Name: 用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记 dna 聚合酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记DNA聚合酶活性，实现单核苷酸水平分析。该方法可精确观察DNA合成步骤，揭示DNA修饰对聚合酶功能的影响机制。

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本工作得到了科学进步研究公司（Cottrell College Scholar Award #22548）和TriLink Biotechnologies公司（ResearchReward Grant #G139）的支持。&#160;

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
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<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种用于表征DNA聚合酶介导的M-DNA合成的实验方法。通过使用近红外标记的DNA引物，并结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，可实现对寡核苷酸的单核苷酸分辨率，从而精确测量合成产物。这些方法可用于测定酶的总体活性（第2.1节），或测定各个反应步骤的米氏动力学参数（见第2.1步之后的注释）。本实验室近期已应用这些方法，对先前进化获得的酶9以及理性设计改造的酶10进行了表征。
本文所述的检测方法与以往方法的不同之处在于采用了非放射性DNA标记。传统上，由于使用放射性磷标记物可获得高灵敏度，放射性同位素一直被用于追踪DNA合成11,18。然而，放射性标记物的处理成本高昂，且有效期较短，这使得其应用受到限制。本文介绍了使用近红外荧光染料标记DNA的方法，该方法避免了上述缺点。值得注意的是，使用近红外荧光染料时，我们观察到其检测限与放射性标记DNA相当（未发...

DNA聚合酶能够准确高效地进行DNA合成，对维持基因组完整性至关重要。in vivo条件下，DNA聚合酶每秒可合成数百个核苷酸且几乎不发生错误，这一特性也使其成为分子生物学和生物技术中不可或缺的工具。然而，这些特性也限制了其在M-DNA底物中的应用；通常而言，天然DNA聚合酶无法合成许多具有潜在价值的M-DNA底物，这可能是由于生物体内对非标准底物的使用存在强烈的选择压力。许多研究团队已开发出定向进化方法，以获得能够合成M-DNA的突变型DNA聚合酶1a,2,3,4,5；这些研究显著拓展了DNA在生物技术中的应用范围6,7,8。
为了评估突变型DNA聚合酶合成M-DNA的能力，我们9,10以及其他11,12,13 通常使用 体外 DNA聚合酶活性的测定方法在本文中有详细描述。在这些实验中，将DNA聚合酶与标记的引物/模板双链以及核苷三磷酸底物共同孵育，反应产物通过凝胶电泳进行分析。根据具体实验目的，可使用突变型DNA聚合酶、修饰的引物、修饰的模板或修饰的核苷三磷酸，从而实现对突变酶活性的系统性生化评估。
传统上，这些检测方法依赖于5'端放射性标记来追踪DNA合成；最常用的是32P和33P；通常通过T4多核苷酸激酶实现标记11。然而，由于放射性标记物的半衰期有限、成本相对较高，且需要安全处理和处置，我们课题组转而采用合成的5'端近红外荧光染料标记DNA。使用一种成本相对较低的近红外凝胶成像系统，我们观察到其检测灵敏度与先前使用放射性标记的研究相当（未发表结果）。我们成功重现了以往的研究结果9，且未发现所测得的反应速率常数在定量上有显著差异（未发表结果）。
为了分析DNA的大小，从而评估DNA合成的程度，我们采用最初为桑格测序法开发的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法14，该方法早于毛细管电泳技术的出现15。迁移距离或迁移率可用于测定分子量；大尺寸垂直聚丙烯酰胺凝胶可实现单核苷酸分辨率，从而能够对不同长度的DNA寡核苷酸进行定量观察。
总体而言，这些实验是聚合酶表征的可靠方法。由于反应对时间敏感，必须充分准备并谨慎操作，才能获得可重复的结果。此外，尽管聚丙烯酰胺凝胶能够以单核苷酸分辨率高效检测DNA合成以及多种其他DNA修饰反应，但其技术难度较高。本方案有望帮助使用者开展这些实验，并避免最常见的错误。

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化牛血清白蛋白</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（即 DTT）</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（即 EDTA）（0.5 M 溶液）</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>橙色 G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs（核糖核苷三磷酸）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs（其他所有修饰核苷三磷酸）</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>引物 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>定制合成</td><td>我们使用 IR700 染料，可通过定制合成获得。我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5&amp;rsquo;-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>模板 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>定制合成</td><td>我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5&amp;rsquo;-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>含 38.67% 丙烯酰胺和 1.33% 双丙烯酰胺</td></tr><tr><td>Tris/硼酸/EDTA（TBE）固体</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>超纯尿素</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>凝胶封边胶带</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>大号白色弹簧夹（聚丙烯材质）</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 间隔垫片</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33×42 带缺口玻璃板组件</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>楔形板分离器</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳用梳子</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>我们使用默克 Millipore 公司的 Milli-Q 系统制备</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶</td><td></td><td></td><td>我们实验室依据已发表的方案自行制备</td></tr></tbody></table>

利用近红外荧光标记dna并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的dna聚合酶活性检测

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

对于任何酶而言，均需要可靠的定量方法来表征天然酶和工程酶的性质。对于DNA聚合酶，DNA合成活性可通过以下方法进行表征： 体外 DNA合成测定结合聚丙烯酰胺凝胶电泳。该实验的目的是定量检测天然DNA和修饰DNA（M-DNA）的合成情况。这些方法特别适用于分辨具有单核苷酸分辨率的寡核苷酸，从而能够观察酶促寡核苷酸合成过程中的各个独立步骤。这些技术已被应用于评估多种生物化学与生物物理特性，例如测定DNA合成各步骤的稳态速率常数、DNA合成错误率以及DNA结合亲和力。通过使用包括但不限于修饰核苷三磷酸（NTP）、M-DNA和/或突变型DNA聚合酶在内的修饰组分，可有效评估底物-DNA聚合酶配对的相对效能。本文详细描述了该测定方法本身，包括为适应非传统引物DNA标记策略（如近红外荧光标记DNA）所需进行的调整。此外，我们还详述了聚丙烯酰胺凝胶灌制与电泳过程中的关键技术步骤，这些步骤通常具有较高的技术难度。

成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果如图所示，包括对总体活性的定性表征（见第2.1节，图1）和稳态动力学分析（见第2.1节末尾注释，图2）。同时展示了一个不成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果（图3）。
请注意，不使用任何 commercially available ladder 或分子标记物。偶尔我们会使用已知的聚合酶-底物组合来制备分子标记物；但需要注意的是，不同的修饰核苷酸具有截然不同的电泳迁移率，因此对长度相同但核苷酸结构不同的寡核苷酸进行比较是不恰当的。
<img alt="显示具有不同长度DNA片段（30nt、24nt、23nt）的酶活性的凝胶电泳结果。" ...

本方案通过凝胶电泳和凝胶成像观察近红外荧光标记DNA的变化，描述了DNA聚合酶合成修饰DNA的表征方法。丙烯酰胺凝胶可用于高分辨率成像短核酸片段的分离，这些片段根据大小不同而以不同速率迁移。

利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测

对于任何酶而言，均需要可靠的定量方法来表征天然酶和工程酶。对于DNA聚合酶而言，DNA合成...

本实验的总体目标是在单个核苷酸水平上分析DNA聚合酶的活性。该方法有助于回答DNA聚合酶研究领域中的关键问题，例如DNA合成的哪些特定步骤受到DNA修饰的限制。该技术的主要优势在于能够观察到单个核苷酸的变化，从而精确监测聚合酶的活性。进行该实验操作时，重要的是要提前规划，因为许多步骤对时间较为敏感。开始实验前，首先按照文本方案中的说明准备好缓冲液、DNA 双链混合物以及蛋白质稀释液。接下来，将干浴器的温度设置为 50 摄氏度。取 24 微升退火双链混合物加入含有 25 微升 2× dNTPs 的微量离心管中。随后，取 9.8 微升该混合物转移至含有 20 微升橙色淬灭缓冲液的微量离心管中，以制备无酶对照样本。然后向双链dNTP混合物中加入0.8微升50倍浓度的酶。使用大容量移液器充分混匀溶液。在干浴中孵育。通过移取各反应混合物 10 微升并加入含有 20 微升淬灭缓冲液橙色的微量离心管中，以终止反应。按照文字方案中所述配制用于凝胶电泳的丙烯酰胺混合液。接着，用肥皂和水彻底清洗两块 33 厘米 × 42 厘米的凝胶板。用纸巾将每块板的表面擦干，然后使用精密擦拭纸擦干其余区域。用70%乙醇冲洗已擦干的板，再用精密擦拭游戏副本擦拭每块板。之后，戴手套的手在去离子水中冲洗，然后用湿润的手指轻轻润湿一些0.75毫米的间隔垫片。将垫片放置在带缺口平板的边缘。使用实验擦拭纸清理可能溅到平板上的水。将平板合在一起，然后使用凝胶封带覆盖底部和侧面，顶部保持不封。确保胶带对齐且密封严实。使用剃刀裁剪胶带两端。然后在凝胶底部再添加一层胶带。配制好试剂后，取一个喷瓶并取下尖头漏斗。使用量筒加入125毫升水，然后用永久性记号笔在瓶外标记液面高度。弃去水。接下来，按照文本方案中的说明，在水槽旁设置软木环和板夹三明治结构。将空的挤压瓶以及配制好的APS和TEMED溶液放在水槽的另一侧。将所需孔数的制胶梳和四个夹子放置在附近。然后向压液瓶中加入20%丙烯酰胺凝胶溶液，直至达到标记刻度。同时，向聚丙烯酰胺凝胶溶液中加入120 µL TEMED和600 µL APS。迅速加入 600 微升 APS。立即盖紧冲洗瓶盖，通过旋转混匀。接着将夹心式板放入水槽中。开始倾注，对瓶子施加缓慢而稳定的压力，以确保凝胶溶液平稳流出。倾注至凝胶达到刻槽区域并从刻槽边缘略微溢出为止。倾斜玻璃板以去除任何气泡。然后将梳子插入胶板夹心中，将夹子固定在梳子上，使其下压，以确保各加样孔分布均匀。迅速将喷瓶中剩余的凝胶溶液弃至适当的废液容器中。用去离子水通过喷嘴冲洗瓶内三次以清洁瓶子。开始时，先从板夹心中移除所有长尾夹。使用剃刀切割并移除凝胶胶带边缘部分。用纸巾和水擦拭玻璃表面，尽可能清除聚合后的凝胶残留物。使用剃刀沿边缘刮去任何剩余的凝胶。随后从两侧均匀地推动加样孔梳子以将其取出。使用剃刀切去板夹顶部多余的凝胶，然后沿板

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