PCR分析程序如下：94 °C预变性3分钟（1个循环），随后进行30个循环：94 °C变性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸35秒，最后72 °C终延伸5分钟（1个循环）。</li>
		<li>qPCR分析程序如下：95 °C预变性10分钟（1个循环），随后进行40个循环：95 °C变性15秒，60 °C退火与延伸1分钟；再进行1个熔解曲线程序：95 °C 1分钟，55 °C 30秒，95 °C 30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用含2%琼脂糖凝胶的Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液进行凝胶电泳，分析PCR产物。</li>
</ol>
6. 大鼠VIC钙化研究
<ol>
	<li>进行茜素红S染色及生化钙化研究时，请遵循第4节所述的细胞接种与钙化操作指南。</li>
	<li>用5%茜素红S溶液对细胞单层进行染色，置于摇床上轻柔振荡20分钟；随后用蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。获取每孔的图像。</li>
	<li>为定量钙沉积，使用生化钙检测试剂盒。用0.6 M盐酸（HCl）在4 °C条件下轻柔振荡浸提24小时，以释放Ca2+离子。</li>
	<li>收集上清液，并按照制造商说明书，使用钙检测试剂盒（见材料表）测定钙浓度。</li>
	<li>将钙浓度计算为总细胞蛋白的比值。用0.1 M氢氧化钠（NaOH）加0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）对细胞单层中的蛋白质进行变性处理，随后按照制造商说明书，采用去垢剂兼容型（DC）蛋白测定法测定总蛋白浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+stenosis%3A+a+disease+of+the+valve+and+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).</li>
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<li>Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Msx2+promotes+cardiovascular+calcification+by+activating+paracrine+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals.</a> J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).</li>
<li>Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOVAS-1+cell+line%3A+a+new+in+vitro+model+of+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification.</a> Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).</li>
<li>Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+PHOSPHO1+suppresses+vascular+smooth+muscle+cell+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification.</a> J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).</li>
<li>Cui, L., Rashdan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+stage+renal+disease-induced+hypercalcemia+may+promote+aortic+valve+calcification+via+Annexin+VI+enrichment+of+valve+interstitial+cell+derived-matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physio%22%5BJournal%5D)">End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles.</a> J Cell Physio. , (2017).</li>
<li>Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本详细方案描述了一种获取原代大鼠心瓣膜间质细胞（VICs）的实用方法，通过酶消化法从大鼠心脏瓣膜中分离这些细胞。本方法进一步支持并拓展了既往报道的大鼠模型的应用 体外 研究主动脉瓣钙化的模型13主动脉瓣间质细胞（VICs）的分离可能受到邻近瓣膜内皮细胞（VECs）污染的影响。然而，我们的免疫荧光数据证实，初始消化步骤足以去除VECs，使分离得到的细胞对内皮细胞标志物CD31呈阴性。此外，α-SMA染色证实了VICs具有活化表型，这是发生钙化所必需的特征12.
既往已有在大型动物模型中分离VIC的报道6,7,8。然而，这些物种受限于可用于下游研究的遗传和分子工具较少，且在全球范围内的实验室中获取受限。相比之下，啮齿类动物易于获得，且相关研究工具已十分成熟，因此能够分离大鼠来源的VIC可显著提升实验设计的灵活性。使用幼年大鼠来源的VIC还意味着细胞增殖能力相对更强，因而需要更少的动物即可获得更多的细胞。尽管小鼠易于获取，但由于小鼠心脏明显更小，分离原代小鼠VIC将更加耗时，且需要更多的动物才能获得与大鼠模型相当的细胞产量。
该方法的一个显著优势在于，可以随时从野生型和转基因大鼠，以及心血管疾病和瓣膜损伤的大鼠模型中分离出瓣膜间质细胞（VICs）。使用大鼠模型在大规模实验中需要更多的动物，因此为了减少动物使用量，一旦对原代大鼠VICs进行了充分表征，可将其转化以建立细胞系。
尽管主动脉瓣钙化疾病（CAVD）严重的临床后果已被广泛认知，但其潜在的致病机制尚未明确。此外，目前尚无有效的药物疗法可用于预防或潜在治愈主动脉瓣钙化。因此，在钙化条件下培养瓣膜间质细胞（VICs）提供了一种高度相关的 体外 CAVD 模型。我们证明，升高的 Ca 和 Pi 水平可诱导 体外 分离大鼠VICs的钙化伴随成骨基因标志物表达的增加 Msx2, Alpl，以及 Phospho1众所周知，这些标志物与血管钙化的病理过程相关。14,15,16因此，我们的数据表明，在钙化培养基中培养大鼠VIC是一种研究主动脉瓣钙化的合适模型。 体外事实上，我们实验室最近的研究已利用该模型证明，钙通过促进间质细胞来源的基质小泡中Annexin VI的富集，进而诱导主动脉瓣钙化17.
尽管使用大鼠VICs及其高效表征具有诸多优势，但仍存在一些局限性。首先，大鼠瓣膜中VIC群体的数量非常少，因此需要使用大量动物才能获得足够数量的细胞，以进行广泛的in vitro研究。然而，可通过在永生化的瓣膜间质细胞系中开展初步研究（正如我们近期所报道的18）来克服这一局限，随后利用原代培养进一步验证并拓展这些发现。
总之，所述方法阐述了原代大鼠VIC成功分离、培养及钙化的过程，随后可通过多种分析手段进行评估，包括生化检测以及蛋白质和RNA分析。该模型为研究CAVD提供了一个可靠且便捷的体系 体外并为研究导致这种破坏性疾病分子机制提供了有价值的工具。

健康的主动脉瓣由三个瓣叶组成，瓣膜开闭过程中产生的机械应力均匀分布于这些瓣叶。瓣叶具有明确的三层结构：纤维层（fibrosa）、疏松层（spongiosa）和心室层（ventricularis），其中以瓣膜间质细胞（VICs）为主要细胞类型。这三层结构被两层瓣膜内皮细胞（VECs）所包覆1。
间质细胞（VICs）在钙化性主动脉瓣膜病（CAVD）的进展中起着关键作用，CAVD是西方世界最常见的心脏瓣膜疾病。CAVD被认为是一种进行性疾病，其发展过程受到瓣膜组织及其周围微环境的主动调控。细胞变化最初导致纤维化增厚，最终引发主动脉瓣叶的广泛钙化。这将导致显著的主动脉瓣狭窄，并最终造成左心室流出道梗阻2，目前仅能通过外科瓣膜置换术进行有效治疗。
CAVD 的病理生理学机制复杂，但与生理性骨矿化具有相似的机制3然而，已有大量研究表明，间质细胞（VICs）具有成骨转分化及钙化的能力。4,5，这一过程背后的机制尚未完全阐明，凸显出对一种可行且相关的方法的迫切需求 体外 CAVD 模型
此前，多家实验室已成功从猪和牛模型中分离出心瓣间质细胞（VICs），并在钙化条件下培养这些细胞6,7,8。由于这些模型的主动脉瓣尺寸较大，通过酶消化法分离细胞能够高效地获得纯度较高的细胞群体。然而，由于适用于大型动物物种的分子工具有限，这些模型的应用可能受到限制。相比之下，啮齿类模型具有相对较低的成本、可进行遗传操作以及拥有大量现成的分子工具等优势，因而仍具优势。然而，从小型动物模型中分离VICs尚未被广泛采用，这很可能是由于处理微小组织样本时所遇到的技术困难所致。
本详细方案报道了一种直接分离大鼠心瓣膜间质细胞（VICs）的综合性方法。通过精细的心瓣膜解剖，继而进行一系列酶消化处理，可成功分离VICs，并将其应用于多种实验技术，包括细胞培养、钙化及基因表达分析。该方法具有高度相关性 体外 CAVD 模型无疑将对我们深入了解这一病理过程做出重要贡献。

<table><tbody><tr><td>解剖剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>直头弹簧剪（8 mm 刀片）</td><td>World Precision Instruments</td><td>15905</td><td>使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>超细 Vannas 剪刀（5 mm 刀片，8 cm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子（11 cm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>加入培养基前需过滤。</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>用蒸馏水稀释至 70% v/v。</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1150PB17</td><td>用蒸馏水稀释至 0.6 M。</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1823</td><td>用蒸馏水稀释至 0.1 M。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>在抗体稀释缓冲液中按 1/250 稀释。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>在抗体稀释缓冲液中按 1/250 稀释。</td></tr><tr><td>Superscript II 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>随机引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA（TBE）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>使用前用蒸馏水稀释至 1×。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500</td><td>溶于 1× Tris/硼酸/EDTA（TBE）中，配制成 2% 溶液。</td></tr><tr><td>裂解缓冲液（RIPA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 Msx2 引物</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 Alpl 引物</td><td>Qiagen</td><td>QT00190680</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 Enpp1 引物</td><td>Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Sigma</td><td>CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢盐</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二盐</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>用 0.1 M NaOH 稀释至 0.1%。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用 PBS 稀释至 4%。</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td>用蒸馏水配制成 2% 溶液，并调节 pH 至 4.2。</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;-1 引物对：f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>Sigma</td><td></td><td>使用浓度：10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;-2 引物对：f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG</td><td>Sigma</td><td></td><td>使用浓度：10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>小鼠来源的单克隆抗&amp;beta;-肌动蛋白&amp;minus;过氧化物酶抗体</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>在含 5% BSA 的 Tris 缓冲盐水 + 0.1% Tween（TBS/T）中按 1/50000 稀释。</td></tr><tr><td>小鼠抗波形蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>v6389</td><td>在 &lt;strong&gt;抗体稀释缓冲液&lt;/strong&gt;（1× 磷酸盐缓冲液（PBS），1% 牛血清白蛋白（BSA），0.3% Triton X-100）中按 1/900 稀释。</td></tr><tr><td>小鼠 IgG</td><td>Sigma</td><td>I5381</td><td>在稀释至抗体稀释缓冲液前，调整至与小鼠抗波形蛋白抗体相同的储存浓度。</td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX35035</td><td>在稀释至抗体稀释缓冲液前，调整至与兔抗&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白抗体相同的储存浓度。</td></tr><tr><td>兔抗&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>在抗体稀释缓冲液中按 1/200 稀释。</td></tr><tr><td>兔抗 CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>在含 5% BSA 的 TBS/T 中按 1/50 稀释。</td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗兔抗体</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>在含 5% BSA 的 TBS/T 中按 1/3000 稀释。</td></tr><tr><td>胶原酶 II</td><td>Worthington</td><td>41512862</td><td>用蒸馏水调整至 425 U/mL，然后过滤。</td></tr><tr><td>SYBR Green 预混液</td><td>Primerdesign</td><td>PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>钙检测试剂盒</td><td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>ECL 显色试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 胶片</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td></td></tr><tr><td>PCR 分子量标记</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;mu;m）</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Marienfeld Superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;茜素红成像用相机设置：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Nikon D800</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镜头</td><td>Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 弯头解剖镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td>使用前高压灭菌。</td></tr></tbody></table>

分离与表征原代大鼠瓣膜间质细胞：研究主动脉瓣钙化的新模型

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）的特征是主动脉瓣瓣叶进行性增厚，常见于老年人群和终末期肾病（ESRD）患者，后者常伴有高磷血症和高钙血症。目前尚无药物疗法能够阻止该疾病的进展，其潜在病理机制仍不明确。主动脉瓣瓣叶由覆盖在主动脉瓣叶外表面的一层薄的瓣膜内皮细胞（VECs）构成，瓣膜间质细胞（VICs）则位于VECs之间。使用大鼠模型可实现 体外 基于异位钙化的研究 体内 高磷血症和高钙血症患者血清中磷酸盐（Pi）和钙（Ca）的生理病理水平。本方案详细描述了纯的大鼠血管间质细胞（VIC）群体的分离方法，通过检测VIC标志物——α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白以及组织生长因子β（TGFβ）1和2的表达，以及血管内皮细胞（VEC）标志物分化簇31（CD31）的缺失，证实所获细胞为纯VIC群体。通过扩增这些VIC，可开展生化、遗传学和影像学研究，以探索和阐明钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）发生发展的关键介导因子。

本实验方案旨在描述原代大鼠心瓣膜间质细胞（VICs）的分离及其培养方法 体外 钙化实验。通过采用上述方法，可成功分离并扩增大鼠VICs，用于研究CAVD相关机制。
大鼠原代VIC与已确立的VIC标志物共定位：
通过免疫荧光检测成纤维细胞样间质细胞（VIC）标志物vimentin和α-SMA（分别为红色和绿色，图1A），确认了分离细胞的VIC表型，结果与既往报道一致11,12。使用非偶联的小鼠和兔IgG作为代表性阴性对照，结果如图1B所示。此外，通过PCR分析证实了VIC生长调节因子TGFβ-1和TGFβ-2的表达（图1C）。为确认分离的大鼠原代VIC无内皮细胞污染，采用犬二尖瓣内皮细胞（VECs）作为阳性对照，通过Western blot分析验证大鼠VIC不表达内皮细胞标志物CD31（图1D）。
钙和磷诱导大鼠VIC钙化：
升高的全身性 Ca 和/或 Pi 浓度通常会促进心瓣膜间质细胞（VICs）的钙化 体外为评估分离的大鼠VICs的钙化潜能，将细胞暴露于高浓度的Ca和Pi环境中，以模拟终末期肾病（ESRD）患者中的病理性高钙血症和高磷血症条件。使用2.7 mM Ca/2.5 mM Pi处理VICs可诱导钙化，通过茜素红S染色检测钙沉积予以确认（图2A）以及经盐酸浸提后钙含量的比色测定（81倍； p &lt; 0.05，使用Student's t-测试； 图2B).
与VIC钙化相关的基因表达变化：
血管细胞的钙化 体外 与独特的分子特征相关。在本研究中，用 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi 处理VICs可显著增加成骨标志物Msh同源框2的mRNA表达水平， Msx2 （2.04 倍变化； p &lt; 0.01; 图3A碱性磷酸酶， Alpl （1.49 倍变化； p &lt; 0.001; 图3B磷酸乙醇胺/磷酸胆碱磷酸酶， Phospho1 （4.7 倍变化； p &lt; 0.01，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）； 图 3C）。然而，成骨标志物的表达 Runx2以及钙化抑制剂外核苷酸焦磷酸酶 Enpp1，保持不变（图3D-E).
<img alt="细胞的共聚焦显微镜图像、凝胶电泳结果以及蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 瓣膜间质细胞（VIC）标志物的表达。 （A）免疫荧光显示瓣膜间质细胞（VICs）中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色）与波形蛋白（vimentin）的双染色及共定位。（B）使用小鼠和兔IgG作为阴性对照的代表性图像。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染成蓝色。比例尺 = 50 µm。（C）PCR分析显示瓣膜间质细胞（VICs）中存在转化生长因子β1（TGFβ-1）和TGFβ-2（泳道1-3）。泳道4为水对照。所用参考基因为Gapdh。（D）Western blot分析显示，在犬二尖瓣内皮细胞（VECs）中CD31呈高表达，而VICs中无表达。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙沉积分析；实验结果；钙染色，柱状图比较，统计数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 体外 大鼠VIC的钙化 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi 处理的VICs中钙沉积的检测结果如下：（A) 显示孔中全细胞单层经茜素红S染色的显微照片，以及(B) 盐酸浸提后钙含量的比色测定。Student's t采用t检验分析两组数据之间的显著性差异。结果以均值 ± 标准误表示。*p &lt; 与对照组相比为0.5；（n = 4）。
<img alt="基因表达柱状图；Msx2、Alpl、Phospho1、Runx2、Enpp1；钙/磷酸盐效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 与VIC钙化相关的基因表达变化。 在2.7 mM Ca/2.5 mM Pi条件下处理48小时后，VIC中成骨标志物（A）Msx2、（B）Alpl、（C）Phospho1、（D）Runx2 和（E）Enpp1 的mRNA表达倍数变化。mRNA表达水平以相对于内源性参照基因 Gadph 的倍数变化表示。采用包含成对比较的一般线性模型进行单因素方差分析（One-way ANOVA），以评估多组间的显著性差异。结果以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。**p &lt; 0.01；***p &lt; 0.001，与对照组比较；（n = 6）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>瓣叶数量</td>
			<td>培养板/培养瓶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 至 15</td>
			<td>12 孔板中的 1 个孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 至 30</td>
			<td>6 孔板中的 1 个孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 以上</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 初始接种所需叶片数量的一般指导原则。

本方案描述了大鼠来源的心瓣膜间质细胞的分离、培养及钙化过程，具有高度的生理相关性 体外 钙化性主动脉瓣膜病（CAVD）模型。利用该大鼠模型有助于开展CAVD研究，探索这一复杂病理过程背后的细胞与分子机制。

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）的特征是主动脉瓣瓣叶进行性增厚。这是一种在……中常见的疾病。

本方案的总体目标是分离大鼠瓣膜间质细胞（VICs），以研究钙化性主动脉瓣疾病的发病机制。该方法有助于解答瓣膜钙化领域中的一些关键问题，例如：为何VICs会发生钙化，以及我们能够采取哪些措施来防止这些细胞钙化。该技术的主要优势在于其取材便利性，以及可进一步转化为细胞系用于深入研究的潜力。所有解剖操作均应在通风橱内进行，操作前使用70%乙醇对通风橱进行消毒，以确保样本与试剂的无菌状态。解剖器械需先经高压灭菌，使用前再将器械尖端浸入盛有70%乙醇的烧杯中进行消毒。在接触动物或组织前，应先将解剖器械浸泡于装有洗涤缓冲液的烧杯中。按照文本方案中所述处死大鼠后，将动物仰卧置于玻璃解剖板上，并用70%乙醇喷洒皮肤进行消毒。为分离心脏，使用解剖剪在大鼠正中线做一4厘米切口，暴露腹腔，小心移除肋骨和肺组织以暴露心脏。用一把锋利的剪刀将心脏取出。将解剖后的心脏置于冰冻的清洗缓冲液中，直至所有大鼠的粗解剖完成。进行心脏显微解剖时，将解剖好的心脏转移至盛有清洗缓冲液的培养皿中。用弹簧直剪修剪心肌，保留升主动脉及主动脉根部周围的一小片区域。使用相同的弹簧直剪，小心地从升主动脉向左心室方向剪开，暴露主动脉瓣叶。随后，将打开的主动脉转移至盛有汉克斯平衡盐溶液的新鲜无菌培养皿中。用Vannas剪刀分离出位于主动脉基部、具有独特U形结构的主动脉瓣叶。将所有瓣膜组织置于含有1毫升冰浴洗涤缓冲液的1.5毫升微量离心管中，待所有解剖操作完成后进行后续处理。所有瓣膜组织收获完毕后，在4°C条件下以100g离心1分钟，以去除洗涤缓冲液。为去除瓣膜内皮细胞（VEC），将瓣膜组织置于含有100 µL浓度为425单位/毫升的II型胶原酶溶液中，在37°C条件下消化5分钟。使用200微升移液枪头轻轻吹打混匀以终止消化反应。在100g离心力下离心30秒，使小叶沉淀。小心弃去上清液后，用500微升洗涤缓冲液重悬并洗涤小叶，随后在100g离心力下离心30秒重新沉淀细胞。为了从瓣膜小叶中收获VIC，使用100微升胶原酶II在37摄氏度下消化1.5至2小时。然后用200微升移液枪头轻轻吹打，释放VIC。用19毫升培养基稀释胶原酶II，并在670×g下离心5分钟，以沉淀VIC及残留的瓣膜小叶碎片。弃去上清液后，将小叶和VICs转移至培养板或培养瓶中。在37摄氏度、5%CO2条件下，用培养基培养VICs五至七天，直至细胞融合，72小时后更换培养基。为进行体外钙化实验，将原代大鼠VICs以每孔150,000个细胞的密度接种于六孔板中。将细胞在培养基中培养至融合度超过90%。用钙化诱导培养基或对照培养基处理VICs，并在37摄氏度、5% CO2条件下继续孵育72小时。为后续下游分析研究钙化的原代大鼠VICs，移除钙化诱导培养基或对照培养基。在进行大鼠VIC表征之前，使用洗涤缓冲液洗涤单层细胞，以去除未结合的钙离子和磷酸根离子，具体操作详见文本方案。对于大鼠VIC钙化研究，用5%茜素红S溶液对细胞单层进行染色，在摇床上轻轻摇动20分钟。随后，用蒸馏水洗涤三次，每次五分钟。为了定量钙沉积，使用生化钙检测试剂盒。在4°C条件下，用0.6摩尔盐酸轻柔振荡孵育24小时以提取钙离子。收集上清液，并根据制造商说明书使用钙检测试件盒测定钙浓度。最后，按照文本方案中所述方法，将钙浓度计算为总细胞蛋白的比值。通过免疫荧光检测分离细胞的VIC表型，检测VIC标志物波形蛋白（vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白。此外，采用PCR分析确认VIC生长调节因子组织生长因子β-1和β-2的表达。Western blot 分析还用于验证大鼠心瓣膜间质细胞（VICs）不表达内皮细胞标志物 CD31，并以犬二尖瓣内皮细胞（VECs）作为阳性对照。将大鼠 VICs 暴露于高浓度钙和磷酸盐环境中，以模拟病理性的高钙血症和高磷血症条件。经钙和磷酸盐处理后，VICs 发生钙化，这通过茜素红染色检测钙沉积以及盐酸浸提后比色法测定钙含量得以确认。用钙和磷酸盐处理VIC后，成骨标志物MSX2、ALPL和PHOSPHO1的mRNA表达显著增加。掌握该技术后，除去18个瓣膜小叶的消化过程，整个操作可在一到两小时内完成。在进行该操作时，必须确保解剖和消化过程中的无菌条件。观看本视频后，您应能充分了解如何分离原代大鼠心瓣间质细胞（VICs），并利用这些细胞研究VIC钙化背后的机制。在此方案基础上，还可进一步开展流式细胞术和显微镜分析等其他方法，以深入研究VIC的生理特性与行为。该技术的建立将为心血管研究领域的科研人员提供有力工具，推动利用大鼠模型探索人类主动脉瓣分类机制的研究进展。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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