一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

本实验流程的总体目标是概述一种基础性方法，以详细、可靠且稳健的方式检测靶位点的遗传异质性。该方法有助于回答基因编辑领域中的关键问题，例如，如何分析和量化现场诱变。该技术的主要优势在于，它是一种利用单链寡核苷酸进行同源定向修复或基因校正的标准方法。

开始实验方案时，在T-175培养瓶中加入25毫升预先配制好的HTT116细胞培养基，培养HTT11619细胞。吸除培养基，用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后吸除PBS。接着，使用5毫升移液器将胰蛋白酶逐滴加入T-175培养瓶中。

将细胞置于培养箱中使其脱落。轻敲培养瓶使细胞脱离，然后在培养瓶整个表面加入8毫升完全培养基以终止消化。随后用移液器将混合液反复吹打数次，以分散细胞团块，并将细胞转移至15毫升锥形离心管中。

在离心细胞之前，从15毫升锥形管中取出10微升，与10微升台盼蓝混合用于细胞计数，然后离心收集细胞。取10微升与台盼蓝混合的细胞悬液加入血细胞计数板，计数四周的四个方格。每同步化一个10厘米培养皿的细胞，加入5毫升完全培养基和6微摩尔的蚜虫霉素（aphidicolin）。

接下来，将重悬的细胞沉淀液各取 100 µL 转移至每厘米培养皿中，轻轻摇晃培养皿以混匀。培养培养皿以使细胞在 G1/S 边界同步化。在靶向处理前 4 小时，吸除培养基，用 PBS 洗涤。

吸去 PBS，加入五毫升完全培养基。将培养板放回培养箱中孵育四小时。将突变型 EGFP 基因序列输入 Zane Labs 在线生成器，选择与目标位点附近紧密结合的 CRISPR 引导序列。

将RNA混合至等摩尔浓度，达到45微摩尔。取6.75微升浓度为200微摩尔的CR RNA原液和6.75微升浓度为200微摩尔的示踪RNA原液，加入至一个1.5毫升离心管中。然后加入16.50微升IDT缓冲液，使终体积为30微升。

接下来，在PCR仪中将混合物于95摄氏度加热五分钟。让样品冷却至室温。对于每个样品，将2.22微升的CR RNA稀释至示踪RNA复合物中，并加入2.78微升IDT缓冲液，最终体积为5微升。

取1.67微升60微摩尔的Cas9蛋白原液，加入3.33微升低血清培养基，终体积为5微升。将5微升Cas9蛋白与5微升复合RNA混合。吸除培养基，用5毫升PBS洗涤。

吸去 PBS，向每个 10 厘米培养皿中加入 1 毫升预热的胰蛋白酶。将培养皿放入培养箱中。随后轻拍 10 厘米培养皿，确保所有细胞均已脱落，然后在培养皿整个表面加入 4 毫升完全培养基以终止消化反应。

反复吹打数次以分散细胞团块，并将细胞转移至15毫升锥形管中。从15毫升锥形管中留取10微升，与10微升台盼蓝混合，用于细胞计数。在室温下以125 × g离心5分钟，使细胞沉淀。

吸弃培养基，并用五毫升 PBS 洗涤。在室温下以 125 × g 离心五分钟，沉淀细胞。将 100 微升细胞悬液转移至每个电穿孔用 4 毫米间隙比色皿中。

将10微升RNP复合物加入到100微升细胞中，细胞密度为5 × 10⁵。向每个样品中加入2微摩尔的ODN。接着，将样品架放入电穿孔仪中。

轻轻弹击每个样品，将其放入孵育 chamber 中。将样品架放回生物安全柜，将每个样品转移至六孔板的孔中，每孔含有 2 毫升完全培养基。孵育后检测校正水平。

吸弃培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞。向六孔板的每个孔中加入 500 微升预热的胰蛋白酶。将培养板放入培养箱中。

接下来，轻敲培养板以确保所有细胞均已脱落，然后通过将一毫升完全培养基均匀分散至孔的整个表面来终止反应。将细胞转移至1.5毫升离心管中并离心成团。细胞离心成团后，吸除上清液，再用500微升FACS缓冲液重悬细胞沉淀。

将同步并释放的 HTT11619 细胞以每 100 微升 5 × 10⁵ 个细胞的浓度进行电穿孔，加入 100 皮摩尔的 RNP 复合物以及 100 皮摩尔浓度为 2.0 微摩尔的 72 NTODN。将细胞转移至六孔板中，使其恢复 72 小时。随后，使用配备 488 纳米激光器的流式分选仪对细胞进行单细胞分选，根据 EGFP 阳性或阴性分别收集至 96 孔板中。

从有生长的孔中，使用 commercially available DNA 提取试剂盒分离细胞基因组 DNA。通过 PCR 扩增目标碱基周围的区域。最后，对样本进行 DNA 测序分析。

孵育72小时后通过流式细胞术分析，确认绿色荧光蛋白的功能性修复。随着RNP与72NT浓度的协调增加，观察到逐渐增强的剂量反应。在缺乏RNP颗粒的情况下进行基因编辑反应时，当单试剂基因编辑反应中72NT寡核苷酸的浓度提高10倍时，约有1%的靶向细胞得到校正。

选取了16个EGFP阳性样本的克隆，并通过DNA测序仪分析其靶位点周围的遗传完整性。所有16个EGFP阳性细胞均在靶位点处含有预期的核苷酸替换。同时对15个非绿色克隆分离株在靶位点的异质性进行了分析。

在大约一半的样本中未观察到DNA碱基交换。其余被检测的克隆扩增则显示出由缺失突变组成的异质性群体，缺失片段的大小从一个碱基到19个碱基不等。

CRISPR、Cas9 与单链寡核苷酸供体 DNA 分子协同作用，可实现对 EGFP 基因中点突变的精确修复，如本研究中所展示的一种新的点突变修复分子通路模型所示。在此通路中，供体 DNA 可作为修复突变碱基的复制模板，我们将其称为 ExACT。该技术建立后，为基因编辑领域的研究人员探索细胞系中基因编辑活性所致靶位点异质性的程度奠定了基础。