Name: CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 了解CRISPR/Cas9与单链寡核苷酸在人细胞中修复点突变的标准化方法。该技术通过电穿孔递送RNP复合物，实现基因校正并分析靶位点遗传异质性，为基因治疗研究提供可靠框架。

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作者没有致谢。

以下实验方案涉及哺乳动物细胞的操作；要求操作者熟悉无菌技术及细胞培养方法。
1. 细胞系及培养条件
<ol>
	<li>配制 500 mL HCT 116 细胞培养用培养基：在 McCoy's 5A 改良培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素（此为完全培养基）。 
	注意：在接种前，需先在 T-75 或 T-175 培养瓶中培养 HCT 116-19 细胞。当细胞融合度达到 90% 时，每个 T-75 培养瓶可获得约 8.4 × 106 个细胞，相当于五个 10 cm 培养皿的量；每个 T-175 培养瓶可获得约 18.4 × 106 个细胞，相当于十五个 10 cm 培养皿的量。</li>
</ol>
2. 从培养瓶中收获细胞
<ol>
	<li>吸弃培养基，用不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤（T-75 培养瓶用 10 mL，T-175 培养瓶用 25 mL），然后吸弃。</li>
	<li>使用 2 mL 移液器将胰蛋白酶逐滴加入培养瓶中（T-175 培养瓶加 2 mL，T-75 培养瓶加 1 mL）。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 5 分钟，使细胞脱落。</li>
	<li>轻敲培养瓶，确保所有细胞均已脱落，然后通过将完全培养基分散至整个培养瓶表面来终止消化（T-175 培养瓶加 8 mL，T-75 培养瓶加 4 mL）。</li>
	<li>反复吹打数次以分散细胞团块，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>离心前，从 15 mL 圆锥形离心管中取出 10 µL 细胞悬液，与 10 µL 台盼蓝混合进行细胞计数。在 125 × g、16 °C 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
</ol>
3. 细胞计数
<ol>
	<li>取 10 µL 与台盼蓝混合的细胞悬液加入血细胞计数板中。计数四周的 4 个方格（每个方格包含 16 个小方格）。
	<ol>
		<li>分别计算每组十六个角落小方格中的平均细胞数。</li>
		<li>乘以 10,000（104）。</li>
		<li>乘以用于收集细胞的培养基总体积，以校正因加入台盼蓝造成的稀释效应。 
		注：重悬细胞所需体积的计算公式如下： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56195/56195eq1.jpg" /> 
		<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/56195/56195eq2.jpg" /></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞接种
<ol>
	<li>对于每块需要同步化的10 cm培养皿中的细胞，加入5 mL完全培养基和6 µM的蚜虫菌素（将12 µL浓度为2.5 mM的母液溶于200-proof乙醇中）。</li>
	<li>将100 µL重悬的细胞沉淀（含2.5 × 106 个细胞）转移至每个10 cm培养皿中，轻轻摇晃混匀。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育16–24小时，使细胞在G1/S期边界同步化。</li>
</ol>
5. 从阿非迪霉素同步化中释放细胞
<ol>
	<li>靶向处理前 4 小时，吸去培养基，用 PBS 洗涤，吸去 PBS，加入 5 mL 完全培养基</li>
	<li>将培养物放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 4 小时</li>
</ol>
6. RNA 复合物形成
<ol>
	<li>将突变型 eGFP 基因序列输入张锋实验室的在线设计工具25（http:// crispr.mit.edu/），选择靠近目标位点的 CRISPR 引导序列，并从商业来源获取 CRISPR 引导序列。</li>
	<li>将 CRISPR RNA（crRNA）、反式激活 crRNA（tracrRNA）和 Cas9 蛋白在 20 °C 下保存，并按照制造商建议使用。
	<ol>
		<li>将 RNA 按等摩尔浓度混合至 45 µM。取 6.75 µL 的 200 µM crRNA 原液和 6.75 µL 的 200 µM tracrRNA 原液，加入一个 1.5 mL 离心管中，再加入 16.50 µL TE 缓冲液，最终体积为 30 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加热块或 PCR 仪中于 95 °C 加热 5 分钟。 
	注意：高温！</li>
	<li>让其自然冷却至室温。 
	注：若使用 PCR 仪，请将冷却速率设置为 0.2 °C/s。</li>
	<li>对每个样本执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将 2.22 µL 的 crRNA:tracrRNA 复合物加入 2.78 µL TE 缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0 和 0.1 mM EDTA，pH 8.0）中稀释，最终体积为 5 µL。</li>
		<li>取 1.67 µL 的 60 µM Cas9 蛋白原液，加入 3.33 µL 低血清培养基中稀释，最终体积为 5 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 5 µL Cas9 蛋白与 5 µL 复合 RNA 混合</li>
</ol>
7. 收集细胞用于靶向
<ol>
	<li>吸弃培养基，用 5 mL PBS 洗涤，吸弃 PBS，每 10-cm 培养皿中加入 1 mL 预热的胰蛋白酶。将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>轻敲 10-cm 培养皿，确保所有细胞脱落，然后加入 4 mL 完全培养基，均匀覆盖培养皿表面以终止消化。</li>
	<li>用移液器反复吹打数次以分散细胞团块，将细胞悬液转移至 15-mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>离心前，从 15-mL 圆锥形离心管中取出 10 µL 细胞悬液，与 10 µL 台盼蓝混合进行细胞计数。在室温下以 125 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>吸弃上清液，加入 5 mL PBS 洗涤。在室温下以 125 × g 离心 5 分钟，重新收集细胞沉淀。</li>
</ol>
8. 细胞计数
<ol>
	<li>取10 µL与台盼蓝混合的细胞悬液加入血细胞计数板，计数四周的4个方格（每个方格包含16个小方格）。
	<ol>
		<li>分别计算每组十六个小角方格内的平均细胞数。</li>
		<li>乘以10,000（104）。</li>
		<li>乘以收获细胞时所用培养基的总体积，以校正因加入台盼蓝造成的稀释倍数。 
		注意：以下为计算重悬细胞所需体积的公式格式。用无血清的McCoy's 5A改良培养基重悬所需数量的细胞。 
		<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56195/56195eq3.jpg" /> 
		<img alt="公式 4" src="/files/ftp_upload/56195/56195eq4.jpg" /></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 样品靶向
<ol>
	<li>从步骤 8.1 中取 100 µL 细胞悬液（5 × 105 个细胞）加入每个 4 mm 间隙的电穿孔比色杯中。将步骤 6.7 中制备的 10 µL RNP 复合物加入 100 µL 细胞悬液（细胞密度为 5 × 105）中。向每个样品中加入 ODN（2 µM）。 
	注意：作为阳性对照，加入 1 µL 浓度为 1 µg/µL 的 eGFP 表达质粒
	<ol>
		<li>将比色杯架移至电穿孔仪，轻轻弹击每个样品混匀，然后将其放入电穿孔腔室。设置参数为 250 V，低压；2 次脉冲，间隔 1 s，脉冲时长 13 ms，单向脉冲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将比色杯架移回生物安全柜。将每个样品转移至 6 孔板中含 2 mL 完全培养基的孔内。于 37 °C、5% CO2 条件下培养 72 小时，之后检测基因校正水平。</li>
</ol>
10. 基因编辑细胞分析与转染效率评估
<ol>
	<li>吸去培养基，用 2 mL PBS 洗涤细胞。吸去 PBS，向 6 孔板的每个孔中加入 500 µL 预热的胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>轻敲培养板，确保所有细胞均已脱落，然后加入 1 mL 完全培养基，均匀覆盖孔的整个表面以终止消化反应。</li>
	<li>将细胞转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>吸去上清液。用 500 µL FACS 缓冲液（含 0.5% BSA、2 mM EDTA 和 2 µg/mL 碘化丙啶的 PBS 溶液）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>通过流式细胞术检测细胞荧光（eGFP+）。
	<ol>
		<li>根据 Rivera Torres et al30 的方法，计算校正效率：即每个样本中活的 eGFP 阳性细胞占总活细胞数的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. DNA序列分析
<ol>
	<li>将同步化并释放的 HCT 116-19 细胞以 5 × 105 个细胞/100 µL 的浓度进行电穿孔，加入 100 pmol 的 RNP 复合物和 2.0 µM 的 72NT ODN。</li>
	<li>将细胞转移至 6 孔板中，使其恢复 72 小时。</li>
	<li>使用流式细胞分选仪（FACS）对细胞进行单细胞分选至 96 孔板，采用 488 nm（100 mW）激光检测 eGFP+/- 信号，具体操作如 Rivera-Torres et al30 所述。 
	注意：并非所有孔都能成功长出细胞。</li>
	<li>将细胞扩增培养 6 周，随后按照步骤 7 所述方法收获细胞。</li>
	<li>从有细胞生长的孔中，使用市售的 DNA 提取试剂盒（见材料表）提取细胞基因组 DNA，并通过 PCR 扩增目标碱基周围的区域（718 bp；上游引物 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'，下游引物 5'-ACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'）。</li>
	<li>对样本进行 DNA 测序分析。</li>
</ol>

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<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAS9+transcriptional+activators+for+target+specificity+screening+and+paired+nickases+for+cooperative+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基因编辑已成为一门主流科学学科，这主要得益于CRISPR/Cas9系统的出现。这一非凡的通路原本在细菌细胞中介导适应性免疫，现已被改造为一种分子工具，可用于人类染色体的基因组改造。CRISPR/Cas9的天然功能是通过引入双链DNA断裂导致DNA片段化，从而失活病毒DNA30,31。该作用可破坏入侵的外源DNA，产生原核生物免疫，抑制相同病毒颗粒的再次感染。令人惊叹的是，该系统具有记忆功能，能够重新激活由先前感染事件产生的特异性CRISPR向导RNA（gRNA）。
CRISPR/Cas9介导的基因敲除具有高效性和高准确性，已在多种真核生物遗传系统中得到应用，其目标是使功能基因失活32,33。该过程最基本的形式包含两个关键步骤：第一步是产生双链断裂，第二步则依赖细胞固有的非同源末端连接（NHEJ）机制完成基因敲除。在大多数情况下，双链断裂会产生平末端的、分离的染色体片段，参与NHEJ的酶类会识别染色体断裂位点并连接断裂的末端。此过程有时会导致断裂位点处个别核苷酸的丢失。即使少数几个碱基的缺失也可能引起移码突变，从而使基因的功能性表达终止。利用CRISPR/Cas9激活NHEJ自然修复过程来实现基因敲除，已彻底改变了真核生物遗传学研究的格局；靶位点处DNA的缺失既是可预测的，也是预期之中的。
与基因敲除不同，许多研究人员致力于尝试将CRISPR/Cas9的活性重新导向并用于同源定向修复过程，其研究目标是实现基因校正。在该策略中，CRISPR/Cas9与供体DNA模板联合使用，后者提供遗传信息，用于修复先天性错误或在健康基因中插入突变。早期研究报告强调了CRISPR/Cas9催化同源定向修复的显著能力，这些报告（直接或间接地）指出该过程以高度精确的方式进行24,34。本实验室一直致力于研究利用单链寡核苷酸进行同源定向修复或基因校正，以期阐明其背后的分子机制与调控网络15,17,18,23。我们主要关注基因编辑中的单点突变，因为这是目前已知导致多种遗传性疾病最基本的基因突变类型。基于对基因编辑的基本认识，我们开始质疑CRISPR/Cas9在这些反应中的精确性，因为CRISPR/Cas9在基因敲除中的功能会导致插入或缺失突变（indels）的产生。我们采用一个定义明确的模型系统，而非一个不可筛选但具有临床相关性的基因，以严格的还原论方式研究原位诱变。通过使用一个简单的靶基因，其基因校正效果可在基因型和表型两个层面进行检测，我们推断靶位点上发生的异质性能够被可靠且稳健地识别出来。
我们的数据证实，已建立的基因编辑系统（包含整合到 HCT116 细胞中的突变型 eGFP 基因）可为遗传损伤的产生及原位诱变过程提供基础信息。CRISPR/Cas9 与单链寡核苷酸供体 DNA 分子协同作用，能够实现 eGFP 基因中点突变的精确修复。我们提出了一种新的点突变修复模型，即供体 DNA 作为修复突变碱基的复制模板的分子通路，我们将该过程命名为 ExACT30。在未表现出校正表型的靶向细胞群体中，观察到多种细胞，其靶位点周围存在异质性且长度各异的 DNA 插入缺失突变（indels）。在从未校正群体中分离出的大约一半克隆中，靶位点发生了缺失突变。由于此前尚无报道表明单链寡核苷酸作为单一基因编辑工具可在靶位点诱导产生 indels，因此我们推断这些突变是由 CRISPR/Cas9 活性所致。
在本文中，我们提供了一种详细的方法，以便以可靠且稳健的方式测量靶位点的遗传异质性。尽管目前已有大量研究关注脱靶位点突变的分析与定位，但靶位点上产生的异质性突变更可能对基因编辑在临床应用中的成功与否产生重大影响。为了提高哺乳动物细胞中同源定向修复先天遗传缺陷的精确性，可能需要采用其他技术或改良的Cas9蛋白35。其中一些技术包括使用辅助性寡核苷酸作为桥梁，将染色体末端连接在一起，从而避免非同源末端连接（NHEJ）的破坏性作用。明确基因编辑活动所导致的靶位点异质性程度，是任何用于治疗干预的实验方案中必须包含的重要组成部分。

Mandecki（1986年）的开创性研究证明，通过将寡核苷酸转化入细菌，可实现质粒DNA的永久性改变1，而Walder和Walder（1986年）在酵母中开展了类似的研究2。此后不久，Sherman及其同事发表了一系列论文，报道将单链寡核苷酸导入酵母细胞，从而实现基因的可遗传改变3。在微生物细胞研究的奠基性工作基础上，Kmiec及其同事开始开发可引导哺乳动物细胞中单碱基修复的特异性单组分寡核苷酸4。该理念基于生化数据，表明含有RNA的分子比完全由DNA碱基组成的分子能更紧密地结合靶位点。尽管已有大量关于使用嵌合寡核苷酸成功进行基因编辑的报道5,6,7，但不同实验之间以及不同靶点/细胞组合之间的编辑效率仍存在高度变异性。
单链供体DNA优于双链供体DNA，因为其在基因组中随机位点整合的可能性较低8。然而，外源引入的单链寡核苷酸容易被细胞核酸酶迅速降解。已有多种策略用于保护寡核苷酸末端免受降解。含有目标序列的、具有外切核酸酶保护的单链DNA足以实现0.1%-1%范围内的编辑效率6。改进且更稳定的转染技术，结合表型检测方法，使得多个研究团队能够获得更一致的基因编辑效果8,9,10,11,12,13。
在过去10年中，研究人员已投入大量努力，以提高靶细胞对基因编辑的敏感性。其中一种策略是调控细胞周期14,15,16。在常规反应条件下，将单链寡核苷酸（ssODNs）导入培养的哺乳动物细胞时，基因编辑频率通常在0.1%至1%之间；而当寡核苷酸在细胞进入S期时导入，基因编辑频率则可提高3至5倍。在另一系列实验中，Brachman和Kmiec（2005）证明，在加入寡核苷酸前，将2'3'双脱氧胞苷（ddC）与细胞共孵育24小时，可获得相对较高的精确基因编辑水平（3-5%）17。ddC可减缓DNA复制叉的移动速度，表明ssODNs在复制中的细胞内进行基因编辑可能涉及将寡核苷酸整合到活跃复制区域的过程11,18。综合来看，这些研究提出了一个概念：无论是否存在双链断裂，供体DNA都可能作为基因编辑真实作用机制的一部分，被整合到正在延伸的复制叉中19。因此，染色体上点突变的修复或DNA片段的替换是通过DNA配对和单链整合途径实现的。
利用小分子试剂在生长中的细胞内诱导随机的双链DNA断裂，可造成DNA复制事件停滞的环境，因为细胞会试图修复这些损伤20,21复制叉的这种短暂减缓，有助于单链编辑寡核苷酸更有效地穿透染色质结构，从而提高靶标位点的可及性15由VP16、博来霉素或喜树碱等药物诱导产生双链DNA断裂22,23，已显示出可将近10倍地提高基因编辑水平，达到6-8%。然而，在治疗应用中，随机的双链DNA断裂是不可取的。
利用可编程核酸酶和寡核苷酸进行基因编辑在细胞分裂过程中也会被促进24,25。当使用基于核酸的递送方法在同步化的HCT 116细胞中进行同源定向修复时，Rivera-Torres及其同事证明，当转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）与单链寡核苷酸共同引入正在复制的细胞群体时，靶向活性同样得到提高26,27。最近，Bialk及其同事表明，在细胞群体通过S期时，使用单链寡核苷酸和一系列成簇规律间隔短回文重复序列Cas9（CRISPR/Cas9）分子修复单碱基突变的效率更高28。CRISPR分子由RNA组成，其功能是识别靶DNA序列中指定切割的区域。Cas9是一种细菌酶，其功能是在核酸水解反应中切割双链DNA。因此，CRISPR将复合物定位到基因组靶位点，而Cas9核酸酶则执行双链断裂。Lin et al.（2014）也证明了细胞周期对于实现高频基因编辑的重要性，他们在原代新生成纤维细胞、人类胚胎干细胞及其他细胞系中使用了改良的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物介导的递送系统24。因此，单因子基因编辑中建立的基因编辑与细胞周期进程之间的关系，同样适用于利用可编程核酸酶和供体DNA模板的组合式基因编辑。尽管组合式基因编辑方法已将多种不同组分与供体DNA模板结合使用，但该领域大多数研究人员仍采用CRISPR/Cas9来实现双链断裂功能。这一选择基于该特定遗传工具的易用性及其在失活基因功能或向特定位点插入外源DNA片段方面的灵活性。相较于基因替换，基因敲除在技术上更为简便，因为基因替换需要将&#34;正确&#34;或正常的基因拷贝精确地整合到致病位点。目前已有不少研究人员正在识别并研究特定药物和试剂的应用，以实现突变碱基的校正，并在正确位置以较高频率插入正常遗传序列29。
最近，Rivera-Torres 等30 采用组合式基因编辑方法，利用特异性设计的 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂活性以及单链寡核苷酸供体 DNA 模板提供的遗传信息，修复了整合在 HCT116 细胞中的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因单拷贝中的点突变。作者利用这一特征明确的模型细胞系，评估了靶位点周围切割的特异性。数据显示，靶位点存在异质性，尤其是在未包含校正点突变的细胞中更为明显。在本文中，我们详细阐述并重点介绍这些研究人员用于检测 CRISPR/Cas9 基因编辑所导致的靶位点突变异质性的方法学。

<table><tbody><tr><td>McCoy&amp;rsquo;5A 改良培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>ATCC</td><td>30-2214</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td>无钙或镁</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA溶液</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷 1mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC611970010</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR crRNA，10 nmol</td><td>IDT</td><td></td><td>无目录编号，因其根据您的特定基因靶点定制。</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 tracrRNA，20 nmol</td><td>IDT</td><td>1072533</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 核酸酶 3NLS，500 &amp;micro;g</td><td>IDT</td><td>1074182</td><td></td></tr><tr><td>IDTE缓冲液</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Zeus 电穿孔比色皿 0.4 厘米</td><td>VWR</td><td>10497-474</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔系统</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&lt;br/&gt; 冻干粉末，结晶状 &amp;ge;98.0%（GE）</td><td>Sigma</td><td>05470-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M），pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶 - 1.0 mg/mL 水溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒 (250)</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td></td></tr><tr><td>6孔标准型多孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）（带架）</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31985062</td><td></td></tr></tbody></table>

一种检测人细胞中crispr/cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

利用CRISPR/Cas9和单链寡核苷酸进行组合基因编辑是纠正单碱基点突变的有效策略，这类突变通常是多种人类遗传性疾病的根本原因。通过使用一种成熟的基于细胞的模型系统，已成功修复整合在HCT116细胞中的单拷贝突变型eGFP基因的点突变。对已修复和未修复细胞的分析揭示了基因编辑的精确性，同时也揭示了在未修复细胞中，靶位点周围DNA序列产生插入缺失（indel）所导致的遗传损伤。本文概述了用于分析该组合式点突变基因编辑方法的具体技术流程，以及测量靶位点插入缺失形成的详细实验策略。本实验方案为开展以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑用于人类治疗的研究提供了基础性方法和工作流程。本研究的结论是，在点突变修复过程中，CRISPR/Cas9的活性会导致靶位点处发生原位诱变。本研究建立了一种标准化的方法，用于评估诱变程度，这对于任何旨在实现临床应用的基因编辑策略而言，都是一个关键且重要的考量因素。

我们采用一种模型系统来研究哺乳动物细胞中的基因编辑，该系统依赖于HCT116细胞中单拷贝整合的eGFP基因内嵌入的点突变的修复。需要注意的是，这是一个单拷贝基因，因此可以更简单地观察DNA的改变或诱变过程。图1A展示了突变的eGFP基因序列，其中终止密码子TAG的第三个碱基（靶向碱基）以红色标出。同时示出了一个72个碱基的寡核苷酸（72NT），它部分互补于eGFP基因的非转录链，并设计用于诱导G到C的碱基替换。此外，图1A还展示了指定为2C的CRISPR，其原间隔序列以5'至3'方向标示。为了进行该基因编辑反应，我们使用了由CRISPR（cr）RNA和tracr（tr）RNA与纯化的Cas9蛋白结合组成的核糖核蛋白复合物（RNP）（图1B），而不是使用包含Cas9基因和相应特异性引导RNA序列的哺乳动物表达载体。
当将特异性设计的RNP颗粒与单链寡核苷酸通过电穿孔导入HCT116细胞后，经72小时孵育，使用流式细胞仪可观察到基因编辑效果，表现为eGFP中单碱基突变的修复。功能性的修复表现为靶向细胞中出现绿色荧光，这些细胞也可因该荧光信号而通过分选从整个细胞群体中分离出来。如图2所示，随着RNP和72NT的浓度协同增加，可观察到逐渐增强的剂量反应。图中所示的分子比例、RNP的皮摩尔量以及72NT的微摩尔浓度，均基于在依赖转染表达载体导入Cas9和特异性向导RNA的基因编辑反应中所使用的最佳剂量。在图2的插图中显示了在无RNP颗粒存在条件下进行的基因编辑反应。在此情况下，当单试剂基因编辑反应中使用高10倍浓度的72NT寡核苷酸时，约有1%的靶向细胞得到校正。
为了确定靶向位点是否存在遗传异质性——即所谓的“原位诱变效应”——我们决定检测单个细胞中基因编辑活动的结果。尽管相比分析整体细胞群体更为耗时，但通过对克隆扩增的单个细胞进行基因组分析，才能真实反映遗传印记或突变情况。我们重复了图2中所述的实验，但此次仅使用100 pmol的RNP复合物和2.0 µmol的72NT寡核苷酸。与前述实验相同，HCT 116细胞先用aphidicolin同步处理24小时，使其停滞于G1/S期边界。4小时后释放细胞，并通过电穿孔导入基因编辑工具。72小时后，使用FACS对细胞进行分析，并将单个细胞分选至96孔板中（实验流程见图3）。通过流式细胞术将显示绿色荧光的细胞分选至96孔板的各个孔中，用于克隆扩增。重要的是，不表达eGFP的细胞也以类似方式被分离并分选至相同培养条件下进行扩增。
培养14天后，大多数单个克隆已充分扩增，足以进行DNA提取。因此，选取了16个eGFP阳性样本的克隆，通过DNA测序分析靶位点周围区域的遗传完整性。利用Sanger测序法获得群体中等位基因DNA序列的相关信息，并使用序列可视化软件组装，与野生型等位基因序列进行比对（图4A）。RNP复合物的切割位点由黑色箭头指示，位于绿色条形（2C crRNA）上。如图4A所示，所有16个eGFP阳性细胞均在靶位点处含有预期的核苷酸替换。发生转换的C残基以红色标出，eGFP阳性序列下方提供了反映该精确变化的峰图。类似地，另选取15个非绿色克隆分离株（已充分扩增至可进行DNA提取和测序）分析其靶位点的异质性。正如预期，在约一半的样本中未观察到DNA碱基替换，这体现在靶位点处G残基得以保留，如图4B所示。本实验中其余被检测的克隆扩增群体显示出多种缺失突变的异质性，因而解释了绿色荧光的缺失。缺失片段大小从1个碱基到19个碱基不等。需要注意的是，我们仅检测了15个eGFP阳性细胞样本，尽管我们认为这些结果已较为代表性地反映了CRISPR/Cas9活性所遗留的遗传损伤类型，但仍有可能存在其他类型或形式的插入缺失（indels）于靶向群体中。
综上所述，图4 中显示的结果证实了在 eGFP 靶向系统中的表型读数。G 到 C 核苷酸的转换使得经校正的 HCT116 细胞中出现绿色荧光。在本实验分离的克隆或以往的实验中27,28，均未观察到靶位点周围发生碱基替换。数据还表明，未能通过点突变修复实现基因编辑的细胞仍处于未校正状态，但在某些情况下并非完全未改变，靶位点周围存在一定程度的遗传异质性。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56195/56195fig1.jpg" /> 
图1. (A) 突变型eGFP基因基因编辑的模型系统。 野生型和突变型eGFP基因的相应片段分别以绿色和红色显示，目标密码子位于序列中央。用于替换的核苷酸以粗体并加下划线标出。蓝色高亮的碱基代表2C CRISPR protospacer序列，橙色高亮的碱基代表PAM位点。本实验中使用的寡核苷酸长度为72个碱基，在三个末端位置含有磷硫酰化修饰；该72-mer靶向非转录链（NT链，72NT）。(B) CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物组装反应。 crRNA提供靶向特异性（20个碱基，红色部分），对应于2C protospacer序列，以及与tracrRNA（绿色）结合的相互作用区域（蓝色）。crRNA与tracrRNA以等摩尔浓度退火。加入Cas9蛋白（灰色）完成RNP复合物的组装。向导RNA（gRNA）引导并激活Cas9内切酶，从而切割靶标DNA。图的下部展示了2C种子序列和tracrRNA序列。该图改编自Rivera-Torres, N. et al. (2017)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56195/56195fig2.jpg" /> 
图2. 基因编辑在RNP和ssODN引导下呈剂量依赖性。 同步化并释放的HCT 116-19细胞通过电穿孔转染24–120 pmol的CRISPR/Cas9 RNP和0.6–3.0 µM的72mer。经过72小时的恢复期后，使用流式细胞仪检测基因编辑活性。基因编辑效率以校正效率（%）表示，计算方法为活细胞中eGFP阳性细胞数除以群体中总活细胞数。误差线由三次独立实验产生的三组数据点通过标准误差的基本计算得出。插图：单组分基因编辑。在相同条件下，仅由单链寡核苷酸（72NT）引导、无RNP复合物存在时的基因编辑活性随浓度增加的变化情况。该图改编自Rivera-Torres, N. et al. (2017)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56195/56195fig3.jpg" /> 
图3. 单细胞克隆分离的实验策略。 表达eGFP的细胞被记为阳性，并通过流式细胞仪以单细胞形式分选至各独立孔中，用于克隆扩增。不表达eGFP的细胞也以类似方式分离分选，并在相同条件下进行扩增。随后提取DNA，扩增eGFP基因并进行Sanger测序，以分析靶位点周围的基因编辑活性。本图改编自Rivera-Torres, N. et al. (2017)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56195/56195fig4.jpg" /> 
图4. (A) 作为克隆群体扩增的eGFP阳性细胞的等位基因分析。 对克隆分离并扩增的eGFP阳性样本（共16个克隆）在靶向碱基周围的位点进行分析，分别收获每个样本的DNA，纯化后进行扩增和测序。采用Sanger测序法进行等位基因分析，使用序列可视化软件组装序列，并与图顶部所示的野生型等位基因序列进行比对。RNP复合物的切割位点以绿色条带（2C crRNA）上的小黑箭头表示。(B) 作为克隆群体扩增的eGFP阴性细胞的等位基因分析。 从未经校正群体中获得的15个独立克隆样本被随机选取，并对其靶核苷酸周围位点的插入缺失（indel）形成情况进行分析。与上述方法相同，采用Sanger测序法进行等位基因分析，并使用序列可视化软件进行序列组装。图中再次展示了顶部的野生型等位基因序列以及RNP复合物的切割位点。本图改编自Rivera-Torres, N. et al. (2017)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56195/56195fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

利用CRISPR/Cas9和单链寡核苷酸进行组合基因编辑是校正单碱基点突变的有效策略...

本实验流程的总体目标是概述一种基础性方法，以详细、可靠且稳健的方式检测靶位点的遗传异质性。该方法有助于回答基因编辑领域中的关键问题，例如，如何分析和量化现场诱变。该技术的主要优势在于，它是一种利用单链寡核苷酸进行同源定向修复或基因校正的标准方法。开始实验方案时，在T-175培养瓶中加入25毫升预先配制好的HTT116细胞培养基，培养HTT11619细胞。吸除培养基，用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后吸除PBS。接着，使用5毫升移液器将胰蛋白酶逐滴加入T-175培养瓶中。将细胞置于培养箱中使其脱落。轻敲培养瓶使细胞脱离，然后在培养瓶整个表面加入8毫升完全培养基以终止消化。随后用移液器将混合液反复吹打数次，以分散细胞团块，并将细胞转移至15毫升锥形离心管中。在离心细胞之前，从15毫升锥形管中取出10微升，与10微升台盼蓝混合用于细胞计数，然后离心收集细胞。取10微升与台盼蓝混合的细胞悬液加入血细胞计数板，计数四周的四个方格。每同步化一个10厘米培养皿的细胞，加入5毫升完全培养基和6微摩尔的蚜虫霉素（aphidicolin）。接下来，将重悬的细胞沉淀液各取 100 µL 转移至每厘米培养皿中，轻轻摇晃培养皿以混匀。培养培养皿以使细胞在 G1/S 边界同步化。在靶向处理前 4 小时，吸除培养基，用 PBS 洗涤。吸去 PBS，加入五毫升完全培养基。将培养板放回培养箱中孵育四小时。将突变型 EGFP 基因序列输入 Zane Labs 在线生成器，选择与目标位点附近紧密结合的 CRISPR 引导序列。将RNA混合至等摩尔浓度，达到45微摩尔。取6.75微升浓度为200微摩尔的CR RNA原液和6.75微升浓度为200微摩尔的示踪RNA原液，加入至一个1.5毫升离心管中。然后加入16.50微升IDT缓冲液，使终体积为30微升。接下来，在PCR仪中将混合物于95摄氏度加热五分钟。让样品冷却至室温。对于每个样品，将2.22微升的CR RNA稀释至示踪RNA复合物中，并加入2.78微升IDT缓冲液，最终体积为5微升。取1.67微升60微摩尔的Cas9蛋白原液，加入3.33微升低血清培养基，终体积为5微升。将5微升Cas9蛋白与5微升复合RNA混合。吸除培养基，用5毫升PBS洗涤。吸去 PBS，向每个 10 厘米培养皿中加入 1 毫升预热的胰蛋白酶。将培养皿放入培养箱中。随后轻拍 10 厘米培养皿，确保所有细胞均已脱落，然后在培养皿整个表面加入 4 毫升完全培养基以终止消化反应。反复吹打数次以分散细胞团块，并将细胞转移至15毫升锥形管中。从15毫升锥形管中留取10微升，与10微升台盼蓝混合，用于细胞计数。在室温下以125 × g离心5分钟，使细胞沉淀。吸弃培养基，并用五毫升 PBS 洗涤。在室温下以 125 × g 离心五分钟，沉淀细胞。将 100 微升细胞悬液转移至每个电穿孔用 4 毫米间隙比色皿中。将10微升RNP复合物加入到100微升细胞中，细胞密度为5 × 10⁵。向每个样品中加入2微摩尔的ODN。接着，将样品架放入电穿孔仪中。轻轻弹击每个样品，将其放入孵育 chamber 中。将样品架放回生物安全柜，将每个样品转移至六孔板的孔中，每孔含有 2 毫升完全培养基。孵育后检测校正水平。吸弃培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞。向六孔板的每个孔中加入 500 微升预热的胰蛋白酶。将培养板放入培养箱中。接下来，轻敲培养板以确保所有细胞均已脱落，然后通过将一毫升完全培养基均匀分散至孔的整个表面来终止反应。将细胞转移至1.5毫升离心管中并离心成团。细胞离心成团后，吸除上清液，再用500微升FACS缓冲液重悬细胞沉淀。将同步并释放的 HTT11619 细胞以每 100 微升 5 × 10⁵ 个细胞的浓度进行电穿孔，加入 100 皮摩尔的 RNP 复合物以及 100 皮摩尔浓度为 2.0 微摩尔的 72 NTODN。将细胞转移至六孔板中，使其恢复 72 小时。随后，使用配备 488 纳米激光器的流式分选仪对细胞进行单细胞分选，根据 EGFP 阳性或阴性分别收集至 96 孔板中。从有生长的孔中，使用 commercially available DNA 提取试剂盒分离细胞基因组 DNA。通过 PCR 扩增目标碱基周围的区域。最后，对样本进行 DNA 测序分析。孵育72小时后通过流式细胞术分析，确认绿色荧光蛋白的功能性修复。随着RNP与72NT浓度的协调增加，观察到逐渐增强的剂量反应。在缺乏RNP颗粒的情况下进行基因编辑反应时，当单试剂基因编辑反应中72NT寡核苷酸的浓度提高10倍时，约有1%的靶向细胞得到校正。选取了16个EGFP阳性样本的克隆，并通过DNA测序仪分析其靶位点周围的遗传完整性。所有16个EGFP阳性细胞均在靶位点处含有预期的核苷酸替换。同时对15个非绿色克隆分离株在靶位点的异质性进行了分析。在大约一半的样本中未观察到DNA碱基交换。其余被检测的克隆扩增则显示出由缺失突变组成的异质性群体，缺失片段的大小从一个碱基到19个碱基不等。CRISPR、Cas9 与单链寡核苷酸供体 DNA 分子协同作用，可实现对 EGFP 基因中点突变的精确修复，如本研究中所展示的一种新的点突变修复分子通路模型所示。在此通路中，供体 DNA 可作为修复突变碱基的复制模板，我们将其称为 ExACT。该技术建立后，为基因编辑领域的研究人员探索细胞系中基因编辑活性所致靶位点异质性的程度奠定了基础。

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科研

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Genetics

遗传学

CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。...

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在本视频中，我们展示了在培养细胞中使用一体化 CRISPR-Cas9 系统进行基因组编辑的方法，其中 Cas9 和 sgRNA 以单一质粒构建体的形式递送至细胞。通过电穿孔技术将 CRISPR-Cas9...

一体化CRISPR基因组编辑：利用CRISPR-Cas9系统在培养细胞中基于同源定向修复的基因敲入方法

关键词：CRISPR-Cas9，基因敲入，同源定向修复，培养细胞，基因组编辑

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

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基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。...

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

了解CRISPR/Cas9与单链寡核苷酸在人细胞中修复点突变的标准化方法。该技术通过电穿孔递送RNP复合物，实现基因校正并分析靶位点遗传异质性，为基因治疗研究提供可靠框架。

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

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