CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究

该实验程序的总体目标是在详细方法中概述一种基本方法，以可靠和稳健的方式测量目标位点的遗传异质性。该方法可以帮助回答基因编辑领域的关键问题，例如，如何分析和测量现场诱变。该技术的主要优点是，它是一种使用单链寡核苷酸进行同源定向修复或基因校正的标准化方法。

首先，在 25 毫升先前制备的培养基中培养 HTT11619 细胞，以便在 T-175 培养瓶中培养 HTT116 细胞。吸出培养基，用不含钙和镁的 dulbecco 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤细胞，然后吸出 PBS。接下来，使用 5 毫升移液管将胰蛋白酶逐滴添加到 T-175 培养瓶中。

让细胞在培养箱中分离。轻敲培养瓶以去除细胞，然后在培养瓶的整个表面上用 8 mL 完全培养基淬灭细胞。然后上下移液多次将混合物移液以打碎细胞团块，并将细胞转移到 15 毫升锥形管中。

在离心细胞之前，从 15 毫升锥形管中取出 10 微升，将其与 10 微升台盼蓝混合以计数细胞，然后沉淀细胞。将 10 微升与台盼蓝混合的细胞转移到血细胞计数器中，并计数外部的四个网格。对于每个 10 厘米的待同步细胞板，加入 5 毫升完全培养基和 6 微摩尔的蚜虫素。

接下来，将 100 微升重悬的细胞沉淀转移到每个厘米板中，并轻轻旋转板以混合。孵育板以同步 G1S 边界的细胞。靶向前 4 小时，吸出培养基，用 PBS 洗涤。

吸出 PBS 并加入 5 毫升完全培养基。将板放回培养箱中 4 小时。将突变型 EGFP 基因序列输入到 Zane Labs 在线生成器中，然后选择与目标位点附近结合的 CRISPR 向导序列。

将等摩尔浓度的 RNA 混合至 45 微摩尔。将 6.75 微升 200 微摩尔的 CR RNA 储备液和 6.75 微升的 200 微摩尔示踪剂 RNA 储备液添加到 1.5 毫升离心管中。然后，加入 16.50 微升 IDT 缓冲液，使最终体积为 30 微升。

接下来，在 PCR 机器中将混合物在 95 摄氏度下加热 5 分钟。让样品冷却至室温。对于每个样品，将 2.22 μL CR RNA 稀释至示踪 RNA 复合物，将 2.78 μL IDT 缓冲液稀释至最终体积为 5 μL。

将 60 微摩尔原液中的 1.67 微升 Cas9 蛋白稀释在 3.33 微升低血清培养基中，最终体积为 5 微升。将 5 μL Cas9 蛋白与 5 μL 复合 RNA 混合。吸出培养基，用 5 毫升 PBS 洗涤。

吸出 PBS，并向每个 10 厘米板中加入 1 毫升预热的胰蛋白酶。将板放入培养箱中。接下来，点击 10 厘米板以确保所有细胞都脱落，然后用 4 毫升完全培养基将其分散在板的整个表面，使其淬灭。

上下移液多次以打碎细胞团块，并将细胞转移到 15 mL 锥形管中。从 15 毫升锥形管中留出 10 微升，将其与 10 微升台盼蓝混合以计数细胞。在室温下以 125 x G 离心 5 分钟，使细胞沉淀。

吸出培养基并用 5 ml PBS 洗涤。在室温下旋转 125 x G 5 分钟，使细胞去皮。将 100 μL 细胞悬液转移到每个电穿孔 4 毫米间隙比色皿中。

将 10 μL RNP 复合物添加到 100 μL 细胞中，以 5 x 10 的比例添加到第五个细胞密度中。向每个样品中加入两个微摩尔 ODN。接下来，将架子带到电穿孔机上。

轻轻轻弹每个样品并将它们放入腔室中。将样品架放回通风橱中，将每个样品转移到一个含有 2 mL 完全培养基的孔中，该孔板是 6 孔板。在检查校正水平之前孵育板。

吸出培养基并用 2 毫升 PBS 洗涤细胞。用 500 微升预热的胰蛋白酶替换 PBS 到六孔板的每个孔中。将板放入培养箱中。

接下来，轻敲板以确保所有细胞都脱落，然后用 1 毫升完全培养基将其分散在孔的整个表面进行淬灭。将细胞放入 1.5 mL离心管中并沉淀。沉淀细胞后，吸出培养基，然后将细胞沉淀重悬于 500 微升 FACS 缓冲液中。

5 x 10 的浓度将同步和释放的 HTT11619 细胞电穿孔至每 100 微升的第五个细胞，RNP 复合物为 100 皮摩尔，72 NTODN 的 100 皮摩尔为 2.0 微摩尔。将细胞转移至六孔板中，让其恢复 72 小时。接下来，使用带有 488 纳米激光器的 fac 分选器将细胞单独分选到 96 孔板中，用于 EGFP 加减。

从有生长的孔中，使用市售的 DNA 分离试剂盒分离细胞 gDNA。通过 PCR 扩增靶标碱基周围的区域。最后，对样品进行 DNA 测序分析。

孵育流式细胞术分析 72 小时后，确认绿色荧光蛋白的功能修复。随着 RNP 和 72NT 的协调水平增加，观察到逐渐的剂量反应。当在单药基因编辑反应中使用浓度高出 10 倍的 72NT 寡核苷酸时，在没有 RNP 颗粒的情况下进行的基因编辑反应校正了大约 1% 的靶细胞。

选择 EGFP 阳性样本的 16 个克隆，并通过 DNA 测序仪分析靶位点周围的遗传完整性。所有 16 个 EGFP 阳性细胞在靶位点都包含预测的核苷酸交换。分析了 15 个非绿色克隆分离株在靶位点的异质性。

在大约一半的样本中未观察到 DNA 碱基交换。检查的克隆扩增的其余部分显示出缺失突变的异质群体。缺失大小从 1 个碱基到 19 个碱基不等。

CRISPR、Cas9 和单链寡核苷酸供体 DNA 分子协同工作可导致 EGFP 基因中点突变的精确修复，如这种修复点突变的新模型所示，这是一种分子途径，其中供体 DNA 访问复制模板以修复突变碱基。我们称之为 ExACT 的流程。开发后，这项技术为基因编辑领域的研究人员铺平了道路，以探索由于细胞系中基因编辑活性而导致的靶位点的异质性程度。