Name: 利用自动 Microbioreactor 技术优化异种蛋白质生产的通用协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解利用Kriging实验设计和自动微生物反应器技术优化微生物培养基的迭代工作流程。该方法通过机器人液体处理和统计分析提高异源蛋白生产效率，适用于多种微生物表达宿主。

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生物经济科学中心的科研活动得到了北莱茵-威斯特法伦州创新、科学与研究部在NRW战略项目BioSC（编号：313/323-400-002 13）框架内的资金支持。作者感谢北莱茵-威斯特法伦州创新、科学与研究部以及杜塞尔多夫海因里希·海涅大学为Lars Freier在CLIB研究生集群工业生物技术项目中提供的奖学金。本研究还获得了Enabling Spaces计划的额外资助。 &#34;亥姆霍兹创新实验室&#34; 德国亥姆霍兹联合会的支持 &#34;微生物生物工艺实验室——一个亥姆霍兹创新实验室&#34;.

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的通用性使其可进行多种调整， 例如，用于研究其他微生物表达宿主9,47,48,49,50,51，或优化目标蛋白的其他特性，如糖基化模式或二硫键。该方案可能还需根据实验室现有设备进行调整。采用微孔板反应器（MBR）系统可提高实验通量，从而显著节省时间。然而，在以MBR系统替代完全自动化且可控的生物反应器时，必须考虑实验结果的可放大性。8,37,52,53采用 DOE 方法和数学建模有助于针对研究目标最大化测量数据的信息含量54 通过高效的实验设计和基于模型的数据解释15.
对方法的修改 
除了本研究中使用的多功能且可扩展的机器人液体处理系统外，还应指出，目前市面上有多种体积较小的液体处理系统，能够执行此类任务，并可放置于层流工作台内。若无自动化移液系统，也可使用单通道和/或多通道移液器通过手动移液的方式实现根据实验设计（DOE）方案配置的不同培养基组合。由于手动操作更容易出错，且需要长时间高度集中注意力，因此建议减少所配置的不同培养基组合的数量。
根据所采用的MBR系统的功能，相应的培养方案会有所不同。例如，若无法在线监测生物量的形成，则可在生长实验结束后测定生物量浓度。结合MBR系统中常见的pH值和溶解氧的在线监测，可准确判断生长饱和状态。原则上，生长实验也可仅在摇床培养箱中的MTP板上进行，无需使用MBR系统。在此情况下，必须确保适当的培养条件：（1）通过采用具有合适几何形状的MTP板，并结合适当的摇床频率和摇动直径，可避免氧限制性培养， 例如，使用96孔或24孔深孔板，分别在3 mm振幅下以1,000 rpm或25 mm振幅下以250 rpm操作。重要的是，可达到的最大氧传质速率越低，主要碳源的浓度应越低。如上所述，在本研究中，采用10 g/L葡萄糖浓度适用于防止所用培养条件下出现氧限制；（2）为进行生物量和产物定量，对MTP培养物的取样应尽量减少。每次将MTP从摇床培养箱中取出时，氧传质会立即中断，可能导致不利的培养条件；（3）作者认为，不建议将MTP读板仪用作培养装置，因为这些设备并非为此目的而设计。例如，其振荡机构仅用于在添加试剂后偶尔混匀微孔板，因此通常缺乏长时间连续振荡（持续数天）所需的耐用性。此外，此类读板仪无法提供微生物培养所需的足够功率输入。在短时间内进行光密度检测需要停止振荡，导致反复出现氧限制阶段。此外，长期培养过程中此类系统中的蒸发作用将扭曲实验结果。关于将MTP用于微生物培养这一出人意料复杂的课题，更多细节请参见所引文献。22,23,24,25,26 以及其中引用的参考文献。
进一步考虑 
为了加快迭代优化步骤，建议仔细选择用于产物定量的分析方法。应优先选择快速且简单的方法，即使以牺牲精确性和准确性为代价，因为迭代实验设计策略能够容忍实验中的不准确性。然而，最终结果必须通过足够精确和准确但可能更复杂的产物定量方法进行验证。通常情况下，在研究初期对研究流程进行仔细评估和决策需要投入精力，但在建立常规方法后，长期来看将获得回报。
强烈建议定义一个参考实验，用于在优化过程中与所有其他实验进行比较。即，通过将所用培养基组分浓度以及测量的输出值除以参考值来进行归一化处理。这样，每个施加的和测量的数值均可被解释为参考值的 x 倍。为考虑不同培养板之间的差异，在每块板上均进行五次参考实验，归一化时采用其测量结果的平均值。
通常无法保证所开发的培养基对其他菌株也是最优的。然而，改良后的培养基很可能也适用于遗传差异较小的表达菌株的培养，例如，在通过诱变研究获得的单个氨基酸替换的酶变体生产中（尽管已有报道指出，即使是单点突变也可能影响细胞代谢和异源表达性能55,56）。在这种情况下，本文所述方案可作为第一步，随后可结合高通量表达筛选方案57。若该方案用于培养基开发并进一步放大至补料分批培养，则应在相应的生物工艺条件下验证优化后的培养基，因为在微尺度下进行的克隆筛选实验表明，不同的补料策略和培养基条件下，表现最优的克隆可能不同52,58。此外，所引入的KriKit36总体上可促进整体生物工艺的优化。最近，该工具的功能已扩展至支持多目标优化40，这对于同时优化上游和下游工艺具有重要意义59,60。

现代重组基因技术使得工业酶能够广泛应用于制药工业、动物饲料、有机化学和食品加工等领域1,2,3。大量生产工业酶是工业生物技术及优化重组蛋白生产的重要课题，需要菌株工程和生物工艺工程的共同支持。为了构建高效工程化生产菌株，目前已开发出多种遗传文库，e.g.，用于实现基因表达平衡4或提高分泌效率5。
谷氨酸棒状杆菌 是工业规模氨基酸的主要生产商6,7 并且是用于分泌型生产重组蛋白的一种具有吸引力的非常规表达宿主8,9分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径均存在于 C. glutamicum 并成功应用于重组蛋白的分泌10在工业规模氨基酸生产方面的生物过程工程领域拥有丰富经验，以及能够将蛋白质分泌至克/升级别。11 以及对大规模培养中常见的生物过程非均一性具有高度稳健性12,13，制备 C. glutamicum 一种有前景的工业规模外源蛋白分泌生产的平台生物。
营养培养基优化已知可提高微生物系统中重组蛋白的产量14,15,16,17 因此，在生物工艺开发中，调整培养基成分是提高最佳生产率的有效步骤18,19,20,21对微量滴定板（MTPs）在微生物培养中应用的深入研究22,23,24 为微生物培养用多通道平板（MTPs）的开发与设计奠定了基础25,26 基于MTP的微生物反应器（MBR）系统及其在线监测与环境控制的开发27,28膜生物反应器（MBR）可显著提高实验培养的通量。此外，MBR系统还可衍生自其他类型的生物反应器。 例如，可用于微生物生物过程优化的鼓泡柱或搅拌槽反应器29,30,31,32.
通常情况下，优化研究受益于提高实验通量，当与实验设计（DOE）方法相结合时，这种优势更为显著，例如可用于评估设计变量之间的相互作用或降低高维搜索空间的复杂性。因此，微孔板反应器（MBR）系统、实验室自动化与实验设计（DOE）的联合应用已被证明是生物技术领域中一种强大的方法8,16,33,34,35。
本文介绍了一种结合了先进实验室自动化、带在线过程监测的膜生物反应器（MBR）技术以及基于克里金法（Kriging）的数据分析与实验设计的培养基优化方案。该克里金方法已集成于一个MATLAB工具箱（“KriKit”）中，可免费下载并使用36。作为应用示例，通过优化CgXII最小培养基的组分，实现了谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）分泌型绿色荧光蛋白（GFP）产量的最大化。选择GFP滴度作为优化目标，是因为其易于定量检测，并且在MBR系统研究中被广泛用作模型蛋白37,38,39。
所示框架分为四个步骤，如图1所示。这些步骤以方框标出，对应于方案的各个部分。第一步（图1A）是明确项目目标并确定所需方法。将实验设计（DOE）方法、膜生物反应器（MBR）技术与实验室自动化相结合，可提高实验通量，但同时也要求强大的数据处理能力。第二步（图1B）旨在识别对优化目标具有显著影响的敏感设计变量（即，培养基组分），从而减少需要关注的设计变量数量。第三步（图1C）包括一个迭代优化过程，用于更详细地研究剩余设计变量与目标之间的函数关系。利用逐步扩展的数据集，采用克里金（Kriging）方法预测未测量点的实验结果。当克里金模型能够以足够精度预测出最优值或平台期时，迭代循环即告终止。第四步（图1D）用于验证结果，首先在已识别的最优区域周围进行进一步的敏感性分析。如果最初被判定为不敏感的组分在最优区域内仍表现为不敏感，则可以合理推断在第三步的迭代优化过程中该结论同样成立。随后，建议通过正交方法（如活性测定或SDS-PAGE）验证优化结果。
本方案的通用性使其能够轻松适配不同的实验室设备、其他表达宿主和目标蛋白，以及进一步的生物工艺变量，如pH值或培养温度。此外，还可根据其他优化研究的范围，选择蛋白质生产速率、比产率或产品质量等其他优化目标。
<img alt="显示优化流程的方案流程图：研究设计、敏感性分析、迭代优化、验证。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 1"> 
图 1：优化研究的工作流程。 四个方框分别对应本方案的四个部分：“研究构思与方法定义”（第1节）、“敏感性分析”（第2节）、“迭代优化”（第3节）和“验证”（第4节）。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>花板</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>在 BioLector 装置中进行培养</td></tr><tr><td>密封膜</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Flowerplate 的无菌密封</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&amp;uuml;lich</td><td>n/a</td><td>免费提供，需安装 MATLAB</td></tr><tr><td>Janus 移液机器人</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>包括 &quot;WinPrep&quot; 软件安装</td></tr><tr><td>12列深孔微孔板</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>培养基母液储存容器</td></tr><tr><td>96孔微孔板，透明，F型底</td><td>格赖纳</td><td>655101</td><td>Bradford 蛋白质测定法</td></tr><tr><td>&amp;micro;清除96孔微孔板，黑色板体，透明F型底</td><td>格赖纳</td><td>655087</td><td>用于无细胞上清液中的荧光测量</td></tr><tr><td>移液器研究&amp;nbsp;以及多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>促进微孔板的手动液体处理</td></tr><tr><td>TruPAG&amp;nbsp;预制胶</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>用于无细胞上清液的 SDS-PAGE 分析</td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. glutamicum&lt;/em&gt; pCGPhoD&lt;sup&gt;Bs&lt;/sup&gt;-绿色荧光蛋白</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>携带 pEKEx2 质粒，表达插入片段为绿色荧光蛋白（GFP）基因与来自枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的 PhoD 信号肽的融合序列。该质粒提供卡那霉素抗性。由 Meissner 等人描述并发表。&lt;em&gt; &lt;/em&gt;&lt;em&gt;应用微生物学与生物技术&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;76&lt;/strong&gt; (3), 633&amp;ndash;42 (2007)</td></tr></tbody></table>

利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的通用方案

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

在利用微生物生产细胞工厂的工业生物技术领域中，一个核心业务是菌株工程与生物工艺条件优化的迭代过程。其中一个重要的方面是培养基的改进，以为目标产物的微生物合成提供最佳环境。众所周知，培养基的组成会显著影响整个生物工艺的性能。营养培养基的优化已被证实可提高微生物系统中重组蛋白的产量，因此这一步骤在生物工艺开发中具有重要价值。然而，由于定制化设计培养基是一项繁琐的工作，通常需要微型生物反应器技术以实现足够的培养通量、快速的产品分析，以及实验室自动化设备的支持以确保液体操作步骤的可靠性，因此人们往往直接采用文献中的标准培养基配方。此外，还需要先进的数学方法来合理分析测量数据，并高效设计平行实验，以获得最优的信息含量。
本方案的通用性使其能够轻松适配不同的实验室设备、其他表达宿主、目标蛋白以及进一步的生物工艺参数。此外，还可根据其他优化研究的范围，选择蛋白质生产速率、比产量或产品质量等其他优化目标。所采用的克里金工具箱（KriKit）是一种用于实验设计（DOE）的通用工具，有助于实现更全面的生物工艺优化。该工具箱还支持多目标优化，这对于上游和下游工艺的同时优化具有重要意义。

本研究采用所述方案以最大化分泌型绿色荧光蛋白（GFP）的滴度。具体而言，选择培养17小时后的GFP滴度作为优化目标。通过在线荧光检测可实现对产物的简便定量。然而，必须将GFP信号与参照培养实验的数据进行归一化处理，以确保结果的可重复性和可比性。培养基组分的初步筛选是基于理性分析进行的，如第1节所述。实验操作严格按照第1节中的说明进行：整个研究中湿实验流程的参数均保持一致，以确保结果的一致性和可重复性。
如第2节所述，首先进行初步筛选，以鉴定出对后续更详细研究中的优化目标具有显著影响的相关组分。基于MTP的MBR系统可实现48个实验的平行进行。考虑到单个MTP上可进行的最大平行实验数（48）以及培养基组分的总数（11），选择2IV11-6部分因子设计是合适的。该实验设计包含32个实验，可估计所考察的每种培养基组分的主效应。剩余的16个培养孔则用于参考培养基实验的多次重复，以评估实验的可重复性及位置效应。即，除参考实验设置5次重复外，其余每个实验均仅进行一次（无重复）。
表1总结了筛选分析的结果。在所考察的浓度范围内，改变大多数培养基组分对目标未表现出明显影响。其中，NH4+表现出强烈的负效应，而Ca2+和Mg2+则表现出最强的正向趋势。Mg2+在当前浓度范围内的效应不显著，但在更宽的浓度范围内可能具有影响。因此，决定从培养基中去除NH4+，并在后续实验中进一步研究Ca2+和Mg2+的作用。
第3节描述了在改变Ca2+和Mg2+浓度的同时，用于最大化GFP荧光信号的迭代优化过程。在第一次迭代中，验证了NH4+可被省略的假设。Ca2+和Mg2+的浓度范围取自初筛分析结果。NH4+的最低浓度设为零，最高浓度沿用初筛实验中的数值。在后续实验中，各组分浓度在定义的浓度范围内以3 × 3 × 3的网格分布，共进行27组实验。所有培养过程中均包含5份参考培养基的重复样本，作为内部标准，以确保微孔板（MTP）上无位置效应影响。其余16个孔中，NH4+、Ca2+和Mg2+的浓度在给定范围内随机分布。
图5A展示了前几次迭代的结果。坐标轴标签表示原始参考培养基中各组分的浓度，以x Ref表示。蓝色曲面代表使用KriKit软件计算得到的克里金插值结果。每个曲面对应于NH4+的不同相对浓度水平（深蓝色：0倍参考浓度，格纹状：1倍参考浓度，浅蓝色：2倍参考浓度）。该可视化结果表明，省略NH4+更为有利。插值曲面还显示出Mg2+和Ca2+的积极作用，因为所有曲面均随其浓度增加而上升。
根据第一轮迭代的结果，决定将 Ca2+ 和 Mg2+ 的浓度范围扩大，即将最大浓度加倍，并将实验设计窗口移至右上角，见图 5B。在此范围内，浓度以 6 × 6 网格分布，从而确保在整个浓度范围内均匀分布，以获得最优的克里金插值结果。图 5B 显示了基于两轮迭代合并数据所得的克里金插值图（红点和黄方块）。对于 Ca2+ 和 Mg2+，增加其浓度的正向效应持续存在。因此，重复该过程，再次将最大浓度加倍，从而进一步移动实验设计窗口，以探索右上角区域的边界。
图6A 概述了剩余的优化过程。对迭代3之前收集的数据集进行分析，揭示了Mg对正效应的限制2+, 即，Mg的最适浓度范围2+ 被鉴定出来。因此决定仅对Ca进一步扩大浓度范围2+ （第4轮）。该步骤重复进行两次（第5轮和第6轮），直至观察到GFP信号达到饱和。此饱和现象可归因于所用钙浓度下Ca盐的沉淀。2+，细胞无法获得这些物质。
由于实验结果总会受到噪声干扰，所得到的克里金插值结果会显得不规则，仅通过视觉检查可能会导致错误结论。然而，利用统计学中的z检验可可靠地确定培养基组分达到饱和GFP信号的最优浓度范围，该方法也已集成于KriKit工具包中。z检验直接利用克里金方法提供的内在统计信息，即预测值和预测不确定性。图6B展示了使用KriKit工具包确定并可视化呈现的平台区。KriKit工具包可免费获取36，并附有详细教程，说明如何使用其各项功能。
如果发现超过两个相关组分，三维可视化将达到其极限。KriKit 提供了其他多种可能的可视化方法，例如动画或“筛选图”。如果潜在最优值位于定义的浓度范围内，系统将基于预期改进自动设计新的实验40,46。基于预期改进的实验设计已集成在 KriKit 工具箱中。更详细的信息可参见软件文档。
经过迭代过程后，按照D部分所述对结果进行了验证。通过使用最优培养基组成进行额外的敏感性分析，检验了初始假设的有效性。即，所有初始培养基中关注的组分均被改变，但Ca2+和Mg2+被设定为其最优浓度水平。在本研究中，选择的最优浓度为<img alt="钙离子浓度公式（Ca2+），含可选参数标注，化学教育。" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="方程8"> = 32 × Ref 和 <img alt="Mg2+离子符号；化学符号与电荷表示；化学教育，分子研究。" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="方程9"> = 6.8 × Ref。表2展示了验证筛选的结果。与初始敏感性筛选（参见表1）类似，NH4+仍具有显著的负面影响，其余效应仍然可忽略不计。
由于易于获取，所有实验中均采用培养悬浮液中的GFP荧光信号来定量胞外GFP滴度。为验证结果，将GFP荧光信号与其他检测方法进行了比对。由于GFP通过Tat途径分泌，荧光信号无法区分胞内与胞外GFP。因此，使用基础培养基和优化培养基重复进行了培养实验。除对无细胞培养上清液进行荧光测定外，还通过Bradford法测定蛋白质含量，并通过SDS-PAGE对GFP表达水平的（半）定性改善情况进行可视化分析。15所有测量信号在优化培养基中的培养条件下相较于参考培养基均大约增加了一倍，验证了优化培养基使分泌性能提升了约100%。因此，培养液中GFP的特异性荧光可被视为评估优化目标的一个合适指标。 即细胞外GFP滴度。
<img alt="用于实验分析的化学溶液浓度表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于灵敏度分析的移液体积列表截图。 第一列中的条目为每一行的所有体积分配唯一的标识符；该标识符是液体处理工作站工作台面上目标培养MTP的MTP孔编号，参见图 4C。其余各列编码了需移取的不同溶液（“Sln-01”至“Sln-15”）的体积。每一行的累计体积对应于相应孔的最终培养体积。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验设置和变异分析的移液方案示意图，包含试剂储备容器布局。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图3"> 
图3：液体处理控制软件“WinPREP”的截图。 左侧：按行排列的指令，包括针对每种需移取的储备溶液的转移指令。在接种液添加的最后一条指令之前，插入了一个用户提示，以确保种子培养物能够及时放置于操作台上。右侧：工作台的示意图，包括变异储备液的来源耗材（两个深孔板，每板含12列式孔）、用于剩余储备液、水和接种液的试剂槽，以及用于培养基制备的目标微孔板（MTP）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="液体处理过程的移液操作流程设置与数据分析示意图；工作流程细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 4"> 
图 4：配制储备液移液操作设置的详细截图汇总。（A）Fe 储备液移液的未展开指令。工作台上的源实验耗材及其源孔位由读取框和相应深孔板的红色列标记。目标耗材及目标孔位由目标培养MTP上的蓝色框及蓝色孔标记。（B）此步骤中移液体积分配的详细示例视图（Fe 储备液）。目标孔数量从移液列表中读取，该列表共48行。所有目标孔的Fe储备液分配体积位于移液列表的第4列。注意，移液列表中的第一列为标识符，而非待转移的体积值，参见图 2。（C）目标孔编号的详细说明。移液列表中第#1行所填写的体积将被移液至标记为#1的孔，依此类推。孔#01、#08、#41和#48分别对应于字母数字编码的A01、A08、F01和F08，该编码也直接印制在培养MTP上。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GFP 信号与 Mg²⁺、Ca²⁺ 的关系；三维图与等高线分析；荧光蛋白研究比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="图 5"> 
图 5：第一轮迭代的详细结果。（A）基于第一轮迭代实验数据的克里金插值。红点表示数据集。为便于比较，三种插值曲面叠加显示于同一图表中（深蓝色：0 倍参考值，格纹：1 倍参考值，浅蓝色：2 倍参考值）。该结果的另一种表示方式可参见其他文献15。（B）基于第一轮（红点）和第二轮（黄色方块）实验数据的克里金插值。本图所示部分数据此前已发表15。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验分析中钙-镁浓度与GFP信号等高线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg" data-altupdatedat="1762215414000" data-alt="Figure 6"> 
图6：迭代收集的优化结果示意图。（A）最终Kriging模型预测结果。（B）基于KriKit提供的统计z检验，对最优区域（红色）进行统计识别。方框表示实验的迭代设计与执行的连续步骤。本图所示部分数据此前已发表15。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>标准化系数平均值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2+</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2+</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2+</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2+</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：敏感性分析结果。 系数值表示当各培养基组分浓度从中心值增加到最大值时的平均效应。对于最优实验设计（如标准文献中所述并在此使用），标准差直接代表由于重复参考实验而产生的实验变异。系数值通过最大值（Ca2+组分的0.0422）进行了归一化处理。归一化和绝对系数标准差分别为0.54和0.0226。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>标准化系数平均值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2+</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2+</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2+</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2+</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2+</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：最终敏感性分析结果。 系数值表示当各培养基组分浓度从其中心值增加到最大值时的平均效应。由于采用了最优实验设计，标准偏差仅依赖于使用优化培养基组成时的实验变异。与使用参考培养基相比，实验变异略有增加。系数值通过最大值（组分Mn2+的0.0106）进行归一化处理。归一化系数和绝对系数的标准偏差分别为3.63和0.0385。

本文描述了一种针对微生物培养基进行定制化设计的通用方法。该方法通过结合基于克里金法（Kriging）的实验设计与微生物反应器技术，实现足够的培养通量，并借助实验室自动化机器人技术提高液体处理和培养基制备的可靠性与速度，从而实现迭代式工作流程。

工业生物技术中利用微生物生产细胞工厂的核心业务是菌株工程与优化的迭代过程……

本迭代工作流程的总体目标是将基于克里金法（Kriging）的实验设计与微型生物反应器技术相结合，以实现足够的培养通量，从而提出一种可定制化设计微生物培养基的通用方法。该方法有助于回答微生物生物工艺开发领域中的关键问题，例如培养基优化、生物工艺条件优化以及菌株表型分析。我们最初产生该方法的想法，源于思考：为小分子代谢物生产而优化的培养基，是否同样适用于异源蛋白的生产。该技术的主要优势在于通过实验与建模的智能结合，显著缩短整体研发周期。本实验操作将由我实验室的博士生Roman Jansen进行演示。首先，按照文本方案中的详细说明，进行研究构思与方法定义。在工作台上，用70%乙醇擦拭深孔板后，在层流罩中干燥，以对用于储存母液的深孔板进行灭菌。通过将工作细胞库中的一个等分试样接种到含有25毫克/升卡那霉素的50毫升BHI培养基中，启动种子培养。将所有必要的实验器具放置在机器人工作台上，并将母液倒入相应的实验器具中。然后，启动培养基制备的自动化工作流程，确保最后一个步骤即接种步骤能够及时完成，以赶上种子培养的开始时间。在接种后约两小时取样，通过测量600纳米处的光密度（O-D-600）来监测菌体生长情况。此后每小时持续监测一次生长情况。大约五小时后，培养物的 600 nm 光密度（O-D-600）达到 3 至 4 之间，可用于接种主培养物。将种子培养物置于液体处理工作站的工作台上，并继续进行培养基制备流程。接种后密封培养用微孔板。接下来，将密封的培养M-T-P放入Biolector设备中，然后启动预设的培养程序。如有必要，根据生物安全规定处理剩余的储备溶液。然后，从机器人工作台接种培养物。在启动液体处理设备的去污程序之前，先清洁可重复使用的实验器具。主培养运行17小时后停止，并按照文本方案中所述处理数据。为了定量测定G-F-P滴度，首先将所有培养孔中的细胞悬液转移至预先标记的反应管中。然后，使用台式离心机以最大速度离心10分钟，以获得无细胞的上清液。接着，将每种无细胞上清液各200微升转移至底部透明的黑色96孔M-T-P板中。使用适当的酶标仪，在488纳米激发波长和520纳米发射波长下读取G-F-P特异性荧光。测定G-F-P荧光后，可直接使用该微孔板，按照Bradford或B-C-A等标准方案测定无细胞上清液中的蛋白质含量。最后，按照文本方案中所述进行数据分析。所展示的实验流程构成一轮实验，其结果用于设计下一轮实验，以期最大程度地提高G-F-P信号。每轮实验中均设置对照实验，用于分析数据的变异性并识别实验中的异常值。该等高线图概括展示了优化过程的整体情况。通过对前三轮迭代收集的数据集进行分析，揭示了镁的促进作用存在局限性，并确定了其最佳浓度范围。因此决定在第四轮迭代中仅进一步扩大钙的浓度范围。在第五轮和第六轮迭代中，该实验程序重复进行了两次，直至观察到绿色荧光蛋白信号达到饱和。这种饱和现象可通过所施加的钙浓度下钙盐的沉淀来解释，此时钙无法被细胞利用。第七次迭代用于更详细地探索边界条件。通过统计学Z检验，可可靠地确定产生饱和G-F-P信号的培养基组分的最佳浓度范围。该图显示了使用Kringing kit工具箱确定并可视化分析出的平台期。Kringing kit工具箱可免费获取，并附有详细教程，说明如何使用其各项功能。本方案具有通用性，可进行多种调整，例如用于研究其他微生物表达宿主，或优化目标蛋白的其他特性，如糖基化模式或二硫键形成。胚胎系统的整合提高了实验通量，从而在以羊膜系统替代完全可控且受环境影响的生物反应器时节省大量时间。然而，必须考虑结果的可扩展性。数学建模与实验设计有助于针对研究目标最大化测量数据的信息含量。

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