Name: 三维高频超声对小鼠早期妊娠特征的新应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习使用三维高频超声技术对小鼠早期妊娠进行无创检测与监测的方法。该技术可在不中断妊娠的情况下实现纵向数据采集，为生殖生物学研究提供重要的活体成像工具。

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我们非常感谢 Rong Zhao、Jie Li 和 Yan Ying 的帮助。

这些研究均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经贝勒医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准协议编号为 AN-4203。
1. 超声检查前对妊娠小鼠的准备
<ol>
	<li>定时交配
	<ol>
		<li>将雌鼠与已知具有生育能力的雄鼠在1700之后过夜合笼。无论是否发现阴道栓，均应在次日0700前将雌鼠与雄鼠分离，以确保妊娠日期的准确判定。 
		注：交配后的次日早晨记为受孕后0.5天（d.p.c.）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声检查前准备
	<ol>
		<li>将怀孕小鼠放入密封的麻醉诱导容器中。</li>
		<li>使用异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1&#160;L/min）进行镇静，直至动物失去翻正反射（根据小鼠体型，约需1-2分钟），且除呼吸外无其他自发性活动。</li>
		<li>将镇静后的小鼠仰卧置于鼻罩中，持续给予异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1&#160;L/min）。在动物眼睛上涂抹眼用软膏。</li>
		<li>用棉签将脱毛膏均匀涂抹于整个腹部，范围从胸骨至阴道，并延伸至体侧。</li>
		<li>脱毛膏停留时间不超过3分钟，随后用纸巾清除脱毛膏及毛发。务必确保所有毛发均被清除，因残留毛发会降低图像质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 超声装置的准备
<ol>
	<li>打开换能器。</li>
	<li>将三维电机平台连接到换能器。
	<ol>
		<li>通过将三维电机电缆连接到后侧面板上的三维电机连接器，将其接入三维电机。使用顶部的快速释放杆将三维电机系统连接至成像站的安装系统，并使用底部的快速释放底座固定换能器夹具。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将探头连接至换能器夹具。</li>
</ol>
3. 开始对怀孕小鼠进行成像
<ol>
	<li>将小鼠仰卧位放置于监测平台上。通过鼻罩持续给予异氟烷麻醉剂（1.5–2.5%）和氧气（1&#160;L/min）。用胶带轻轻将四肢固定在平台的心率监测垫上。
	<ol>
		<li>在腹部涂抹1–2 mL超声传导凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手动电机载物台，将超声探头置于下腹部。
	<ol>
		<li>找到膀胱，其应表现为位于阴道开口头侧的充满液体的暗色圆形结构。</li>
		<li>确定膀胱位置后，将探头缓慢向头侧移动，以观察妊娠子宫，其表现为圆柱形结构，并在妊娠部位呈现圆形区域，外观类似串珠。</li>
		<li>确认妊娠子宫后，开始进行二维成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 二维超声成像（图1）
<ol>
	<li>确定妊娠子宫后，从靠近膀胱的妊娠部位开始，缓慢有序地向头侧移动，以确定妊娠部位的数量和位置。</li>
	<li>若观察到肾脏、脾脏或肝脏，则需将探头向尾侧（更靠近膀胱方向）调整，表明当前扫描已过度向头侧偏移。</li>
	<li>以相同方式对侧子宫角进行成像。</li>
	<li>当超声图像位于着床/妊娠部位中心时，冻结图像以便后续分析和测量。 
	注意：图像冻结并保存至后续分析的过程耗时不足一秒。</li>
	<li>使用高回声蜕膜化反应作为标记，测量着床间距。首先手动点击&#34;测量&#34;工具，然后点击某一着床部位的位置；接着将光标拖动至下一个着床部位并点击，绘制一条线段，计算机将自动报告其距离。软件随后会显示该手动测量结果。此步骤非自动化，依赖操作者通过在蜕膜化部位之间绘制线段来标记间距，程序将提供相应的测量数值。</li>
	<li>测量着床大小、孕囊大小以及胎芽大小。</li>
</ol>
5. 胎心率
注意：在胚胎发育第9.5天，应能清晰观察到胎心搏动。
<ol>
	<li>保持探头完全静止，开启脉冲波多普勒，并将其置于可见的心跳位置上。</li>
	<li>记录心脏搏动的脉冲信号。 
	注意：除心脏外，本操作还可记录脐带内的搏动信号。</li>
</ol>
6. 三维超声采集
<ol>
	<li>在二维成像中观察到妊娠子宫后，将探头置于预期三维图像的大致中点位置。例如，若对苹果进行三维成像，探头初始应放置在预测苹果果核所在的位置（即物体的中心）。</li>
	<li>当探头位于目标图像的中间位置时，进行三维数据采集。三维电机装置将分步或逐帧跨越子宫移动此距离，以完整捕获研究者希望观察的全部结构。</li>
	<li>在完成实时超声检查前，确认目标结构已完全包含在三维扫描范围内。保存此三维数据以供后续后处理分析。由经验丰富的操作者完成二维和三维超声采集的总时间约为10至20分钟。</li>
</ol>
7. 三维重建后处理（图2）
<ol>
	<li>加载用于三维图像处理的所需数据。</li>
	<li>选择 &#34;平行法与旋转法&#34;，这会将所有3D图像帧加载到一个3-D中 &#34;盒子&#34; 用户将逐帧追踪目标物体。选择步长为 0.08 mL。从图像块的一端开始，逐层滚动浏览，以熟悉该空间内已采集的图像。
	<ol>
		<li>从图像的一端开始，手动描出物体的轮廓。</li>
		<li>滚动至下一个二维图像切片或 &#34;帧&#34; 手动描摹物体的轮廓。</li>
		<li>继续此过程，直至用户完成对所有帧的手动标注/描记。</li>
		<li>点击 &#34;完成&#34; 以获取三维图像和总体积计算结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在左上角选择网格或实心覆盖层，该选项显示为一个箭头。</li>
	<li>根据清晰度需要选择保留或去除超声图像周围的附加信息。每次三维重建可能需要10至20分钟。</li>
</ol>
8. 术后护理
<ol>
	<li>超声检查完成后，关闭麻醉气体，将小鼠从平台上取下，并轻轻擦拭和清洗掉动物身上的任何超声耦合剂。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，俯卧于铺有软垫的区域。监测直至动物清醒并能自主活动。</li>
</ol>

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<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+phospholipase+A2alpha+is+crucial+%5Bcorrection+of+A2alpha+deficiency+is+crucial%5D+for+%27on-time%27+embryo+implantation+that+directs+subsequent+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development.</a> Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).</li>
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<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+in+utero+imaging+of+mouse+embryonic+heart+development+with+40-MHz+echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography.</a> Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).</li>
<li>Franco, N. H., Olsson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+and+the+3Rs%3A+attitudes+to+animal+use+in+biomedical+research+and+the+effect+of+mandatory+training+in+laboratory+animal+science%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science.</a> Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).</li>
<li>Pratap, K., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+training+course+on+laboratory+animal+science%3A+an+initiative+to+implement+the+Three+Rs+of+animal+research+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India.</a> Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).</li>
<li>Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consideration+and+checkboxes%3A+incorporating+ethics+and+science+into+the+3Rs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种三维高频超声（3-D HFUS）成像的新应用展示了在小鼠早期妊娠期间以非侵入性方式成功检测、可视化和表征胚胎着床部位的能力。该技术相较于现有方法具有显著优势，现有方法依赖于终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析。然而需要指出的是，当需要在更高倍数和更细的细胞水平上进行表征，或需要进行基因和蛋白质分析时，组织学方法仍被认为是更优选择。随着越来越多的新小鼠模型表现出着床缺陷和早期妊娠丢失19,20,21,22，这种先进超声技术能够从妊娠5.5天（d.p.c.）起检测早期妊娠，明显优于早期仅能在妊娠中期进行检测的超声方法12,13。此外，该方法可在心脏开始跳动的8.5至9.5 d.p.c.期间即检测到心脏运动23<sup...

复发性早期妊娠丢失是受孕后最常见的并发症之一，影响约1%的备孕夫妇1,2。早期妊娠丢失的潜在机制多种多样：包括胚胎自身异常、母体合并症以及子宫内膜容受性缺陷等1,3,4。由于小鼠具有良好的遗传可操作性，已被广泛用于早期胚胎着床及妊娠过程的研究。此外，小鼠妊娠周期短，并可进行大规模实验，使其在解答人类生殖医学中的关键临床问题方面发挥着日益重要的作用5。然而，目前绝大多数小鼠实验设计仍需在妊娠的不同时间点连续处死大量雌鼠，以定量和分析妊娠期间着床部位的位置、数量、大小及分布模式6,7,8，因而无法在同一动物个体上开展纵向研究。
在临床中，超声是一种可靠且不可或缺的工具，可用于以无创方式监测人类胎儿的存活状况和发育情况9,10,11。近年来，高频超声（HFUS）开始在小鼠中获得有限应用，作为一种监测妊娠期间胎儿存活和生长的方法12,13,14。超声成像技术的最新进展使得三维（3-D）数据可用于动物器官的可视化重建，并进一步监测病理变化15,16,17。该先进成像技术的应用显著提高了检测微小体积变化的能力，减少了个体间差异，并有助于监测病理进程或治疗干预的效果17。尽管该技术的主要用途一直是监测肿瘤小鼠模型中的恶性肿瘤进展15,16，但三维HFUS成像直到最近才被用于定量并监测小鼠子宫内胚胎着床及胎儿发育的动态生长过程18。
本文展示了如何进行高频超声（HFUS）成像，以获取二维和三维数据，进而重建早期妊娠小鼠子宫的结构。我们证实了该新方法在检测早期胚胎着床事件中的实用性，且无需终止妊娠，使研究人员能够以非侵入性的方式收集数据。

<table><tbody><tr><td>VisualSonics Vevo 2100 超声成像平台/设备</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 成像工作站</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>SA-11982</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 超声传导凝胶</td><td>Parker</td><td>#SKU PLI 01-08</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（IsoThesia）100 mL 瓶装</td><td>Henry Shein</td><td>#29404</td><td></td></tr><tr><td>PuraLuben 动物眼科软膏</td><td>Dechra</td><td>#12920060</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用三维高频超声成像对小鼠早期妊娠进行表征的新方法

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

高频超声成像（HFUS）是一种常见的无创方法，用于实时监测人类胎儿在子宫内的发育过程。in utero。小鼠通常被用作in vivo模型来研究胚胎着床及妊娠进展。然而，此类小鼠研究通常需要终止妊娠，才能进行后续的表型分析。为解决这一问题，我们采用高频超声成像数据的三维（3-D）重建技术，以实现对小鼠胚胎着床部位的早期检测及其个体发育进程的表征in utero。通过结合高频超声成像与三维重建及建模技术，我们能够准确量化胚胎着床部位的数量，并利用换能器对C57BL6J/129S妊娠小鼠从交配后5.5天（d.p.c.）至9.5 d.p.c.的发育进程进行连续监测。测量指标包括：着床部位的数量、位置和体积，以及着床部位之间的间距；胚胎存活情况通过心脏活动监测进行评估。在着床后的早期阶段（5.5至8.5 d.p.c.），以网格和实心覆盖形式对妊娠子宫进行三维重建，可直观呈现每个子宫角内正在发育的妊娠结构。随着基因工程小鼠被持续用于表征由子宫功能障碍引起的雌性生殖表型，该方法为在活体条件下检测、量化和表征早期着床事件提供了新途径in vivo。这种三维高频超声成像的新应用展示了在非侵入性条件下成功检测、可视化并表征小鼠早期妊娠中胚胎着床部位的能力。该技术相较于依赖终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析的现有方法，具有显著改进。本文通过视频与文字形式，详细描述如何成功开展小鼠早期妊娠超声检查，以获得可靠且可重复的数据，并重建出子宫形态的网格状与实心三维图像。

如所示 图1高频超声可在妊娠5.5天（d.p.c.）时即检测到着床部位的发育。在6.5 d.p.c.时，利用回声较强的蜕膜化子宫内膜作为着床部位的标志，可对着床部位的数量及其分布间距进行定量分析。随着妊娠进展至7.5 d.p.c.，低回声的孕囊和胎芽亦可清晰识别。
如图2所示，可对小鼠子宫三维重建的完整后处理结果进行可视化观察。在6.5 d.p.c.时，可通过网格和实体叠加两种形式的三维高频超声图像组合提供直观的视觉呈现。另一个示例为7.5 d.p.c.时的图像，展示了另一例子宫的最终复合图像，包含网格与实体叠加模式。
<img alt="胚胎发育阶段，5.5、6.5、7.5 天的超声图像；结构标志物。" clas...

小鼠被广泛用于妊娠生物学的研究。然而，此类研究需要终止妊娠，从而无法进行纵向观察，并且需要使用大量动物。因此，我们描述了一种无创的高频超声成像技术，用于在妊娠小鼠中早期检测和监测着床后的事件。

高频超声成像（HFUS）是一种常见的无创方法，用于实时监测宫内人类胎儿的发育情况。小鼠是……

本超声成像技术的总体目标是检测、监测并表征小鼠的早期妊娠。该方法有助于解答小鼠生殖生物学领域中的关键问题，明确早期小鼠妊娠的生长、发育及存活能力。该技术的主要优势在于，可在不中断小鼠妊娠过程的前提下，对妊娠进行活体表征和表型分析，从而实现数据的纵向连续采集。通常，初次接触该方法的人员在将所有图像调整到同一平面时会遇到困难。这主要是因为超声探头需要进行微小的逐步移动。首先应准备好超声设备。打开换能器，然后将三维电机平台连接到换能器上。接着，将探头固定在换能器夹具上。随后，将小鼠仰卧位放置于监测平台上。通过鼻罩给予麻醉，并轻轻将所有四肢用胶带固定在平台的心率监测垫上。接着，在腹部涂抹约一至两毫升超声传导凝胶。然后，使用手动电机载物台将超声探头置于下腹部。使用超声设备，找到膀胱，其应表现为位于阴道开口头侧、充满液体的暗区圆形结构。确定膀胱位置后，将探头缓慢向头侧移动，以观察妊娠子宫，妊娠子宫应呈现为圆柱形结构，在妊娠部位可见圆形区域。该影像可描述为“如链上串珠”。现在开始进行二维成像。一旦确定妊娠子宫，从靠近膀胱最近的妊娠位置开始，缓慢有序地向头侧移动，以确定所有妊娠位置。保存图像。如果可见肾脏、脾脏或肝脏，则扫描位置过于偏头侧。应重新调整探头位置，使其更靠近膀胱，并保存图像。接下来，以相同方式对侧子宫角进行成像。当超声图像帧位于妊娠或着床部位中心时，冻结图像并保存以供分析。现在或之后，使用保存的图像，以高回声蜕膜化反应作为标记，测量着床位置。手动点击测量工具，然后点击着床部位的位置。然后，将光标拖动至下一个种植部位并再次点击以绘制一条线。软件将显示该线段的长度。测量完所有种植部位后，采用相同方法继续测量孕囊大小和胎芽大小。完成二维成像后，将探头置于目标三维图像的大致中点位置。例如，若以三维方式对一个苹果进行成像，则应将探头置于苹果的核心位置。探头准确定位后，进行三维图像采集。三维电机平台将沿子宫方向以一系列步进或帧的形式移动指定距离。在获取扫描图像时，确保目标结构被完整地采集到扫描范围内。扫描采集完成后，将其载入进行图像处理。选择平行和旋转方法进行处理，这会将所有三维图像帧加载到一个三维数据框中。接下来，设置步长为0.08毫米，然后从图像块的一端开始，逐帧浏览所有图像以熟悉数据。随后，从堆栈的一端开始，手动勾画出感兴趣物体的轮廓。然后，进入下一帧并再次手动勾画物体的轮廓。重复此过程，直至所有帧均完成手动标注。完成后，单击“完成”以获得该物体的三维图像及其体积的计算结果。对于图像，可选择使用网格或实心覆盖。然后选择保留或移除周围的图像信息以提高清晰度。高频超声可在受孕后5.5天时即检测到着床部位的发育情况。利用回声较强的蜕膜化子宫内膜作为着床部位的标志，可在受孕后6.5天量化着床部位的数量及其分布间距。随着妊娠进展至受孕后7.5天，低回声的较暗妊娠囊和胎体均清晰可辨。在受孕后6.5天，对小鼠子宫进行了三维重建，重建结果以网格和实心覆盖两种形式呈现。在受孕后7.5天，三维扫描同样具有重要的揭示意义。观看本视频后，您应能充分掌握如何准确获取二维和三维超声图像，以无创方式评估妊娠情况。对于经验丰富的操作者而言，完成一次二维和三维超声数据采集所需的总时间大约为10至20分钟。进行该操作时，务必注意动作要轻柔且逐步进行。该技术为研究人员探索小鼠正常与异常妊娠表型奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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