Name: 用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记 dna 聚合酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记DNA聚合酶活性，实现单核苷酸水平分析。该方法可精确观察DNA合成步骤，揭示DNA修饰对聚合酶功能的影响机制。

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本工作得到了科学进步研究公司（Cottrell College Scholar Award #22548）和TriLink Biotechnologies公司（ResearchReward Grant #G139）的支持。&#160;

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
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<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
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<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种用于表征DNA聚合酶介导的M-DNA合成的实验方法。通过使用近红外标记的DNA引物，并结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，可实现对寡核苷酸的单核苷酸分辨率，从而精确测量合成产物。这些方法可用于测定酶的总体活性（第2.1节），或测定各个反应步骤的米氏动力学参数（见第2.1步之后的注释）。本实验室近期已应用这些方法，对先前进化获得的酶9以及理性设计改造的酶10进行了表征。
本文所述的检测方法与以往方法的不同之处在于采用了非放射性DNA标记。传统上，由于使用放射性磷标记物可获得高灵敏度，放射性同位素一直被用于追踪DNA合成11,18。然而，放射性标记物的处理成本高昂，且有效期较短，这使得其应用受到限制。本文介绍了使用近红外荧光染料标记DNA的方法，该方法避免了上述缺点。值得注意的是，使用近红外荧光染料时，我们观察到其检测限与放射性标记DNA相当（未发...

DNA聚合酶能够准确高效地进行DNA合成，对维持基因组完整性至关重要。in vivo条件下，DNA聚合酶每秒可合成数百个核苷酸且几乎不发生错误，这一特性也使其成为分子生物学和生物技术中不可或缺的工具。然而，这些特性也限制了其在M-DNA底物中的应用；通常而言，天然DNA聚合酶无法合成许多具有潜在价值的M-DNA底物，这可能是由于生物体内对非标准底物的使用存在强烈的选择压力。许多研究团队已开发出定向进化方法，以获得能够合成M-DNA的突变型DNA聚合酶1a,2,3,4,5；这些研究显著拓展了DNA在生物技术中的应用范围6,7,8。
为了评估突变型DNA聚合酶合成M-DNA的能力，我们9,10以及其他11,12,13 通常使用 体外 DNA聚合酶活性的测定方法在本文中有详细描述。在这些实验中，将DNA聚合酶与标记的引物/模板双链以及核苷三磷酸底物共同孵育，反应产物通过凝胶电泳进行分析。根据具体实验目的，可使用突变型DNA聚合酶、修饰的引物、修饰的模板或修饰的核苷三磷酸，从而实现对突变酶活性的系统性生化评估。
传统上，这些检测方法依赖于5'端放射性标记来追踪DNA合成；最常用的是32P和33P；通常通过T4多核苷酸激酶实现标记11。然而，由于放射性标记物的半衰期有限、成本相对较高，且需要安全处理和处置，我们课题组转而采用合成的5'端近红外荧光染料标记DNA。使用一种成本相对较低的近红外凝胶成像系统，我们观察到其检测灵敏度与先前使用放射性标记的研究相当（未发表结果）。我们成功重现了以往的研究结果9，且未发现所测得的反应速率常数在定量上有显著差异（未发表结果）。
为了分析DNA的大小，从而评估DNA合成的程度，我们采用最初为桑格测序法开发的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法14，该方法早于毛细管电泳技术的出现15。迁移距离或迁移率可用于测定分子量；大尺寸垂直聚丙烯酰胺凝胶可实现单核苷酸分辨率，从而能够对不同长度的DNA寡核苷酸进行定量观察。
总体而言，这些实验是聚合酶表征的可靠方法。由于反应对时间敏感，必须充分准备并谨慎操作，才能获得可重复的结果。此外，尽管聚丙烯酰胺凝胶能够以单核苷酸分辨率高效检测DNA合成以及多种其他DNA修饰反应，但其技术难度较高。本方案有望帮助使用者开展这些实验，并避免最常见的错误。

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化牛血清白蛋白</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（即 DTT）</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（即 EDTA）（0.5 M 溶液）</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>橙色 G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs（核糖核苷三磷酸）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs（其他所有修饰核苷三磷酸）</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>引物 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>定制合成</td><td>我们使用 IR700 染料，可通过定制合成获得。我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5&amp;rsquo;-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>模板 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>定制合成</td><td>我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5&amp;rsquo;-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>含 38.67% 丙烯酰胺和 1.33% 双丙烯酰胺</td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA（TBE）固体</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>超纯尿素</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>凝胶封边胶带</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>大号白色弹簧夹（聚丙烯材质）</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 间隔垫片</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33×42 带缺口玻璃板组件</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>楔形板分离器</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳用梳子</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>我们使用默克 Millipore 公司的 Milli-Q 系统制备</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶</td><td></td><td></td><td>我们实验室依据已发表的方案自行制备</td></tr></tbody></table>

利用近红外荧光标记dna并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的dna聚合酶活性检测

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

对于任何酶而言，均需要可靠的定量方法来表征天然酶和工程酶的性质。对于DNA聚合酶，DNA合成活性可通过以下方法进行表征： 体外 DNA合成测定结合聚丙烯酰胺凝胶电泳。该实验的目的是定量检测天然DNA和修饰DNA（M-DNA）的合成情况。这些方法特别适用于分辨具有单核苷酸分辨率的寡核苷酸，从而能够观察酶促寡核苷酸合成过程中的各个独立步骤。这些技术已被应用于评估多种生物化学与生物物理特性，例如测定DNA合成各步骤的稳态速率常数、DNA合成错误率以及DNA结合亲和力。通过使用包括但不限于修饰核苷三磷酸（NTP）、M-DNA和/或突变型DNA聚合酶在内的修饰组分，可有效评估底物-DNA聚合酶配对的相对效能。本文详细描述了该测定方法本身，包括为适应非传统引物DNA标记策略（如近红外荧光标记DNA）所需进行的调整。此外，我们还详述了聚丙烯酰胺凝胶灌制与电泳过程中的关键技术步骤，这些步骤通常具有较高的技术难度。

成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果如图所示，包括对总体活性的定性表征（见第2.1节，图1）和稳态动力学分析（见第2.1节末尾注释，图2）。同时展示了一个不成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果（图3）。
请注意，不使用任何 commercially available ladder 或分子标记物。偶尔我们会使用已知的聚合酶-底物组合来制备分子标记物；但需要注意的是，不同的修饰核苷酸具有截然不同的电泳迁移率，因此对长度相同但核苷酸结构不同的寡核苷酸进行比较是不恰当的。
<img alt="显示具有不同长度DNA片段（30nt、24nt、23nt）的酶活性的凝胶电泳结果。" ...

本方案通过凝胶电泳和凝胶成像观察近红外荧光标记DNA的变化，描述了DNA聚合酶合成修饰DNA的表征方法。丙烯酰胺凝胶可用于高分辨率成像短核酸片段的分离，这些片段根据大小不同而以不同速率迁移。

利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测

对于任何酶而言，均需要可靠的定量方法来表征天然酶和工程酶。对于DNA聚合酶而言，DNA合成...

本实验的总体目标是在单个核苷酸水平上分析DNA聚合酶的活性。该方法有助于回答DNA聚合酶研究领域中的关键问题，例如DNA合成的哪些特定步骤受到DNA修饰的限制。该技术的主要优势在于能够观察到单个核苷酸的变化，从而精确监测聚合酶的活性。进行该实验操作时，重要的是要提前规划，因为许多步骤对时间较为敏感。开始实验前，首先按照文本方案中的说明准备好缓冲液、DNA 双链混合物以及蛋白质稀释液。接下来，将干浴器的温度设置为 50 摄氏度。取 24 微升退火双链混合物加入含有 25 微升 2× dNTPs 的微量离心管中。随后，取 9.8 微升该混合物转移至含有 20 微升橙色淬灭缓冲液的微量离心管中，以制备无酶对照样本。然后向双链dNTP混合物中加入0.8微升50倍浓度的酶。使用大容量移液器充分混匀溶液。在干浴中孵育。通过移取各反应混合物 10 微升并加入含有 20 微升淬灭缓冲液橙色的微量离心管中，以终止反应。按照文字方案中所述配制用于凝胶电泳的丙烯酰胺混合液。接着，用肥皂和水彻底清洗两块 33 厘米 × 42 厘米的凝胶板。用纸巾将每块板的表面擦干，然后使用精密擦拭纸擦干其余区域。用70%乙醇冲洗已擦干的板，再用精密擦拭游戏副本擦拭每块板。之后，戴手套的手在去离子水中冲洗，然后用湿润的手指轻轻润湿一些0.75毫米的间隔垫片。将垫片放置在带缺口平板的边缘。使用实验擦拭纸清理可能溅到平板上的水。将平板合在一起，然后使用凝胶封带覆盖底部和侧面，顶部保持不封。确保胶带对齐且密封严实。使用剃刀裁剪胶带两端。然后在凝胶底部再添加一层胶带。配制好试剂后，取一个喷瓶并取下尖头漏斗。使用量筒加入125毫升水，然后用永久性记号笔在瓶外标记液面高度。弃去水。接下来，按照文本方案中的说明，在水槽旁设置软木环和板夹三明治结构。将空的挤压瓶以及配制好的APS和TEMED溶液放在水槽的另一侧。将所需孔数的制胶梳和四个夹子放置在附近。然后向压液瓶中加入20%丙烯酰胺凝胶溶液，直至达到标记刻度。同时，向聚丙烯酰胺凝胶溶液中加入120 µL TEMED和600 µL APS。迅速加入 600 微升 APS。立即盖紧冲洗瓶盖，通过旋转混匀。接着将夹心式板放入水槽中。开始倾注，对瓶子施加缓慢而稳定的压力，以确保凝胶溶液平稳流出。倾注至凝胶达到刻槽区域并从刻槽边缘略微溢出为止。倾斜玻璃板以去除任何气泡。然后将梳子插入胶板夹心中，将夹子固定在梳子上，使其下压，以确保各加样孔分布均匀。迅速将喷瓶中剩余的凝胶溶液弃至适当的废液容器中。用去离子水通过喷嘴冲洗瓶内三次以清洁瓶子。开始时，先从板夹心中移除所有长尾夹。使用剃刀切割并移除凝胶胶带边缘部分。用纸巾和水擦拭玻璃表面，尽可能清除聚合后的凝胶残留物。使用剃刀沿边缘刮去任何剩余的凝胶。随后从两侧均匀地推动加样孔梳子以将其取出。使用剃刀切去板夹顶部多余的凝胶，然后沿板的缺口边缘切开。用注射器吸取去离子水冲洗加样孔，以去除任何碎屑。确保每个孔都能注满水，且未被多余的凝固凝胶堵塞。接下来，将制胶夹芯放入装置中，使长玻璃板朝外，缺口一侧朝内。用夹子将制胶夹芯与装置附带的铝板固定在一起。在板外侧添加额外的夹子以促进均匀运行。加入TBE缓冲液，用量以刚好覆盖底部凹槽和顶部加样孔为宜。以50瓦功率进行凝胶电泳，运行20分钟以预热玻璃板。使用注射器和TBE缓冲液清洗加样孔。重复用注射器冲洗数次，以确保去除加样孔中残留的所有缓冲盐。接下来，按照文本方案中所述设置两侧最外侧的加样孔。在凝胶的相应加样孔中加入3微升含溴酚蓝的95%甲酰胺溶液。加载所有样品，静置1分钟。连接电泳装置与电源后，将功率设定在50至55瓦之间。运行凝胶电泳约三小时，或直至溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶长度的三分之二以上。随后，按照文本方案中所述方法对凝胶进行成像。本研究建立了一种检测方法，用于表征DNA聚合酶介导的修饰DNA合成过程。成功的定性表征整体活性应显示出清晰且规则的单一条带。活性的判断依据包括产物的长度以及被标记引物转化为较大产物的比例。由此可见，E6 和 E5 是活性最高的酶，而 E4 和 E1 的活性最低。利用这些方法还可以进行基于稳态动力学的定量分析。由于仅合成 N 和 N+1 产物，因此可以成功地对单一反应事件进行定量。此处的基本方法也可用于研究多种除聚合酶以外的 DNA 或 RNA 修饰酶。

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Biochemistry

生物化学

用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记 dna 聚合酶活性

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本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。...

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

学习使用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记DNA聚合酶活性，实现单核苷酸水平分析。该方法可精确观察DNA合成步骤，揭示DNA修饰对聚合酶功能的影响机制。

利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测

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