Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

该迭代工作流程将基于 Kringing 的实验设计和微生物反应器技术相结合，以实现足够的培养通量，其总体目标是描述一种用于微生物培养培养基定制设计的通用方法。该方法可以帮助回答微生物生物工艺开发领域的关键问题，例如培养培养基的优化、生物工艺条件以及菌株表型分析。当我们问自己，针对小代谢物生产优化的培养基是否也最适合异源蛋白质生产时，我们第一次想到了这种方法。

该技术的主要优点是，它通过智能地结合实验和建模来加快整体开发时间。演示此程序的是我实验室的博士生 Roman Jansen。从文本方案中详述的研究构思和方法定义开始此过程。

70% 乙醇擦拭板，然后在层流罩中干燥，对工作台上的储备液储存深孔板进行消毒。通过接种 50 毫升含有 25 毫克/升卡那霉素的 BHI 培养基和来自工作细胞库的一份等分试样来开始种子培养。将所有必要的实验室器皿放在机器人工作台上，并将储备溶液倒入相应的实验室器皿中。

然后，启动培养基制备的机器人工作流程，以便及时到达最后一步，即接种，以便开始种子培养。大约两小时后对种子培养物进行采样，通过测量 600 纳米或 OD-600 的光密度来监测生长。继续每小时监控增长情况。

大约 5 小时后，培养物在 3 到 4 之间达到 O-D-600，并用于接种主要培养物。将种子培养物放在液体处理器工作台上，并继续培养基制备方案。接种后密封培养微量滴定板。

接下来，将密封的培养物 MTP 放入 Biolector 装置中。然后，启动预定义的培养方案。如有必要，根据生物安全法规处理剩余的储备液。

然后，从机器人工作台上接种培养物。在开始液体处理器去污方案之前清洁可重复使用的实验室器皿。运行 17 小时后停止主培养物，并按照文本方案中的说明处理数据。

为了定量 GFP 滴度，首先将细胞悬液从所有培养孔转移到预标记的反应管中。然后，使用台式离心机以最大速度将细胞悬液离心 10 分钟，以获得无细胞上清液。接下来，将 200 微升每种无细胞上清液转移到底部透明的黑色 96 孔 M-T-P 中。

使用合适的酶标仪在 488 纳米激发波长和 520 纳米发射波长处读取 G-F-P 特异性荧光。测量 GFP 荧光后，微孔板可直接用于通过标准方案（如 Bradford 或 B-C-A 测定）测定游离上清液的蛋白质含量。最后，按照文本协议中的说明进行数据分析。

演示的程序构成一轮实验，结果用于设计更多轮次，以最大程度地预期改善 G-F-P 信号。每轮都放置了参考实验，用于分析数据变异性和检测实验异常值。此等值线图概述了优化过程。

通过第三次迭代对收集到的数据集进行分析，揭示了镁的积极影响的局限性，确定了最佳浓度范围。因此，决定在第四次迭代中进一步扩大仅针对钙的浓度范围。在第五次和第六次迭代中重复该过程两次，直到发现 G-F-P 信号饱和。

这种饱和度可以通过钙盐沉淀来解释，以沉淀施加浓度的钙，而细胞无法获得这些钙。第七次迭代用于更详细地探索边界。饱和 G-F-P 信号的培养基成分的最佳浓度范围可以通过统计 Z 检验可靠地确定。

它显示了使用 Kringing kit 工具箱确定和可视化的已识别平台。Kringing 套件工具箱是免费提供的，并附带一个详细的教程，解释了如何使用其功能。所提出的方案的通用性质允许各种适应，例如研究其他微生物表达宿主或优化靶蛋白的其他特性，如糖基化模式或二硫键。

Embrion 系统的集成提高了实验通量，从而节省了大量时间当用 amniar 系统替换完全可控和有流的生物反应器时，必须考虑结果的可扩展性。数学建模和实验设计有助于最大限度地提高测量数据相对于研究目标的信息内容。