Name: 压电高精度手术骨切除 (相量): 改进小鼠颅骨窗手术的技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 了解压电高精度手术骨切除技术在小鼠颅骨窗手术中的应用，该方法可缩短手术时间并降低并发症发生率，同时避免损伤下方组织，为活体神经成像研究提供更安全高效的手术方案。

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感谢 Tamara Zeric 协助获取本文中的多光子图像。本研究由 Brain &amp; Behavior、Parkinson's 和 JPB 基金会、R01 MH108186 和 R01 DA07418 项目资助，S C 获得 F31 奖学金 1F31MH109293-01A1。

所有涉及动物的操作均按照哥伦比亚大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的标准进行。安乐死操作在腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉后，通过颈椎脱位法实施。所有外科手术均以无菌方式进行（外科医生佩戴头帽、口罩、无菌手套和一次性洁净实验服），且手术器械在每次使用后均经高压灭菌处理。
1. 术前步骤
<ol>
	<li>将所有手术器械进行高压灭菌，以确保无菌。</li>
	<li>使用异氟烷（诱导浓度4%，手术维持浓度1.5-2%）对C57bl6小鼠进行麻醉。每10分钟轻捏后肢脚趾以确认麻醉深度；若出现发声或后肢回缩反应，应加深麻醉。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹兽用眼用润滑剂，防止角膜干燥。</li>
	<li>使用脱毛膏处理头皮区域3分钟，或使用电动剃刀剃除头皮部位的毛发。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪上，并置于加热垫或设定为38°C的恒温循环水毯上。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），以提供术前镇痛。</li>
	<li>使用棉签依次交替涂抹氯己定或聚维酮碘溶液与70%乙醇，重复三次，对头皮进行消毒。</li>
	<li>在头皮下注射100 µL用生理盐水稀释50%的布比卡因，以提供局部麻醉。</li>
</ol>
2. 压电式颅窗手术
<ol>
	<li>使用经高压灭菌的无菌外科器械，用手术剪沿环形路径剪除颅骨上方约1厘米的头皮组织。将头皮从颅骨上掀起，暴露覆盖于骨表面的骨膜组织。</li>
	<li>用镊子尖刮除暴露骨面上残留的任何骨膜组织。这一步骤至关重要，以确保牙科水泥后续不会脱落。</li>
	<li>将压电手术仪设置为最低档振动。请注意，较高的档位可能因振动过强而导致血管破裂。</li>
	<li>将无菌圆形尖端固定到手柄上。 
	注意：4 mm 圆形尖端非常适合手术操作。较大的尖端尺寸有助于提高手术速度，因为可同时磨薄整个术窗区域。</li>
	<li>用10 mL注射器吸取冰冷的人工脑脊液（ACSF），并用未持压电手柄的手握住注射器。</li>
	<li>以1 mL/min的速率将人工脑脊液从注射器滴加至颅骨表面，对颅骨进行灌注。或者，可使用置于颅骨上方的蠕动泵，以解放另一只手的操作。 
	注意：使用冷的ACSF进行灌注至关重要，可防止因高频振动摩擦产生的过热。</li>
	<li>轻轻将振动手术头以微小的环形运动（每秒3圈）接触颅骨，将骨层磨薄至所需深度，以完成薄颅骨制备（5至10分钟）。 
	注意：此处制作了直径为4 mm、厚度减薄至20 µm的窗口。然而，窗口的尺寸会因手术钻头的大小而异。骨片的厚度可根据钻头作用于颅骨的时间长短，调节至所需深度。</li>
	<li>轻轻调整手柄的角度，同时在对颅骨施加压力时改变尖端的角度，以均匀磨薄颅骨。</li>
	<li>为完成彻底的骨去除而不残留任何薄骨，需将骨磨薄至窗周区域可见裂纹。用镊子小心去除残留的薄骨碎片，避免损伤下方的硬脑膜。</li>
	<li>将一块1 mm的止血胶原海绵浸泡在冷的ACSF中。用镊子夹住湿润的海绵并放置在薄颅骨上。让其静置在薄颅骨上&#160;约30秒，以防止微小出血的形成。</li>
	<li>使用镊子将一个4 mm的玻璃盖玻片横向置于已磨薄的骨窗上。</li>
	<li>使用小型塑料或木质棉签的尾端，将约 100 µL 牙科丙烯酸树脂涂抹于颅骨上，以固定窗口。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>将小鼠从手术装置中取出，并置于加热的笼子中恢复。持续监测，直至其完全恢复意识（通过正常的活动能力、步态和行为来评估）。</li>
	<li>术后三天内每天两次评估动物是否出现术后疼痛表现，包括活动减少、理毛行为减少、摄食和饮水减少、保护性行为（e.g. 跛行或弓背姿势）或攻击性增强。在动物完全恢复前，不得将其放回与其他动物同居的环境中。</li>
	<li>术后8–12小时开始，皮下注射布托啡诺（Buprenorphine，0.05–0.1 mg/kg）作为镇痛剂，连续给药3天。术后密切观察窗区是否有裂开、炎症或感染迹象。若动物未能恢复至基础水平的进食和理毛行为，应咨询兽医以考虑可能的干预措施或实施安乐死。</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li>
<li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210017/meta">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li>
<li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+surgery+in+implantology%3A+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li>
<li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation%3A+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li>
<li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+microsurgery%3A+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li>
<li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4646478/">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li>
<li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contemp+Dent+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li>
<li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0901502711002232">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

可通过更换手术头来调整手术操作。手柄上可安装多种不同尺寸的手术头。改变手术头的大小或形状将产生不同尺寸的窗口。除了4 mm的手术头外，我们还尝试了3 mm的手术头，发现其效果也良好。即使使用冰冻人工脑脊液（ACSF）进行灌注，若手术头过窄（约0.25 mm），由于振动过于集中导致产热过多，会灼伤骨组织，进而损伤下方的硬脑膜，因而无法获得理想结果。我们尚未尝试其他多种可用的手术头，但预计其他实验室可能会发现这些不同型号手术头的新用途。尽管该手术操作相对简单，但我们发现其中若干步骤可能需要排除故障。其一是振动头会在ACSF中产生大量湍流，从而降低视野清晰度，在手术的骨片减薄阶段难以判断骨层厚度。我们建议，若难以观察骨层的薄厚程度，可暂停操作，用无菌棉签轻触骨面侧缘以吸干颅骨和窗口区域的液体。切勿将棉签直接接触窗口区域，因其粗糙表面可能损伤薄骨层。检查完骨层厚度后，重新滴加ACSF并继续手术操作。我们还发现，若出现硬脑膜损伤，通常是由于术者在手术头上施加了过大的压力所致。更轻柔地握持手柄并减少施加的力度通常可解决此问题。若术者用力刮擦骨面，将导致薄骨层破裂并损伤颅骨。最后，若在骨片减薄后发现下方硬脑膜出现瘀伤样改变，很可能是振动产生的过多热量所致。增加ACSF的灌注流速即可解决此问题。
PHASOR 的主要局限性在于，手柄可以磨薄颅骨，但无法完全去除硬脑膜上方的所有骨质。其金刚石涂层尖端具有微小的粗糙突起，若用其去除全部骨质，摩擦过程会损伤硬脑膜并导致出血。因此，必须使用镊子去除残留的薄层骨质。尽管目前仍在争论通过薄层颅骨成像是否会导致更少的炎症反应以及小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的增殖减少，但在某些情况下，更倾向于使用完全去除骨质的窗口，例如以实现更深的成像深度3。
我们已优化了用于小鼠多光子成像的颅窗制备方法。据我们所知，PHASOR 是首次将压电技术应用于啮齿类动物颅窗手术以实现光学成像的技术。我们发现，在小鼠中使用压电手术具有与人类研究中报道相似的优势，即手术速度更快、不良事件更少7,8,9,10。与高速旋转钻头相比，使用压电设备可显著缩短手术时间（图 2A），并减少出血等不良事件的发生（图 2B）。此外，在我们实验室的实践中发现，与传统的颅窗手术方法相比，PHASOR 更易于新手外科医生掌握。手术速度和操作便捷性方面的优势可能因操作者而异。传统的薄颅骨制备方法通常需要使用钻头和手术刀对骨组织进行30–45分钟的减薄处理2，而采用 PHASOR 方法通常耗时不到10分钟。
我们发现，在使用 PHASOR 制备的窗口中，可以对运动皮层第4层锥体神经元中的钙瞬变进行成像，这些神经元已转染表达钙指示剂 JRGECO1a 的腺相关病毒（AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40）。我们还发现，与使用旋转钻头和手术刀制备的薄颅骨颅窗相比，成像区域更大；而后者通常仅能获得直径为 20 µm 的成像窗口2。使用 PHASOR 技术，我们能够快速将 3–4 mm 范围的颅骨区域变薄，这与 PoRTS 方法所报道的成像窗口大小相似4。这种更大的成像窗口仍保留了传统牙科钻和手术刀制备薄颅骨窗口所具有的快速成像优势。此外，PHASOR 制备的窗口可立即用于成像，而传统的去骨式颅窗则可能需要数周愈合时间才能达到最佳成像效果3。
该技术可用于研究硬脑膜下血管中血流的变化。一项重要的后续研究是将PHASOR与其他开颅窗方法的免疫反应性进行比较，以确定PHASOR是否比现有方法引起更少的炎症反应。我们希望本文记录的压电手术技术能够使更多实验室开展开颅窗操作，并成功应用多光子成像 体内.
确保手柄设置为最低振动档位，并以恒定速率灌注冰冻人工脑脊液（ACSF）。必须持续使用冰冻ACSF，否则其温度会升高并损伤硬脑膜。我们发现ACSF的灌注速率必须至少达到1 mL/min。建议使用手持注射器或蠕动泵进行灌注，而不是使用手柄内置的灌注系统。手柄内的灌注系统喷出的ACSF力量过强，会产生过多湍流，从而显著影响视野清晰度。

用于多光子成像的啮齿类动物颅窗手术制备 体内 已成为神经科学领域的一项重要技术。为了利用多光子显微镜对小鼠进行光学成像，需要去除或磨薄颅骨。该手术可通过完全移除一部分颅骨以暴露其下方的硬脑膜来完成1，或通过减薄骨片区域而不完全从硬脑膜上移除2薄颅骨法可能引起较少的炎症反应及小胶质细胞的活化3 但成像深度较浅，成像窗口尺寸较小（200 µm），且由于骨组织再生，可用于成像的时间窗口有限2添加抛光且加固的玻璃窗（PoRTS）可扩大成像范围并延长成像时间，但操作难度较高4.
目前的两种手术均使用高速旋转钻头对颅骨进行减薄或去除。减薄颅骨技术在使用钻头后还需使用手术刀进一步减薄骨组织2。PoRTS技术则额外需要使用研磨颗粒进行高速抛光的步骤4。高速旋转钻通过气动涡轮或电动机驱动钻头高速旋转。由于旋转钻在切割骨组织的同时也会损伤软组织，因此存在损伤硬脑膜及下方血管的风险。手术的成功与否依赖于外科医生的技术水平。除了这些采用机械外科方法制备的颅窗外，还已开发出利用不同溶液对颅骨进行光学透明化的化学方法5,6。然而，由于压电手术是一种机械性外科技术，本文中的比较将仅限于其他机械性方法。
压电外科设备利用超声振动来分解矿化骨组织，同时不损伤下方的软组织，因此可实现对大面积骨组织进行快速减薄。在压电外科手柄中，涡轮被一组陶瓷圆盘堆叠结构所取代，当施加电流时，这些圆盘以超声频率振动。振动通过手柄传递至带有金刚石涂层的刀头，从而实现对骨组织的切割，同时保护软组织不受损伤，这是相较于无法区分组织类型的旋转钻具的一大优势。压电外科技术最初由 Tomaso Vercellotti 开发用于临床医学，并已在牙科及颅颌面外科手术中带来显著改进7,8,9,10,11。
压电手术已被用于在Wistar大鼠中制作骨切开，经磁共振成像（MRI）和组织学检查发现，其造成的损伤显著小于传统牙科钻头12。作者得出结论：压电手术在靠近软脑组织的骨质去除中具有良好的安全性。然而，小鼠的硬脑膜更薄，更容易受损，而该研究并未制备用于慢性光学成像的颅窗。慢性成像要求血管不受损伤，且颅窗下不形成血凝块。硬脑膜损伤会引发炎症反应，导致颅窗混浊，并激活小胶质细胞及反应性星形胶质细胞增生。本文中，我们优化了适用于小鼠的压电手术方法，以制备可用于慢性成像的薄颅骨和全骨去除型颅窗。我们将该手术技术与高速旋转钻头制备的颅窗手术进行了比较。

<table><tbody><tr><td>超声骨刀 Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>超声骨刀 GP 型号具有相同的设置</td></tr><tr><td>4 mm 圆形平头超声骨刀刀头（# OT11）</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>该刀头非常适合我们的开窗操作，但也有其他不同尺寸的刀头可供选择。</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>小鼠适配器</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>用于灌注的蠕动泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>便于进行灌注操作，并可解放另一只手以提供稳定性。必要时也可用手持注射器进行灌注。</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam 止血海绵</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>可快速止住任何轻微出血，非常重要。</td></tr><tr><td>C&amp;B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>比常规牙科丙烯酸树脂强度更高。</td></tr><tr><td>人工脑脊液（ACSF）</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 眼科软膏</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima 多光子显微镜</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN 载体中心</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piezo高精度骨组织切除术（phasor）：一种改进小鼠颅窗手术的技术

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

多光子显微镜已广泛应用于神经元成像 体内重复成像需要植入颅窗或反复进行颅骨打磨。传统的颅窗手术通常使用高速旋转钻完成，许多研究者发现，在操作过程中很难避免钻头损伤脆弱的硬脑膜和血管。为避免损伤下方组织，需要经过大量训练和实践才能熟练去除颅骨，因此传统颅窗手术往往难度较大、耗时较长，且易造成组织损伤。压电外科技术广泛应用于颌面及牙科手术，其利用超声振动选择性去除骨组织，同时保护软组织不受损伤。我们已开发出一种将压电外科技术应用于小鼠颅窗手术的方法，以优化多光子成像前的手术准备。实验室内部比较结果显示，与使用旋转钻的颅窗手术相比，该方法手术时间更短，且因硬脑膜出血导致的并发症发生率更低。

在进行压电手术之前，需清除颅骨上残留的骨膜。当颅骨表面变得不透明且光滑时（图1a），外科医生即可开始压电手术。使用振动的压电刀头去除骨组织时，必须用冰冻的人工脑脊液（ACSF）持续灌注颅骨。当刀头底部约1 mm部分浸没在ACSF中时，即达到理想的灌注效果（图1b）。若灌注不足，骨组织会过热，进而损伤脑组织。当颅骨被磨薄至术者预定的深度后，骨内血管可能仍有少量残留出血。为迅速止血，可将一小块约1 mm、浸透ACSF的胶原海绵敷于开窗区域，静置约30秒（图1c）。移除胶原海绵后，颅骨开窗区域将呈现半透明状态，便于清晰观察硬脑膜上的血管。此时硬脑膜应保持完整，无明显瘀伤（图1d）。若硬脑膜呈现红色并伴有炎症表现，可能是由于手术过程中刀头施加压力过大导致血管破裂所致。为保护新开窗区域并为慢性成像做准备，需在该区域覆盖一片玻璃盖玻片。正确放置的玻璃盖玻片应轻柔地贴合于开窗表面，不造成任何损伤，且必须完全覆盖整个开窗区域。若盖玻片安放得当，开窗区域在盖玻片下仍保持半透明状态，硬脑膜中的所有血管仍清晰可见（图1e）。最后，需在玻璃盖玻片周围涂抹牙科丙烯酸树脂，以将其永久固定于颅骨表面，盖玻片的边缘也必须完全被牙科丙烯酸树脂覆盖（图1f）。
我们发现，压电手术通常比传统的颅窗手术快得多，每次手术大约需要10至12分钟（图2A）。我们还发现，肉眼观察到的硬脑膜挫伤和出血等并发症较少（图2B）。制备得当的颅窗可实现对大脑皮层神经元中荧光指示剂的多光子成像 体内我们选择对第4层皮层神经元胞体中的红色钙指示剂JRGECO1a进行成像（图3A-3B通过使用PHASOR制备的窗口，我们能够观察到这些细胞体中的钙瞬变。
<img alt="组织再生过程；愈合阶段的显微镜图像；实验性伤口修复研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：压电手术。（a）颅骨经适当准备后用于 PHASOR 手术。所有骨膜组织均已被清除，留下光滑洁净的表面。（b）PHASOR 手术进行中的代表性图像。振动手术头的底部 1 mm 浸没在冰冻的 ACSF 中。液体以 1 mL/min 的速度施加于颅骨。对颅骨施加轻微的环形运动，通过超声振动使骨质变薄。（c）颅骨变薄后，将一块 1 mm 直径、浸透冷 ACSF 的圆形胶原海绵置于窗口处，以阻止骨组织出现微小出血。（d）成功的窗口显示出半透明的硬脑膜，所有完整的血管均清晰可见。脑表面无可见损伤或瘀伤。（e）在窗口上方放置玻璃盖玻片以保护脑表面。（f）在颅骨上涂抹牙科丙烯酸树脂，将玻璃盖玻片永久固定在窗口上方。所有图像中的比例尺为 1 mm。
<img alt="比较牙科钻头与PHASOR在手术持续时间和无出血成功率上的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. PHASOR与牙科钻头手术培训成功率的比较。（A）PHASOR手术的单次平均手术时间低于牙科钻头手术（p&lt;0.05，双尾t检验），每组n=30例手术，平均每名外科医生完成10例手术。（B）成功手术的比例（定义为无出血或外科医生通过设为350倍放大的目镜观察到的硬脑膜无可见损伤）在PHASOR组高于牙科钻头组（每组n=30例手术，单尾z检验）。误差线表示标准差。
<img alt="荧光显微镜图像，红色荧光下观察到的细胞结构，比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 多光子成像 体内 通过使用PHASOR技术减薄的颅窗 (A使用红色钙指示剂 JRGECO1a 观察到的小鼠运动皮层第4层锥体神经元中的钙瞬变 体内比例尺 = 100 µm. (B同一窗口但位于第四层运动皮层的不同区域。使用PHASOR制备了3 mm窗口的头部固定小鼠。比例尺 = 30 µm使用多光子显微镜成像，40倍物镜，激发波长1040 nm。

压电手术在人类颌面及牙科手术中已取得显著进展。我们已建立了一套优化小鼠颅窗手术的压电手术操作方案。

Piezo高精度骨组织切除术（PHASOR）：一种改进小鼠颅窗手术的技术

多光子显微镜已广泛应用于活体神经元成像。重复成像需要植入颅窗或反复...

该手术操作的总体目标是在不损伤下方组织的前提下磨薄颅骨，并植入适合成像的颅窗。该方法是对传统颅窗手术的改进，可能使更多外科医生能够开展此项技术。该技术的主要优势在于能够缩短手术时间，并降低平均并发症发生率。手术开始前，确保所有将使用的器械均已经过高压灭菌，以保证无菌状态。使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并在其眼睛上涂抹兽用眼用润滑剂，以防角膜干燥。然后，捏住后肢脚趾以确认麻醉深度是否合适。接着，使用脱毛膏处理头皮区域，持续三分钟以去除毛发。随后，将麻醉后的小鼠置于设定为38摄氏度的加热垫或校准的循环水毯上，并固定于立体定位仪中。确保麻醉面罩正确放置。皮下注射布托啡诺以提供术前镇痛。然后，使用棉签交替涂抹氯己定或聚维酮碘溶液与70%乙醇三次，对头皮进行消毒。最后，在头皮下注射100微升用生理盐水稀释50%的布比卡因，以提供局部麻醉。将直径4毫米的无菌圆形刀头安装至压电手术仪的手柄上。较大的刀头尺寸有助于提高手术速度，因为可同时对整个骨窗区域进行减薄。将压电手术仪设置为最低振动档位，因为较高档位可能因振动过强而损伤血管。用10毫升注射器抽取冰冻的ACSF，并用未持握压电手柄的手握住。轻轻将振动的手术头以轻微的环形动作接触颅骨，将骨层磨薄至所需深度，以完成薄颅骨制备。通过注射器以每分钟1毫升的速率将ACSF滴加到颅骨上，以防止高频振动导致颅骨过热。在对颅骨施加压力以使其均匀变薄时，轻轻调整手柄的角度并变换尖端的方向。注意避免某一部位过度变薄。确保轻柔地调整手柄角度，以均匀磨薄颅骨。定期检查颅骨，避免去除过多骨质而损伤下方组织。将一块1毫米大小、浸有冷人工脑脊液（ACSF）的止血胶原海绵置于暴露的硬脑膜上。让其在硬脑膜上停留约30秒，以防止出现微出血。将一个直径四毫米的玻璃盖玻片横向置于减薄的颅窗上后，用小型塑料或木质棉签的尾端蘸取约一滴氰基丙烯酸酯胶水，涂抹于颅窗的角落。再用镊子尖端确保盖玻片与颅骨之间形成密封。最后，向颅骨添加100微升牙科丙烯酸树脂，以固定窗口。在牙科丙烯酸树脂仍处于柔软状态时，使用折断的木质棉签尖端将遮挡成像窗口的丙烯酸树脂轻轻推离。操作完成后，将小鼠从手术装置中取出，并置于加热的饲养笼中恢复。持续监测，直至小鼠恢复完全意识，以正常活动、步态和行为为评估标准。术后3天内每天两次评估动物术后疼痛表现，包括活动减少、理毛行为减少、摄食和饮水减少、保护性行为或攻击性增强。根据本机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案，术后8至12小时皮下注射布托啡诺作为镇痛剂，连续给药3天。监测窗区是否有裂开、炎症及感染迹象。使用红色钙指示剂jRGECO1a观察到的钙瞬变，通过PHASOR制备的3毫米窗，在固定头部的小鼠运动皮层第四层纯中间神经元中成像。该图像通过同一窗口获取，但显示的是运动皮层第四层的不同区域。如图所示，PHASOR 手术的单次手术时间显著低于牙科钻手术，差异具有统计学意义（双尾 T 检验，P < 0.05）。根据单尾 Z 检验评估，PHASOR 手术的成功率（定义为无出血或硬脑膜可见损伤）高于牙科钻手术。一旦掌握该技术，若操作得当，可在 10 分钟内完成手术。通过此操作步骤，可采用多种活体成像方法（包括双光子成像）对活体神经元进行可视化观察。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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